Introduction
Ao contrário das culturas 2D padrão, modelos de cultura de células de substituição 3D permitem o estudo do comportamento das células epiteliais num contexto fisiologicamente relevante, um tecido semelhante a um. culturas 3D da glândula mamária ajudaram a explicar muitos aspectos do desenvolvimento da glândula mamaria e neoplasia. No entanto, a maioria dos modelos de cultura 3D actualmente disponíveis não são adequados para estudar a acção hormonal, porque as linhas de células epiteliais humanos utilizados para a tarefa não possuem a expressão do receptor da hormona 6,7,9.
Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio mamário humano que é adequado para estudar a ação hormonal 12. Este modelo utiliza a linha disponível comercialmente hormona de resposta epitelial humano da mama celular, T47D 3,11,13, que foram originalmente derivados de um derrame pleural obtido a partir de um paciente do sexo feminino de 54 anos com um carcinoma ductal infiltrante da mama. Nós usamos ratos colagénio de cauda de tipo 1 como uma matriz. Este culto 3Dure modelo é apropriado para o estudo da acção dos três principais hormonas mammotropic (estradiol, promegestona (um análogo da progesterona), e prolactina) em células epiteliais da mama humanas. Morfologia epitelial induzida por hormona pode ser avaliado quantitativamente ao longo do tempo através de análises morfométricas 12.
Uma densidade de semeadura adequada permite que essas culturas em 3D para ser mantido por 2 semanas. Por esta altura, o desenvolvimento de estruturas é suficiente para uma avaliação quantitativa da acção da hormona robusta na morfologia epitelial. Os géis podem também ser colhidas a pontos de tempo anteriores para a proliferação celular e analisa a expressão do gene. Além disso, este modelo é apropriado para testar os efeitos de um tratamento hormonal sequencial; por exemplo, após o tratamento com estradiol durante a primeira semana e substituição com outra hormona / combinação de hormonas durante a semana seguinte. O efeito dos compostos estrogénicos e anti-estrogénios, tais como a ICI 182,780, também pode ser stumorreu usando este modelo de cultura 3D 12.
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Protocol
1. Preparação dos Reagentes
- Dissolve-se o progestagénio sintético promegestona (R5020) e 17-β-estradiol (E2) em etanol para fazer soluções de reserva 10 -3 m. Dissolver prolactina em água desionizada destilada para produzir uma solução stock de 1 mg / ml. Dissolve-se o antiestrogénio ICI 182,780 em DMSO para fazer uma solução estoque de 10 -2 M. Armazenar as soluções à temperatura de -20 ° C durante até 6 meses.
- dextrano carvão (CD) despojado de soro e médio CDFBS:
- Calor-inactivar soro fetal de bovino (FBS) em um banho de água a 57 ° C durante 30 min.
Nota: Use apenas material de vidro lavado com ácido para o restante deste protocolo. - Calcula-se a quantidade de carvão necessária. Usando 10% mais volume do que a quantidade de soro para compensar o deslocamento provocado pelo carvão, pesar 5% p / v de carvão activado em pó.
- Lavar duas vezes com carvão vegetal água destilada desionizada fria usando o mesmo volume que a quantidade de soro. Para cada lavagem centrifuge a 50 xg durante 2 min para sedimentar o carvão vegetal. Retire a água entre as lavagens. Adicionar 0,5% p / v de Dextrano T-70 para o último sedimento carvão. Re-suspender com água destilada, água desionizada e centrifugar a 100 xg durante 5 min. Aspirar a água.
- Adicionar o volume apropriado de soro para o sedimento e re-suspender o sedimento carvão dextrano no soro. Incubar, enquanto rola (6 RPM), a 37 ºC durante 60 min. Centrifugar a 2000 xg durante 20 min. Se sobrenadante turvo, repita a centrifugação; no entanto, o soro pode não ser completamente claro neste momento, mas serão apagados durante a filtração.
