Introduction
I modsætning til standard 2D kulturer, 3D cellekultur surrogat modeller giver mulighed for undersøgelse af epitelceller opførsel i et fysiologisk relevant kontekst, en ligner et væv. 3D kulturer af brystkirtlen har hjulpet belyse mange aspekter af mælkekirtel udvikling og neoplasi. Men de fleste af de 3D kulturmodeller aktuelt tilgængelige er uegnede til at studere hormonvirkning fordi de humane epiteliale cellelinier anvendes til opgaven mangler hormon receptorekspression 6,7,9.
Heri beskriver vi en 3D-kultur model af det humane bryst epitel, der er egnet til at studere hormonvirkning 12. Denne model anvender det kommercielt tilgængelige hormon-responsive humane bryst- epitelcellelinje, T47D 3,11,13, som oprindeligt blev afledt af en pleural effusion opnået fra en 54-årig kvindelig patient med en infiltrerende duktalt carcinom i brystet. Vi anvender rotte hale collagen type 1 som en matrix. Denne 3D kulture model er passende for studiet af virkningen af de tre vigtigste mammotropic hormoner (estradiol, promegeston (en analog af progesteron), og prolactin) på humane bryst epitelceller. Hormon-induceret epitelial morfologi kan vurderes kvantitativt over tid ved morfometrisk analyse 12.
En passende udsåningstæthed tillader disse 3D-kulturer holdes i 2 uger. På dette tidspunkt, udviklingen af strukturer er tilstrækkeligt til en solid kvantitativ vurdering af hormonvirkning på epithelmorfologi. Geler kan også udtages på tidligere tidspunkter for celleproliferation og genekspression analyser. Desuden er denne model er egnet til at afprøve virkningerne af en sekventiel hormonbehandling; fx efter behandling med østradiol i den første uge og udskiftning med andre hormon / kombination af hormoner i den følgende uge. Virkningen af østrogene forbindelser og antiøstrogener, såsom ICI 182.780, kan også Studøde ved hjælp af denne 3D kulturmodel 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser
- Opløs det syntetiske progestagen promegeston (R5020) og 17-β-østradiol (E2) i ethanol for at gøre 10 -3 M stamopløsninger. Opløs prolactin i destilleret deioniseret vand til fremstilling af en 1 mg / ml stamopløsning. Opløs antiøstrogenet ICI 182.780 i DMSO for at gøre en 10 -2 M stamopløsning. Gemme disse opløsninger ved -20 ° C i op til 6 måneder.
- Charcoal dextran (CD) strippet serum og CDFBS medium:
- Heat-inaktivere kalvefosterserum (FBS) i en 57 ° C vandbad i 30 min.
Bemærk: Brug kun afsyret glasvarer i resten af denne protokol. - Beregne mængden af trækul nødvendig. Anvendelse af 10% mere volumen end mængden af serum for at kompensere for forskydningen forårsaget af trækul, vejer 5% vægt / volumen aktivt kul.
- Vask trækul to gange med kold deioniseret destilleret vand med samme volumen som mængden af serum. For hver vask centrifuge ved 50 x g i 2 min for at pelletere trækul. Fjern vandet mellem vaske. Tilsæt 0,5% vægt / volumen Dextran T-70 til den sidste trækul pellet. Resuspender med destilleret, deioniseret vand og centrifugeres ved 100 xg i 5 min. Aspirere vand.
- Tilsæt passende mængde serum til pillen og re-suspendere trækul dextran pillen ind i serum. Inkuber, mens rulning (6 RPM) ved 37 * C i 60 minutter. Centrifuger ved 2.000 xg i 20 min. Hvis supernatant synes uklar, gentag centrifugering; dog kan serum ikke være helt klar på nuværende tidspunkt, men vil blive slettet under filtrering.
- Der filtreres gennem et 0,80 mikron filter og derefter igen gennem et 0,45 mikron filter til at fjerne større partikler. Endelig filter-sterilisere med et 0,20 mikrometer filter. Store filtreret CDFBS i glasrør eller T-25 dyrkningskolber ved -20 * C.
