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Bioengineering

एक हार्मोन जिम्मेदार 3 डी संस्कृति मानव स्तन ग्रंथि उपकला के मॉडल

Published: February 7, 2016 doi: 10.3791/53098
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Integrative Physiology and Pathobiology, Tufts University School of Medicine

Introduction

मानक 2 डी संस्कृतियों के विपरीत, 3 डी सेल संस्कृति किराए की मॉडल एक physiologically प्रासंगिक संदर्भ में, एक एक ऊतक जैसी में उपकला कोशिका व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। स्तन ग्रंथि का 3 डी संस्कृतियों स्तन ग्रंथि विकास और रसौली के कई पहलुओं को स्पष्ट मदद की है। हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध 3D संस्कृति मॉडल की सबसे हार्मोन कार्रवाई अध्ययन करने के लिए, क्योंकि मानव उपकला कोशिका कार्य के लिए इस्तेमाल किया लाइनों हार्मोन रिसेप्टर अभिव्यक्ति 6,7,9 की कमी अनुपयुक्त हैं।

इस के साथ साथ, हम मानव स्तन उपकला हार्मोन कार्रवाई 12 अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है कि एक 3 डी मॉडल संस्कृति का वर्णन है। इस मॉडल को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हार्मोन जिम्मेदार मानव स्तन उपकला कोशिका लाइन, T47D 3,11,13, जो मूल रूप से एक फुफ्फुस स्तन का एक घुसपैठ नलीपरक कार्सिनोमा के साथ एक वर्ष 54 साल महिला रोगी से प्राप्त बहाव से प्राप्त किए गए उपयोग करता है। हम एक मैट्रिक्स के रूप में चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार 1 का उपयोग करें। इस 3 डी पंथUre मॉडल मानव स्तन उपकला कोशिकाओं पर तीन मुख्य mammotropic हार्मोन (एस्ट्राडियोल, promegestone (प्रोजेस्टेरोन के एक एनालॉग), और प्रोलैक्टिन) की कार्रवाई के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। हार्मोन प्रेरित उपकला आकृति विज्ञान morphometric विश्लेषण 12 से समय के साथ मात्रात्मक आकलन किया जा सकता है।

एक उपयुक्त बोने घनत्व इन 3 डी संस्कृतियों 2 सप्ताह के लिए रखा जा सकता है। इस समय तक, संरचनाओं के विकास के उपकला आकृति विज्ञान पर हार्मोन कार्रवाई का एक मजबूत मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए पर्याप्त है। जैल भी सेल प्रसार के लिए पहले के समय बिंदुओं पर काटा जा सकता है और जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है। साथ ही, इस मॉडल एक अनुक्रमिक हार्मोनल उपचार के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है; उदाहरण के लिए, अन्य हार्मोन / अगले हफ्ते के दौरान हार्मोन के संयोजन के साथ पहले सप्ताह के दौरान एस्ट्राडियोल के साथ इलाज और बदलने के बाद। ऐसे आईसीआई 182780 के रूप में estrogenic यौगिकों और Antiestrogens, के प्रभाव, भी विशिष्ट किया जा सकताइस 3 डी संस्कृति मॉडल 12 का उपयोग कर मौत हो गई।