- Filtrar através de um filtro de 0,80 micron e, em seguida, novamente através de um filtro de 0,45 mícron para remover matéria em partículas maiores. Por último, esterilizar-filtro com um filtro de 0,20 micron. Loja filtrada CDFBS em tubos de vidro ou T-25 frascos de cultura a -20 ºC.
- Charcoal Dextran Stripped fetal bovino contendo media (mídia CDFBS): misturar 375 ml de fenol DMEM isento de vermelho e 125 ml de DMEM/ F-12. Remover 37,5 ml e substituí-lo com o mesmo volume de soro fetal bovino carvão dextrano Stripped. Adiciona-se 10 6 U / ml de penicilina e L-glutamina numa concentração final de 2 mM. Os meios de comunicação resultante é de 75% de DMEM, 25% de DMEM / F-12, 7,5% de dextrano a carvão despojado-FBS, 2 mM de L-glutamina, e 10 6 U / ml de penicilina.
- Calor-inactivar soro fetal de bovino (FBS) em um banho de água a 57 ° C durante 30 min.
- Prepare PBS 10X, NaOH 1 N e água desionizada destilada. Prepare um volume suficiente de cada um de acordo com o volume de solução de colágeno necessário. Esterilizar todas as soluções de filtragem. Armazenar a 10x PBS e água desionizada destilada estéril a 4 ° C durante até 1 mês. Não guarde a solução de NaOH 1N.
- Preparar a solução de colagénio a uma concentração final de 1 mg / ml de acordo com o protocolo para "Processo de gelificação alternativo para o colagénio I da cauda de rato" fornecida pelo fabricante. Cada gel é feito de 1,5 ml de solução de colagénio. Por exemplo, preparar a 18,5 ml (0,5 ml para ter em conta perdas durante a pipetagem) de solução de colagénio para preparar12 géis. Utilizar a solução de colagénio imediatamente ou manter em gelo durante até 2-3 horas.
- Carmine Alum corante:
- Combinar 1 g Carmine e 2,5 g de sulfato de alumínio e potássio em 500 ml de água destilada. Ferver enquanto se agitava durante 20 min. Observe com cuidado para evitar a ferver sobre. Ajustar o volume final de volta para 500 ml com água destilada adicional.
- Adicionar um cristal de timol para a atividade antimicrobiana e cobrir garrafa com folha de alumínio para proteger da luz. Filtrar através de um filtro de papel de grau de laboratório antes de cada utilização. Reutilizar a solução de carmim por até três meses. Armazenar à temperatura ambiente, protegida da luz.
- solução de colagenase: dissolver a colagenase em meio DMEM / F12 a uma concentração de 0,125% w / v. Não guarde esta solução.
2. Cultura 3D de T47D As células em Rat cauda colágeno tipo 1 Géis e tratamento hormonal
Nota: manter pipetas serológicos estéreis e pontas de pipeta a 4 ° C.
- Prepare uma suspensão de uma única célula e executar uma contagem de células. culturas de células de divisão T47D antes que eles atinjam 70% de confluência. Centrifuga-se o volume que contém a quantidade de células necessárias. Considere-se que um gel deve conter cerca de 75.000 células T47D.
- Usando uma pipeta a frio, de re-suspender o sedimento de células no volume apropriado de colagénio. Considere-se que cada gel é composta de 1,5 ml de colagénio. Misturar as células e colagénio o cuidado para evitar a introdução de bolhas.
- Para impedir o efeito de electricidade estática na distribuição das células, o escovar fronteiras, superior e inferior da placa de 12 poços com uma escova estática de redução depois de retirar a placa. Para evitar o acúmulo de carga estática durante o contato com a superfície de trabalho da capa, colocar esta placa em cima da outra placa de 12 poços (placa em branco), que também foi escovado com o brush.Gently estática de redução, despeje 1,5 ml da mistura em cada poço da placa de 12 poços.
- Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. Remover the placa da incubadora e coloque-o novamente na capa.