- Charcoal Dextran Stripped føtalt bovint-holdige medier (CDFBS medier): bland 375 ml phenolrødt-frit DMEM og 125 ml DMEM/ F-12. Fjern 37,5 ml og erstatte det med det samme volumen af trækul Dextran Stripped føtalt kalveserum. Tilsæt 10 6 U / ml penicillin og L-glutamin til en 2 mM slutkoncentration. Den resulterende medier er 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% Charcoal dextran strippet-FBS, 2 mM L-glutamin og 10 6 U / ml penicillin.
- Heat-inaktivere kalvefosterserum (FBS) i en 57 ° C vandbad i 30 min.
- Forbered 10X PBS, 1 N NaOH og destilleret deioniseret vand. Forbered nok volumen af hver efter mængden af kollagen løsning nødvendig. Sterilisere alle løsninger ved filtrering. Opbevar 10x PBS og sterilt destilleret deioniseret vand ved 4 ° C i op til 1 måned. Opbevar ikke 1N NaOH-opløsning.
- Forbered kollagen løsning til en 1 mg / ml endelig koncentration i henhold til protokollen for "Alternativ Geldannelse Procedure for Collagen I, Rat hale" fra producenten. Hver gel er fremstillet af 1,5 ml collagen opløsning. For eksempel forberede 18,5 ml (0,5 ml for at tage højde for tab under pipettering) af collagen-opløsning for at forberede12 geler. Brug kollagenopløsningen straks eller holde på is i op til 2-3 timer.
- Carmine Alum farvestof:
- Kombiner 1 g Carmine og 2,5 g Aluminum kaliumsulfat i 500 ml destilleret vand. Kog under omrøring i 20 min. Watch omhyggeligt for at undgå koger over. Juster endelige volumen tilbage til 500 ml med yderligere destilleret vand.
- Tilføj et krystal af thymol for antimikrobiel aktivitet og dække flaske med aluminiumfolie for at beskytte mod lys. Der filtreres gennem et laboratorium grade papir filter før hver brug. Genbrug af carmin løsning for op til tre måneder. Opbevares ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Collagenaseopløsning: opløse collagenase i DMEM / F12-medium i en koncentration på 0,125% vægt / volumen. Må ikke opbevares denne løsning.
2. 3D kultur af T47D Celler i Rat Tail Collagen Type 1 Gels og hormon behandling
Bemærk: holde sterile serologiske pipetter og pipettespidser ved 4 ° C.
- Prepare en enkelt-celle-suspension og udføre en celletælling. Split T47D cellekulturer, før de når 70% sammenløb. Centrifugeres enhed, der indeholder mængden af celler, der er nødvendige. Overvej, at en gel bør indeholde omkring 75.000 T47D celler.
- Ved hjælp af en kold-pipette, resuspender cellepelleten i det passende volumen af kollagen. Overvej, at hver gel består af 1,5 ml collagen. Bland cellerne og kollagen forsigtigt for at undgå at indføre bobler.
- At forhindre virkningen af statisk elektricitet på cellefordeling, børste grænser, toppen og bunden af den 12-brønds plade med en statisk-reducerende børste efter udpakning pladen. For at undgå statisk elektricitet oprustning under kontakt med arbejdsflade af hætten, placere denne plade oven på en anden 12-brønds plade (blank plade), der er også blevet børstet med den statiske-reducerende brush.Gently, hæld 1,5 ml af blandingen i hver brønd af 12-brønds plade.
- Pladen anbringes i en inkubator ved 37 ° C i 30 minutter. Fjern the plade fra inkubatoren og læg den tilbage i hætten.
- Ved hjælp af en P200 steril spids, omhyggeligt frigøre gelen i en blød cirkulær bevægelse fra grænsen af brønden. Gelen bør også løsne sig fra bunden af brønden.
