Introduction
I motsetning til standard 2D-kulturer, 3D-cellekultur surrogatmodeller tillater studiet av epitelceller oppførsel i et fysiologisk relevant sammenheng, en likner en vev. 3D kulturer av melkekjertlene har hjulpet belyse mange aspekter av melkekjertlene utvikling og neoplasi. Imidlertid er de fleste av 3D-kultur modeller for tiden er tilgjengelige er uegnet til å studere hormon virkning fordi de humane epitel-cellelinjer som benyttes for oppgaven mangler hormonreseptorer uttrykk 6,7,9.
Heri beskriver vi en 3D-modell kultur av human bryst epitel som er egnet for å studere hormon handling 12. Denne modellen bruker kommersielt tilgjengelige hormon-responsive human bryst epitelcellelinje, T47D 3,11,13, som opprinnelig var avledet fra en pleural effusjon erholdt fra en 54 år gammel kvinnelig pasient med en infiltrerende ductal karsinom av brystet. Vi bruker rottehalecollagen type 1 som en matrise. Denne 3D kulture modell er egnet for å studere virkningen av de tre hoved mammotropic hormoner (østradiol, promegeston (en analog av progesteron), og prolaktin) på humane bryst epitelceller. Hormon-indusert epitelial morfologi kan vurderes kvantitativt over tid ved morfometrisk analyse 12.
En passende seeding tetthet gjør at disse 3D kulturer å bli holdt i 2 uker. På denne tiden er tilstrekkelig for en robust kvantitativ vurdering av hormon virkning på epitelial morfologi utviklingen av strukturer. Geler kan også bli høstet på tidligere tidspunkter for celleproliferasjon og genekspresjon analyser. I tillegg er denne modellen egner seg for å teste effekten av en sekvensiell hormonell behandling; for eksempel etter behandling med estradiol i løpet av den første uken og erstatning med andre hormon / kombinasjon av hormoner i løpet av neste uke. Virkningen av østrogene forbindelser og antiøstrogener, så som ICI 182 780, kan også studøde ved hjelp av denne 3D kulturmodell 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av reagenser
- Oppløs den syntetiske progestagen promegeston (R5020) og 17-β-østradiol (E2) i etanol for å gjøre 10 -3 M stamløsninger. Oppløs prolaktin i destillert deionisert vann for å gi en 1 mg / ml stamløsning. Oppløs den anti-østrogen ICI 182780 i DMSO for å lage en 10 -2 M stamløsning. Oppbevar disse løsningene ved -20 ° C i inntil 6 måneder.
- Charcoal dekstran (CD) strippet serum og CDFBS medium:
- Varme inaktivere føtalt bovint serum (FBS) i et 57 ° C vannbad i 30 min.
Merk: Bruk bare syrevasket glass for resten av denne protokollen. - Beregn hvor mye kull som trengs. Ved anvendelse av 10% større volum enn mengden av serum for å kompensere for forskyvningen forårsaket av trekull, veie 5% vekt / vol aktivt kull.
- Vask trekull to ganger med kaldt avionisert destillert vann ved bruk av samme volum som mengden av serum. For hver vask centrifuge ved 50 x g i 2 min for å pelletere trekull. Fjern vannet mellom hver vask. Tilsett 0,5% vekt / vol Dextran T-70 til den siste pellet trekull. Re-suspendere med destillert, avionisert vann og sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter. Aspirer vannet.
- Tilsett passende volum av serum til pelleten og re-suspendere kull dekstran pellet i serumet. Inkuber, mens ruller (6 RPM), ved 37 ° C i 60 minutter. Sentrifuger ved 2000 xg i 20 min. Hvis overstående er uklar, gjenta sentrifugering; Men serum kan ikke være helt klar på dette tidspunktet, men vil bli fjernet i løpet av filtrering.
- Filtrer gjennom et 0,80 pm filter og deretter på nytt gjennom et 0,45 pm filter for å fjerne større partikler. Til slutt, filter-sterilisere med en 0,20 mikron filter. Oppbevares filtrert CDFBS i glassrør eller T-25 kulturflasker ved -20 ºC.