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Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. सिंथेटिक Progestagen promegestone (R5020) और इथेनॉल में 17-β-estradiol (E2) 10 -3 एम स्टॉक समाधान बनाने के लिए भंग। एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए आसुत विआयनीकृत पानी में प्रोलैक्टिन भंग। एक 10 -2 एम स्टॉक समाधान बनाने के लिए DMSO में antiestrogen आईसीआई 182780 भंग। अप करने के लिए 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इन समाधान स्टोर।
  2. लकड़ी का कोयला dextran (सीडी) छीन सीरम और CDFBS मध्यम:
    1. 30 मिनट के लिए एक 57 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)।
      नोट: का प्रयोग करें इस प्रोटोकॉल के शेष के लिए केवल एसिड धोया कांच के बने पदार्थ।
    2. जरूरत का कोयला की राशि की गणना। सीरम की राशि की तुलना में 10% अधिक मात्रा का उपयोग करना, लकड़ी का कोयला की वजह से विस्थापन के लिए क्षतिपूर्ति 5% wt / खंड सक्रिय लकड़ी का कोयला पाउडर वजन करने के लिए।
    3. लकड़ी का कोयला ठंड विआयनीकृत आसुत सीरम की राशि के रूप में एक ही मात्रा का उपयोग कर पानी के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए ग2 मिनट के लिए 50 XG पर entrifuge लकड़ी का कोयला गोली। washes के बीच पानी निकाल दें। 0.5% wt / खंड Dextran टी 70 का कोयला आखिरी गोली में जोड़े। 5 मिनट के लिए 100 XG पर आसुत, विआयनीकृत पानी और सेंट्रीफ्यूज के साथ फिर से निलंबित। पानी aspirate।
    4. सीरम की उचित मात्रा गोली में जोड़ें और सीरम में लकड़ी का कोयला dextran गोली फिर से निलंबित। सेते हैं, 60 मिनट के लिए रोलिंग जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर (6 आरपीएम)। 20 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला बादल दिखाई देता है, centrifugation दोहराने; हालांकि, सीरम इस समय पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हो सकता है, लेकिन छानने के दौरान साफ ​​कर दिया जाएगा।
    5. एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एक 0.80 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर और उसके बाद फिर से बड़े कण बात हटा दें। अंत में, एक 0.20 माइक्रोन फिल्टर के साथ फिल्टर बाँझ। दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर छान ग्लास ट्यूब या टी -25 संस्कृति बोतल में CDFBS।
    6. लकड़ी का कोयला Dextran छीन भ्रूण गोजातीय युक्त मीडिया (CDFBS मीडिया): फिनोल लाल मुक्त DMEM के 375 मिलीग्राम और 125 मिलीलीटर DMEM के मिश्रण/ F-12। 37.5 मिलीलीटर निकालें और लकड़ी का कोयला Dextran छीन भ्रूण गोजातीय सीरम का एक ही मात्रा के साथ बदलें। 10 6 यू / एमएल पेनिसिलिन और एल glutamine एक 2 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें। जिसके परिणामस्वरूप मीडिया में 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7.5% का कोयला dextran छीन FBS, 2 मिमी एल glutamine, और 10 6 यू / एमएल पेनिसिलिन है।
  3. 10X पीबीएस, 1N NaOH और आसुत विआयनीकृत पानी तैयार करें। कोलेजन समाधान की मात्रा की जरूरत के हिसाब से प्रत्येक के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार करें। छानने के द्वारा सभी समाधान जीवाणुरहित। अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x पीबीएस और बाँझ आसुत विआयनीकृत पानी स्टोर। 1N NaOH समाधान की दुकान नहीं है।
  4. निर्माता द्वारा प्रदान "मैं कोलेजन, चूहे की पूंछ के लिए वैकल्पिक जमाना प्रक्रिया" के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार एक 1 मिलीग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता में कोलेजन समाधान तैयार है। प्रत्येक जेल कोलेजन समाधान के 1.5 मिलीलीटर से बना है। उदाहरण के लिए, तैयार करने के लिए कोलेजन समाधान के (pipetting के दौरान नुकसान के लिए खाते में 0.5 मिलीलीटर) 18.5 मिलीलीटर की तैयारी12 जैल। तुरंत कोलेजन समाधान का प्रयोग करें या अप करने के लिए 2-3 घंटे के लिए बर्फ पर पकड़।
  5. कारमाइन फिटकिरी डाई:
    1. आसुत जल में 500 मिलीलीटर गठबंधन 1 ग्राम कारमाइन और 2.5 ग्राम एल्यूमिनियम पोटेशियम सल्फेट। जबकि 20 मिनट के लिए सरगर्मी उबाल लें। ध्यान से देखो पर उबलते से बचने के लिए। अतिरिक्त आसुत जल के साथ वापस 500 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    2. रोगाणुरोधी गतिविधि के लिए thymol की एक क्रिस्टल जोड़ें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर बोतल प्रकाश से बचाने के लिए। प्रत्येक उपयोग करने से पहले एक प्रयोगशाला ग्रेड कागज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। अप करने के लिए तीन महीने के लिए लाल रंग के समाधान का पुन: उपयोग। आरटी पर स्टोर, प्रकाश से रक्षा की।
  6. Collagenase समाधान: डब्ल्यू / वी 0.125% की एकाग्रता में DMEM / F12 माध्यम में कोलैजिनेज़ भंग। इस समाधान की दुकान नहीं है।