- Usando uma ponta estéril p200, retire cuidadosamente o gel em um suave movimento circular a partir da fronteira do poço. O gel também deve destacar a partir do fundo do poço.
- Diluir hormonas em meio CDFBS a ser adicionado aos poços. Use E2 e R5020 a uma concentração final de 10 -10 M e prolactina num a 10 -7 M concentração final. Como controle, usar a mídia CDFBS sem hormônios adicionados, mas ainda contendo o maior volume de DMSO igual às existências hormonais utilizados. Certifique-se de que cada poço contém 1,5 ml de meio. Coloque as culturas 3D dentro de uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2, 100% tecido humidade cultura incubadora. Manter as culturas por 1 ou 2 semanas, mudando os meios de comunicação a cada 2 dias.
3. Gel de processamento para toda Mounts
- Remover o meio de cultura e adicionar 1,5 ml de PBS a cada poço.
- Transferir o gel para um slide. Cortar o gel em meio usando uma curvad lâmina cirúrgica. Continuar o processamento com uma metade e guardar a outra metade para análise histológica.
- Transfira a metade gel para toda montar a um slide. Vamos gel seco durante 5 minutos e, em seguida, transferir o slide para um frasco Coplin contendo formol a 10%.
Nota: todas as incubações deve ser feito à temperatura ambiente. - Fix géis em um frasco coplin num agitador O / N.
- Lave as lâminas com PBS duas vezes durante 10 minutos cada em agitador. Transferir as lâminas para 70% de EtOH; incubar durante 1 hora no agitador. lâminas de transferência para Carmine Alum O / N.
- No dia seguinte, desidratar lâminas num agitador em EtOH a 70%, EtOH a 95% e 100% de EtOH, durante 1 h cada. Transferir as lâminas ao xileno duas vezes para 1 hora cada e manter em shaker. Use meio de montagem à base de tolueno para montar os géis e 1,5 mm de espessura Lamelas.
- Examine as peças inteiras sob luz normal (microscópio ou estereoscópio). Para uma análise mais detalhada da forma e lumen usar microscopia confocal e visualizar corante carmim com HeNe 633 a laser nm.
4. Processamento de Gel de Processamento de Análise de Histologia
- Transferir a metade restante do gel para um frasco de vidro de 20 ml contendo 10% de formalina e fixar num agitador de O / N.
- Lavar géis duas vezes com PBS durante 10 min cada, num agitador. géis coloque em cassetes de processamento para inclusão em parafina.
- geles de transferência para 70% de EtOH, incubar durante 1 h e seguir com 95% de EtOH, durante 1 h, para alterar fresco EtOH a 95% durante 1 hora, 100% de EtOH, durante 1 h, e para alterar fresco EtOH a 100% durante 1 hora. Neste ponto, os géis podem ser armazenados em EtOH a 100% O / N à TA ou incubaram-se com xileno, durante 1 h e, em seguida, novamente em xileno fresco durante 1 hr.
- cassetes de transferência de parafina durante 1 hora a 60 ° C na incubadora de vácuo, repetir com parafina fresco mais duas vezes.
- Preencha moldes de plástico com parafina limpo. Abrir a cassete, retirar o gel e colocá-la no molde de plástico contendo parafina. Encha-se com parafina e adicione topo da cassete contendo a etiqueta para cima e deixe bloco legal.
- Remover o Plastic molde e seção do bloco usando um micrótomo. Obter 5 um de espessura para a coloração HE e imunohistoquímica.
5. A extracção de células a partir de células a partir de géis usando colagenase tratamento
- Remover o gel a partir do poço e transferi-lo para uma placa de Petri contendo PBS. brevemente gel de lavagem.
- Transferir o gel para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de colagenase a 0,125%. Pipetar cima e para baixo 4-5 vezes de modo a quebrar o gel em pedaços pequenos.
- Incubar a 37 ° C durante 25 minutos (até que se dissolveu em gel e as células estão em suspensão)
- Adicionar 2 ml de meio de cultura soro suplementado. Coletar células por centrifugação (1000 x g, 5 min), sobrenadante de descarte, as células re-suspender e contar.