- Trekull dekstran strippet føtalt bovint-inneholdende medium (CDFBS media): Bland 375 ml fenolrødt-fritt DMEM og 125 ml DMEM/ F-12. Fjern 37,5 ml og erstatte den med det samme volumet av Charcoal Dextran Stripped føtalt bovint serum. Tilsett 10 6 U / ml penicillin og L-glutamin til en 2 mM sluttkonsentrasjon. Den resulterende media er 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% trekull dekstran strippet FBS, 2 mM L-glutamin, og 10 6 U / ml penicillin.
- Varme inaktivere føtalt bovint serum (FBS) i et 57 ° C vannbad i 30 min.
- Forbered 10X PBS, 1 N NaOH og destillert deionisert vann. Fremstille nok volum av hver i henhold til volumet av kollagenløsning nødvendig. Steriliser alle løsninger ved filtrering. Oppbevar 10x PBS og sterilt destillert deionisert vann ved 4 ° C i opp til 1 måned. Ikke oppbevar 1N NaOH løsning.
- Forbered kollagen løsning på en 1 mg / ml sluttkonsentrasjon i henhold til protokollen for "Alternativ Gele Prosedyre for Collagen I, rottehale" gitt av produsenten. Hver gel er laget av 1,5 ml kollagen oppløsning. For eksempel forberede 18,5 ml (0,5 ml til ansvar for tap under pipettering) av kollagen løsning for å forberede12 geler. Bruk kollagen løsning umiddelbart eller holde på is i opptil 2-3 timer.
- Carmine Alum fargestoff:
- Kombiner 1 g Carmine og 2,5 g aluminium-kaliumsulfat i 500 ml destillert vann. Kok under omrøring i 20 min. Se nøye for å unngå å koke over. Justere sluttvolumet tilbake til 500 ml med ytterligere destillert vann.
- Legg til en krystall av tymol for antimikrobiell aktivitet og dekk flaske med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. Filtrer gjennom et laboratorium klasse papirfilter før hver bruk. Gjenbruk av karmin løsning for inntil tre måneder. Lagre ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Kollagenaseoppløsning: oppløse kollagenase i DMEM / F12-medium ved en konsentrasjon på 0,125% vekt / volum. Ikke oppbevar denne løsningen.
2. 3D kultur av T47D celler i Rat Tail Collagen type 1 Geleer og hormonbehandling
Merk: holde sterile serologiske pipetter og pipettespisser ved 4 ° C.
- behandling anleggre en enkeltcellesuspensjon og utføre en celletelling. Split T47D cellekulturer før de når 70% samløpet. Sentrifuger det volum som inneholder den mengden av celler som trengs. Tenk at en gel bør inneholde ca 75.000 T47D celler.
- Ved hjelp av en kald-pipette, re-suspen cellepelleten i det passende volum av kollagen. Anser at hver gel består av 1,5 ml kollagen. Bland celler og kollagen forsiktig for å unngå innføring av luftbobler.
- For å forhindre virkningen av statisk elektrisitet på cellefordeling, børste grenser, toppen og bunnen av den 12-brønns plate med en statisk-reduserende børste etter pakker plate. For å unngå oppbygging av statisk ladning under kontakt med arbeidsflaten av hetten, plasserer denne platen på toppen av en annen 12-brønns plate (blank plate) som også har blitt børstet med den statiske reduserende brush.Gently, hell 1,5 ml av blandingen inn i hver brønn på 12-brønns plate.
- Sett platen i en inkubator ved 37 ° C i 30 minutter. Fjern the plate fra inkubatoren og sett den tilbake i panseret.
- Ved hjelp av en P200 steril tips, forsiktig løsne gelen på en skånsom sirkelbevegelser fra grensen til brønnen. Gelen bør også løsne fra bunnen av brønnen.