2. 3 डी संस्कृति T47D के चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार 1 जैल और हार्मोन उपचार में प्रकोष्ठों

नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ सीरम वैज्ञानिक pipettes और विंदुक युक्तियाँ रहते हैं।

  1. prepaएक एकल कोशिका निलंबन रहे हैं और एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं। विभाजन T47D सेल संस्कृतियों से पहले वे 70% संगम तक पहुँचने। मात्रा की जरूरत है कि कोशिकाओं की राशि शामिल है अपकेंद्रित्र। गौर है कि एक जेल के बारे में 75,000 T47D कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए।
  2. एक ठंडा-पिपेट का प्रयोग, कोलेजन की उचित मात्रा में सेल गोली फिर से निलंबित। विचार करें कि प्रत्येक जेल कोलेजन के 1.5 मिलीलीटर से बना है। बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए धीरे कोशिकाओं और कोलेजन मिक्स।
  3. सेल वितरण पर स्थैतिक बिजली के प्रभाव को रोकने के लिए, प्लेट unwrapping के बाद एक स्थिर कम करने ब्रश के साथ सीमाओं, शीर्ष और 12 अच्छी तरह से थाली के नीचे ब्रश। हुड के काम की सतह के साथ संपर्क के दौरान स्थिर प्रभार buildup से बचने के लिए एक और 12 अच्छी तरह से थाली (खाली प्लेट) भी है कि स्थिर कम करने brush.Gently के साथ ब्रश कर दिया गया है के शीर्ष पर इस थाली जगह, मिक्स के 1.5 मिलीलीटर डालना 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में।
  4. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में प्लेट रखें। वें हटायेइनक्यूबेटर से ई प्लेट और हुड में इसे वापस जगह है।
  5. एक P200 बाँझ टिप का उपयोग करना, ध्यान से अच्छी तरह से की सीमा से एक सज्जन परिपत्र गति में जेल अलग। जेल में भी अच्छी तरह से नीचे से अलग कर देना चाहिए।
  6. CDFBS मीडिया में पतला हार्मोन वेल्स को जोड़ा जाएगा। 10 -7 एम अंतिम एकाग्रता में एक पर एक 10 -10 एम अंतिम एकाग्रता और प्रोलैक्टिन पर E2 और R5020 का प्रयोग करें। नियंत्रण के रूप में जोड़ा हार्मोन लेकिन अभी भी DMSO के सबसे अधिक मात्रा में प्रयोग किया जाता हार्मोन शेयरों के बराबर युक्त बिना CDFBS मीडिया का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के 1.5 मिलीलीटर होता है। अंदर एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% 3 डी संस्कृतियों की जगह आर्द्रता टिशू कल्चर इनक्यूबेटर। , 1 या 2 सप्ताह के लिए संस्कृतियों को बनाए रखने मीडिया बदलते हर 2 दिन।