- Fortyndede hormoner i CDFBS medier, der skal tilsættes til brøndene. Brug E2 og R5020 ved et 10 -10 M slutkoncentration og prolactin ved en på 10 -7 M slutkoncentration. Som kontrol bruge CDFBS medier uden hormoner tilføjet men stadig indeholder den højeste mængde af DMSO lig med hormon lagre brugt. Sørg for, at hver brønd indeholder 1,5 ml medier. Placer 3D kulturerne i en 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed vævskulturinkubator. Vedligehold kulturerne i 1 eller 2 uger, ændre medierne hver 2 dage.
3. Gel Behandling for Whole Mounts
- Fjern dyrkningsmedier og tilsæt 1,5 ml PBS til hver brønd.
- Overfør gelen til et dias. Skær gelen i halve ved anvendelse af en kurved kirurgisk kniv. Fortsæt behandling med den ene halvdel og gemme den anden halvdel til histologisk analyse.
- Overfør halv gel til hele montere på et dias. Lad gel tørre i 5 minutter og derefter overføre dias til en Coplin-skål, der indeholder 10% formalin.
Bemærk: alle inkubationer bør ske ved stuetemperatur. - Fix geler i en Coplin-skål på en shaker O / N.
- Wash slides to gange med PBS i 10 min hver på rysteapparat. Overfør objektglas til 70% EtOH; inkuberes i 1 time på rysteapparat. Overfør dias til Carmine Alum O / N.
- Den næste dag, dehydrere lysbilleder på rysteapparat i 70% EtOH, 95% EtOH og 100% EtOH i 1 time hver. Overfør objektglas til xylen to gange i 1 time hver, og holde på rysteapparat. Brug toluen-baseret montering medium at montere geler og 1,5 mm tykke dækglas.
- Undersøg hele underlag under almindeligt lys (mikroskop eller stereoskop). For en mere detaljeret analyse af form og lumen bruger konfokal mikroskopi og visualisere Carmine farvestof med Hene 633 nm laser.
4. Gel Behandling for Behandling for Histologi Analysis
- Overfør den resterende halvdel af gelen til en 20 ml glasbeholder indeholdende 10% formalin og løse på shaker O / N.
- Vask geler to gange med PBS i 10 min hver på rysteapparat. Placer geler i behandling kassetter til paraffin indlejring.
- Overfør geler til 70% EtOH, inkuberes i 1 time og følg med 95% EtOH i 1 time, skifte til frisk 95% EtOH i 1 time, 100% EtOH i 1 time, og skifte til frisk 100% EtOH i 1 time. På dette punkt kan geler opbevares i 100% EtOH O / N ved stuetemperatur eller inkuberet med xylen i 1 time og derefter igen i frisk xylen i 1 time.
- Transferkassetter at paraffin i 1 time ved 60 ° C i vakuum inkubator, gentag med frisk paraffin to gange mere.
- Fyld plast forme med ren paraffin. Åbn kassetten, fjerne gelen og placere den i plast støber indeholder paraffin. Fyld op med paraffin og tilføje toppen af kassette indeholder etiketten på toppen og lad blok cool.
- Fjern plastic mug og § blokken ved hjælp af en mikrotom. Opnå 5 um tykke sektioner for HE farvning og immuncytokemi.
5. Ekstraktion af Celler fra celler fra Geler Brug Collagenase Behandling
- Fjern gel fra brønden og overføre det til en petriskål indeholdende PBS. Skyl gel kortvarigt.
- Overfør gelen til en 15 ml rør indeholdende 2 ml 0,125% collagenase. Pipettere op og ned 4-5 gange for at bryde gelen i små stykker.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 25 min (indtil gelen er opløst, og celler i suspension)
- Tilsæt 2 ml serum suppleret dyrkningsmedium. Saml cellerne ved centrifugering (1000 xg, 5 min), discard supernatant, re-suspendere celler og tælle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 opsummerer proceduren for udarbejdelse af hormon-følsomme 3D kulturer. Epiteliale strukturer observeres i hele underlag af geler dyrket i 2 uger i nærvær af E2 alene og i kombination med andre hormoner. Kun enkelte celler eller grupper af 2-3 celler er til stede, når ingen hormoner tilsættes til dyrkningsmediet (CDFBS medium) (figur 2). Denne betingelse tjener som en negativ kontrol.