- Utvanne hormoner i CDFBS media som skal legges til brønnene. Bruk E2 og R5020 til en 10 -10 M endelig konsentrasjon og prolaktin ved en på 10 -7 M endelig konsentrasjon. Som kontroll, bruker CDFBS media uten hormoner lagt til, men fremdeles inneholder det høyeste volumet av DMSO lik hormon aksjer brukt. Sørg for at hver brønn inneholder 1,5 ml av media. Plasser 3D-kulturene i en 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet vevsdyrkningsinkubator. Opprettholde kulturene for 1 eller 2 uker, endre media hver 2 dager.
3. Gel Behandling for Whole Mounts
- Fjerne kulturmedia og tilsett 1,5 ml PBS til hver brønn.
- Overfør gelen til et lysbilde. Skjær gel i to ved hjelp av en kurved kirurgisk kniv. Fortsett behandlingen med en halv og lagre den andre halvparten for histologisk analyse.
- Overfør halv gel for hele festet til et lysbilde. La gelen tørke i 5 min og deretter overføre lysbildet til en Coplin krukke inneholder 10% formalin.
Merk: Alle inkubasjoner bør gjøres ved RT. - Fix gels i en Coplin krukke på en shaker O / N.
- Vask glir to ganger med PBS i 10 min hver på shaker. Overføring lysbilder til 70% EtOH; inkuberes i 1 time på shaker. Overfør lysbilder til Carmine Alum O / N.
- Den neste dag, dehydrerer lysbilder på risteapparat i 70% EtOH, 95% EtOH og 100% EtOH i 1 time hver. Overføring lysbilder til xylen to ganger for en time hver, og holder på å shaker. Bruk toluen-baserte montering medium å montere gels og 1,5 mm tykke dekk.
- Undersøk hele mounts henhold vanlig lys (mikroskop eller stereoskop). For en mer detaljert analyse av form og lumen bruke konfokalmikroskopi og visualisere Carmine fargestoff med HeNe 633 nm laser.
4. Gel Behandling for Processing for histologi Analysis
- Overfør den resterende halvdel av gelen til et 20 mL hetteglass inneholdende 10% formalin og feste på shaker O / N.
- Vask geler to ganger med PBS i 10 min hver på shaker. Plasser gels til behandling kassetter for parafin embedding.
- Overfør geler til 70% EtOH, inkuberes i 1 time og følge med 95% EtOH i 1 time, endre til frisk 95% EtOH i 1 time, 100% EtOH i 1 time, og endres til frisk 100% EtOH i 1 time. På dette punktet, kan gelene bli lagret i 100% EtOH O / N ved RT eller inkubert med xylen i 1 time og deretter igjen i frisk xylen i 1 time.
- Overfør kassetter til parafin i 1 time ved 60 ° C i vakuum inkubator, gjentas med frisk parafin to ganger til.
- Fyll plastformer med ren parafin. Åpne kassetten, fjern gel og plassere den i plast mold som inneholder parafin. Fyll opp med parafin og legge til toppen av kassetten som inneholder etiketten på toppen og la blokk kul.
- Ta av plastic mold og § blokken ved hjelp av en mikrotom. Skaff 5 um tykke seksjoner for HE farging og immunocytochemistry.
5. Utvinning av Celler fra celler fra Gels Bruke Collage Treatment
- Fjerne gelen fra brønnen og overfører det til en petriskål inneholdende PBS. Skyll gel kort.
- Overfør gelen til et 15 ml rør inneholdende 2 ml av 0,125% kollagenase. Pipettere opp og ned 4-5 ganger for å bryte gelen i små stykker.
- Inkuber ved 37 ° C i 25 minutter (inntil gelen er oppløst, og cellene er i suspensjon)
- Tilsett 2 ml serum-supplert kulturmedium. Samle cellene ved sentrifugering (1000 xg, 5 min), kast supernatanten, re-suspendere celler og telle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 oppsummerer fremgangsmåten for fremstilling av de hormonsensitive 3D-kulturer. Epiteliale strukturer er observert i hele monteringer av geler dyrket i 2 uker i nærvær av E2 alene og i kombinasjon med andre hormoner. Bare enkeltceller eller grupper av 2-3 celler er til stede når det ikke noen hormoner blir tilsatt til kulturmediet (CDFBS medium) (figur 2). Denne tilstanden tjener som en negativ kontroll.