3. पूरे mounts के लिए जेल प्रसंस्करण

  1. संस्कृति मीडिया निकालें और एक अच्छी तरह से पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. एक स्लाइड के लिए जेल स्थानांतरण। छमाही में जेल काटने के लिए एक वक्र का उपयोगडी सर्जिकल ब्लेड। एक आधे के साथ प्रसंस्करण जारी रखें और ऊतकीय विश्लेषण के लिए अन्य आधा बचा।
  3. आधा जेल स्थानांतरण पूरे एक स्लाइड करने के लिए माउंट के लिए। 5 मिनट के लिए जेल सूख जाने और फिर 10% formalin युक्त एक Coplin जार करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण।
    नोट: सभी incubations आरटी पर किया जाना चाहिए।
  4. एक प्रकार के बरतन हे / एन पर एक Coplin जार में जैल को ठीक करें।
  5. धो प्रकार के बरतन पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइड। स्थानांतरण 70% EtOH करने के लिए स्लाइड; प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। कारमाइन फिटकिरी हे / एन करने के लिए स्थानांतरण स्लाइड।
  6. अगले दिन, 1 घंटा प्रत्येक के लिए 70% EtOH, 95% EtOH और 100% EtOH में एक प्रकार के बरतन पर स्लाइड निर्जलीकरण। स्थानांतरण 1 घंटा प्रत्येक के लिए दो बार xylene और शेखर पर रखने के लिए स्लाइड। जैल और 1.5 मिमी मोटी coverslips माउंट करने के लिए टोल्यूनि आधारित बढ़ते मध्यम का प्रयोग करें।
  7. नियमित रूप से प्रकाश (माइक्रोस्कोप या त्रिविमदर्शी) के तहत पूरे mounts जांच करते हैं। आकार और लुमेन के एक अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें और HeNe 633 एनएम लेजर के साथ कारमाइन डाई कल्पना।

प्रोटोकॉल के विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण के लिए 4. जेल प्रसंस्करण

  1. एक 20 मिलीलीटर गिलास 10% formalin युक्त शीशी के लिए जेल के शेष आधा स्थानांतरण और शेखर हे / एन पर तय कर लो।
  2. प्रकार के बरतन पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार जैल धो लें। आयल embedding के लिए प्रसंस्करण कैसेट में जगह जैल।
  3. 70% EtOH के लिए स्थानांतरण जैल, 1 घंटे के लिए 1 घंटे के लिए सेते हैं और 1 घंटे के लिए 95% EtOH के साथ पालन करें, 1 घंटे के लिए नए सिरे से 95% EtOH को बदलने के लिए, 100% EtOH, और 1 घंटे के लिए ताजा 100% EtOH के लिए बदल जाते हैं। इस बिंदु पर, जैल 100% EtOH हे / एन में आरटी पर ताजा xylene में 1 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है या 1 घंटे के लिए xylene साथ incubated और उसके बाद फिर से।
  4. स्थानांतरण कैसेट वैक्यूम इनक्यूबेटर में 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए आयल, ताजा पैराफिन दो बार अधिक से दोहराएँ।
  5. साफ तेल के साथ प्लास्टिक molds भरें। कैसेट खोलें, जेल को हटाने और प्लास्टिक मोल्ड युक्त पैराफिन में जगह है। आयल के साथ भरने और शीर्ष पर लेबल युक्त कैसेट के शीर्ष जोड़ने और ब्लॉक शांत करते हैं।
  6. प्लास्ट हटायेआईसी मोल्ड और खंड एक microtome का उपयोग कर ब्लॉक। महामहिम धुंधला हो जाना और immunocytochemistry के लिए 5 उम मोटी वर्गों प्राप्त करते हैं।

जैल से कोशिकाओं से कोशिकाओं की 5. निकालना कोलेजिनेस उपचार का उपयोग

  1. अच्छी तरह से जेल निकालें और पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश को हस्तांतरण। कुल्ला जेल संक्षेप।
  2. 0.125% collagenase के 2 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को जेल स्थानांतरण। ऊपर पिपेट और आदेश छोटे टुकड़ों में जेल तोड़ने के नीचे 4-5 बार।
  3. 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं (जब तक जेल भंग कर दिया है और कोशिकाओं निलंबन में हैं)
  4. सीरम पूरक संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें। centrifugation (1000 XG, 5 मिनट), सतह पर तैरनेवाला त्यागें से कोशिकाओं को इकट्ठा, कोशिकाओं को फिर से निलंबित और गिनती।