Celler i 3D danner kultur strukturer, der varierer i form, størrelse, og lumen tilstedeværelse. Fordelingen af strukturer i gelen typisk heterogen. Som tidligere vist er der generelt flere strukturer langs grænserne af gelen end set i midten 4. På grund af denne rumlige heterogenitet, bør sammenligninger mellem prøver begrænses til tilsvarende regioner i prøver.
De arter, hvorfra kollagen type 1 stammer påvirkninger fænotype ennd kvaliteten af de resulterende epitel strukturer 5. Rottehalecollagen type 1, som anvendt her, blev valgt, da podning i bovint kollagen type 1 resulterede i dannelse af uorganiseret cellegrupper (figur 3).
Kan opnås en detaljeret analyse af de epiteliale strukturer ved hjælp konfokalmikroskopi (figur 4). Resultater E2 behandling i afrundede og aflange strukturer (Figur 4A). Tilstedeværelsen af E2 og prolactin resulterer i flere spirende strukturer (figur 4B), mens tilstedeværelsen af E2 og promegeston resulterer i uregelmæssige strukturer med cellulære fremspring minder om side forgrening (figur 4C). E2 alene og E2 plus prolactin tykkere vævsstrukturer målt ved vækst i z-retningen, og sammenlignet med de observerede i E2 plus promegeston dem.
For at kvantificere celleantal efter hormonbehandling, celler er extracted fra gelen under anvendelse af collagenase behandling. For eksempel ved hjælp af denne metode kan vi undersøge, hvordan antiøstrogen ICI 182.780 inhiberer virkningen af E2 på celleproliferation i 3D kulturer (figur 5).
Figur 1. Procedure til fremstilling af hormon-følsomme 3D kulturer. Kort fortalt er en enkelt-cellesuspension af T47D-celler blandet med rotte hale collagen type 1 og hældt i brønde på en 12-brønds plade. Gelerne får lov til at stivne i 30 minutter i et 37 ° C / 5% CO2 inkubator. Dyrkningsmedium tilsættes, og gelerne frigøres fra brønden. Kulturer kan høstes efter 1 eller 2 uger efter slutpunktet. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2. hele underlag af 3D-kulturer efter farvning med Carmine Alum farvestof (A) Whole mount af en halv gel farvet med carmin alun for at visualisere epiteliale strukturer, et eksempel på ROI for morfologi analyse er angivet med en boks; WM af 3D-kulturer dyrket i 2 uger i (B) CDFBS medier (ikke tilsat hormoner) og (C) CDFBS medium suppleret med E2 og prolaktin. Scale barer er 5000 um (A) og 500 um (B & C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sammenligning af matricer, der anvendes i 3D kultur. (A) Bovine kollagen type 1 resultater i uorganiserede klynger af celler, i modsætning til de organiserede strukturer (B) observeret ved brug af rotte hale collagen type 1. Målestok:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Konfokal billeder af T47D strukturer observeret i 3-D kollagengeler efter 2 uger. Behandling med (A) E2, (B) E2 + prolactin og (C) E2 + R5020. Pile peger på cytoplasmatiske projektioner. Tykkelse af epitelial strukturer var 24, 40 og 20 pm hhv. Målestok:. 40 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. 3D-kulturer behandlet med enten alene E2 eller E2 plus ICI 182.780 til 1 uge. Celletællinger efter celle ekstraktion med collagenase behandling. (A) CDFBS medium, (B) CDFBS medium plus E2 på 1x10 -10 M, (C) ICI 182.780 på 1x10 -8 M plus E2 på 1x10 -10 M og (D) ICI 182.780 på 1x 10-7 M plus E2 på 1x10 -10 M. Barer:. SEM Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi sætter stor pris på de redaktionelle bidrag fra Cheryl Schaeberle. Denne forskning blev støttet af Avon Grants # 02-2009-093 og 02-2011-095, og NIEHS / NIH ES 08.314 til AMS. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Environmental Health Sciences eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