Celler i 3D kultur danner strukturer som varierer i form, størrelse og lumen tilstedeværelse. Fordelingen av strukturer i gelen er vanligvis heterogene. Som vist tidligere, er det som regel flere strukturer langs grensene av gelen enn sett ved senteret fire. På grunn av dette romlig heterogenitet, bør sammenligninger blant prøver begrenses til tilsvarende områder på tvers av prøver.
Artene som kollagen type 1 er avledet påvirkninger fenotype ennd kvaliteten av de resulterende epiteliale strukturer 5. Rottehale kollagen type 1, som anvendt her, ble valgt siden poding i bovint kollagen type 1 resulterte i dannelsen av uorganisert cellegrupper (Figur 3).
En detaljert analyse av de epiteliale strukturer kan oppnås ved hjelp av konfokal mikroskopi (figur 4). E2-behandling resulterer i runde og langstrakte strukturer (figur 4A). Tilstedeværelsen av E2 og prolaktin resulterer i mer spirende strukturer (figur 4b), mens tilstedeværelse av E2 og promegeston resulterer i uregelmessige strukturer med cellulære fremspring som minner om sideforgrenings (figur 4C). E2 alene og E2 samt prolaktin tykkere vev strukturer når målt ved vekst i z-retningen, og da sammenlignet med de som ble observert i E2 pluss promegeston.
For å kvantifisere celle nummer etter hormonbehandling, cellene er extracted fra gelen ved bruk av kollagenase behandling. For eksempel ved hjelp av denne metoden kan vi studere hvordan antiestrogen ICI 182780 hemmer effekten av E2 på celleproliferasjon i 3D kulturer (figur 5).
Figur 1. Fremgangsmåte for fremstilling av hormonfølsom 3D-kulturer. I korthet ble et enkeltcellesuspensjon av T47D-celler ble blandet med rottehale kollagen type 1 og helt over i brønner på en 12-brønns plate. Gelene får lov til å størkne i 30 minutter i en 37 ° C / 5% CO2-inkubator. Kulturmedium ble tilsatt, og gelene er løsrevet fra brønnen. Kulturer kan høstes etter 1 eller 2 uker etter sluttpunktet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2. Hele festene på 3D kulturer etter farging med Carmine Alum fargestoff (A) Whole mount av en halv gel farget med karmin alum å visualisere de epiteliale strukturer, et eksempel på ROI for morfologi analyse er angitt med en boks; WM 3D kulturer dyrket i 2 uker i (B) CDFBS Media (ingen hormoner lagt til) og (C) CDFBS media supplert med E2 og prolaktin. Skala barer er 5000 mikrometer (A) og 500 mikrometer (B & C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av matriser som benyttes i 3D-kultur. (A) Bovine kollagen type 1 resultater i uorganiserte klynger av celler, i motsetning til de organiserte strukturer (B) observert ved bruk av rotte hale kollagen type 1. Skala:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Confocal bilder av T47D strukturene observert i 3-D-kollagen-geler etter 2 uker. Behandling med (A) E2, (B) E2 + prolaktin og (C) E2 + R5020. Piler peker cytoplasmatiske anslag. Tykkelsen av epiteliale strukturer var henholdsvis 24, 40 og 20 um. Skala:. 40 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. 3D-kulturene behandlet med enten alene eller E2 E2 pluss ICI 182780 i 1 uke. Celletall etter celle ekstraksjon ved hjelp av kollagenase behandling. (A) CDFBS medium, (B) CDFBS-medium pluss E2 ved -10 1x10 M, (C) ICI 182780 ved 1x10 -8 M pluss E2 ved 1x10 -10 M og (D) ICI 182780 på 1 x 10-7 M pluss E2 på 1x10 -10 M. Barer:. SEM Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi setter stor pris på redaksjonelle bidrag fra Cheryl Schaeberle. Denne forskningen ble støttet av Avon Grants # 02-2009-093 og 02-2011-095, og NIEHS / NIH ES 08314 til AMS. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute of Environmental Health Sciences eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