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Representative Results

चित्रा 1 हार्मोन के प्रति संवेदनशील 3 डी संस्कृतियों की तैयारी के लिए प्रक्रिया का सार। उपकला संरचनाओं अकेले E2 की उपस्थिति में 2 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत और अन्य हार्मोन के साथ संयोजन में जैल के पूरे mounts में मनाया जाता है। जब कोई हार्मोन संस्कृति के माध्यम से (CDFBS मध्यम) (चित्रा 2) को जोड़ रहे हैं केवल एकल कक्षों या 2-3 कोशिकाओं के समूह मौजूद हैं। इस हालत में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

3 डी संस्कृति प्रपत्र संरचनाओं कि आकृति, आकार, और लुमेन उपस्थिति में भिन्नता में कोशिकाओं। जेल में संरचनाओं का वितरण आम तौर पर विषम है। पहले से दिखाया गया है, वहाँ जेल की सीमाओं से केंद्र 4 में देखा-साथ आम तौर पर अधिक संरचनाओं हैं। इस स्थानिक विविधता की वजह से, नमूनों के बीच तुलना नमूने भर में इसी क्षेत्रों के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए।

प्रजातियों से कोलेजन प्रकार 1 प्रभावों ली गई है phenotype एकजिसके परिणामस्वरूप उपकला संरचनाओं 5 एन डी गुणवत्ता। चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार 1, यहाँ के रूप में इस्तेमाल किया, गोजातीय कोलेजन प्रकार 1 में बोने के बाद से चुना गया था बेतरतीब सेल समूह (चित्रा 3) के गठन में हुई।

उपकला संरचनाओं की एक विस्तृत विश्लेषण confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। गोल और लम्बी संरचनाओं (चित्रा 4 ए) में E2 उपचार का परिणाम है। E2 और अधिक नवोदित संरचनाओं (चित्रा 4 बी) में प्रोलैक्टिन परिणामों की उपस्थिति, जबकि पक्ष की याद ताजा अनुमानों सेलुलर शाखाओं में बंटी (चित्रा 4C) के साथ अनियमित संरचनाओं में E2 और promegestone परिणामों की उपस्थिति। जब जेड दिशा में विकास से मापा जाता है, और जब E2 प्लस promegestone में मनाया लोगों की तुलना में अकेले E2 और E2 प्लस प्रोलैक्टिन ऊतक संरचनाओं और अधिक मोटा होना।

आदेश हार्मोन उपचार के बाद सेल संख्या यों में, कोशिकाओं extracte हैंजेल कोलैजिनेज़ उपचार का उपयोग करने से डी। उदाहरण के लिए, इस पद्धति का उपयोग हम अध्ययन कर सकते हैं कि कैसे antiestrogen आईसीआई 182780 (चित्रा 5) 3 डी संस्कृतियों में सेल प्रसार पर E2 के प्रभाव को रोकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. हार्मोन के प्रति संवेदनशील 3 डी संस्कृतियों की तैयारी के लिए प्रक्रिया। संक्षेप में, T47D कोशिकाओं की एक एकल कोशिका निलंबन चूहे की पूंछ कोलेजन टाइप 1 के साथ मिलाया और एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में डाल दिया है। जैल एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए जमाना करने की अनुमति है। संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जाता है और जैल में अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं। संस्कृतियों 1 या 2 सप्ताह के बाद अंत बिंदु के अनुसार काटा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


। कारमाइन फिटकिरी रंग के साथ धुंधला के बाद 3 डी संस्कृतियों के चित्रा 2. पूरे mounts (ए) में आधे से एक जेल कारमाइन फिटकिरी उपकला संरचनाओं, आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए रॉय का एक उदाहरण कल्पना करने के साथ दाग के पूरे माउंट एक बॉक्स से संकेत दिया है; 3 डी संस्कृतियों के WM में 2 सप्ताह (बी) के लिए हो मीडिया (कोई हार्मोन जोड़ा) और (सी) CDFBS मीडिया E2 और प्रोलैक्टिन के साथ पूरक CDFBS। स्केल सलाखों हैं 5000 माइक्रोन (ए) और 500 माइक्रोन (बी एंड सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. 3 डी संस्कृति में इस्तेमाल matrices की तुलना। (ए) Bovine कोलेजन प्रकार की कोशिकाओं के बेतरतीब समूहों के रूप में संगठित संरचनाओं (बी) के लिए विरोध किया 1 में परिणाम मनाया जब चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार 1. स्केल पट्टी का उपयोग:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 के बाद 2 हफ्तों। साथ (ए) E2, (बी) E2 + प्रोलैक्टिन और (सी) E2 + R5020 उपचार 3-डी कोलेजन जैल में मनाया T47D संरचनाओं के Confocal छवियों। तीर cytoplasmic अनुमानों को इंगित करें। उपकला संरचनाओं की मोटाई 24, 40 और 20 माइक्रोन क्रमशः था। स्केल पट्टी:। 40 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5. 3 डी संस्कृतियों कोलैजिनेज़ उपचार का उपयोग सेल निकालने के बाद या तो अकेले E2 के साथ इलाज या E2 प्लस के लिए आईसीआई 182780 1 सप्ताह। सेल मायने रखता है। (ए) CDFBS मध्यम, (बी) के मध्यम प्लस E2 1x10 पर CDFBS -10 एम, (सी) आईसीआई 182780 1x10 -8 एम प्लस E2 पर 1x10 -10 एम और (डी) आईसीआई 182780 पर 1x 10-7 एम प्लस E2 पर 1x10 -10 एम पर बार्स:। SEM यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Acknowledgments

हम बहुत चेरिल Schaeberle द्वारा संपादकीय योगदान की सराहना करते हैं। इस शोध से एवन अनुदान # 02-2009-093 और 02-2011-095, और NIEHS / एनआईएच ते 08,314 एम्स के लिए समर्थन किया था। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well Tissue Culture Plates (Falcon) Fisher Scientific 08-772-29
15 ml polystyrene conical Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Activated Charcoal Sigma C-5510
Carmine Alum Sigma C1022-100G
Collagenase, Type 3 Worthington S0C11784
Confocal Microscope Zeiss LSM510 Equiped with HeNe 633nm laser
Dextran T-70 Abersham/Pharmacia 17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red  Life Technologies 11339-021 Phenol red-free media for hormone use
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Life Technologies 11054-020 Phenol red-free media for hormone use
17-β-Estradiol EMD Millipore 3301 Dissolved in Ethanol
Ethanol Koptec V1001
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30070.03 For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped 
Filters (115 ml) Nalgene 380-0080, 245-0045, 120-0020 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively 
Formalin, 10% Fisher Scientific SF93-20
L-Glutamine (200 mM) Life Technologies 25030-081
ICI 182,780 (fulvestrant) Sigma Aldrich I4409-25MG Dissolved in DMSO
Microtome  Leica RM2155
Tissue embedding media McCormick Scientific 39502004
Penicillin Sigma 7794-10MU Dissolved in 10 ml of distilled deionized water
Permount Fisher Scientific SP15-500
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 Sigma Aldrich P3813-10PAK
Prolactin Sigma Aldrich L4021-50UG Dissolved in distilled deionized water
Promegestone Perkin Elmer NLP004005MG Dissolved in Ethanol
Rat-Tail Collagen  Corning  354236 Lots may contain varying concentrations, note accordingly
Scalpel Miltex 4311
Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor Leica TP1020
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S5881 Prepare 1N NaOH stock
StaticMaster Anti-static brush  Amstat C3500
Stripette Serological Pipettes  Corning  4101
T-25 flasks Corning  430168
Tissue Cassettes Fisher Scientific 15-200-403E
Wheaton Vials, Glass, 20 ml Fisher Scientific 03-341-25D 
Xylene  VWR 95057-822

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 108 T47D कोशिकाओं स्तन ग्रंथि morphogenesis कोलेजन फाइबर एस्ट्रोजन progestins प्रोलैक्टिन
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Speroni, L., Sweeney, M. F.,… More

Speroni, L., Sweeney, M. F., Sonnenschein, C., Soto, A. M. A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium. J. Vis. Exp. (108), e53098, doi:10.3791/53098 (2016).

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