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Representative Results
A Figura 1 resume o procedimento para a preparação das culturas em 3D sensível ao hormônio. estruturas epiteliais são observados em peças inteiras de géis cultivadas durante 2 semanas, na presença de E2 sozinho e em combinação com outras hormonas. Apenas as células individuais ou grupos de 2-3 células estão presentes quando não há hormonas são adicionados ao meio de cultura (meio de CDFBS) (Figura 2). Esta condição serve como um controlo negativo.
As células em cultura em 3D formam estruturas que variam em tamanho, forma, presença e lúmen. A distribuição das estruturas no gel é tipicamente heterogénea. Como foi mostrado anteriormente, geralmente há mais estruturas ao longo das fronteiras do gel do que o observado no centro 4. Devido a esta heterogeneidade espacial, comparações entre as amostras devem ser limitados a regiões correspondentes em toda amostras.
A espécie de colagénio, que é um tipo de derivados influências do fenótipo umqualidade nd das estruturas epiteliais resultantes 5. Rato cauda colagénio de tipo 1, tal como se utiliza aqui, uma vez que foi escolhido semeando em colagénio bovino tipo 1 resultou na formação de grupos de células desorganizados (Figura 3).
Uma análise detalhada das estruturas epiteliais pode ser conseguida utilizando microscopia confocal (Figura 4). E2 tratamento resulta em estruturas arredondados e alongada (Figura 4A). A presença de E2 e resultados de prolactina em estruturas de brotamento mais (Figura 4B), enquanto que a presença de E2 e resultados promegestona em estruturas irregulares com projecções celulares reminiscentes da ramificação lateral (Figura 4C). E2 sozinho e E2 além de prolactina engrossar estruturas de tecido, quando medido pelo crescimento na z-direção, e quando comparados com os observados em E2 mais promegestona.
A fim de quantificar o número de células após o tratamento com a hormona, as células são extracted a partir do gel utilizando o tratamento com colagenase. Por exemplo, utilizando este método pode-se estudar a forma como o antiestrogénio ICI 182,780 inibe o efeito de E2 sobre a proliferação celular nas culturas 3D (Figura 5).
Figura 1. Processo para a preparação de culturas em 3D sensível à hormona. Resumidamente, uma suspensão de célula única de células T47D é misturado com colagénio de cauda de rato do tipo 1 e verteu-se em poços de uma placa de 12 poços. Os géis são permitidas para coagular durante 30 minutos num banho a 37 ° C / 5% de CO2, incubadora. O meio de cultura é adicionado e os géis são separadas do bem. As culturas podem ser colhidas após 1 ou 2 semanas de acordo com o ponto final. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 2. peças inteiras de culturas 3D após coloração com carmim Alum corante (A) Monte de metade de um gel corado com alúmen carmim de visualizar as estruturas epiteliais, um exemplo de ROI para análise da morfologia está indicado por uma caixa; WM de culturas 3D cultivadas durante 2 semanas em (B) CDFBS media (sem hormonas adicionados) e (C) CDFBS meios suplementados com E2 e prolactina. Barras de escala são de 5.000 mm (A) e 500 m (B & C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação de matrizes utilizadas em cultura 3D. (A) Bovine colágeno tipo 1 resulta em aglomerados desorganizados de células, em oposição às estruturas organizadas (B) observado quando se utiliza cauda de rato colágeno tipo bar 1. Escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. imagens confocais de estruturas T47D observadas em géis de colagénio 3-D após 2 semanas. O tratamento com (A) E2, (B) de E2 + prolactina e (C) de E2 + R5020. As setas indicam as projeções citoplasmáticas. Espessura de estruturas epiteliais foi de 24, 40 e 20 uM respectivamente. Barra de escala:. 40 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. culturas 3D tratados apenas com tanto E2 ou E2 além ICI 182.780 por 1 semana. As contagens de células após a extração de células usando o tratamento colagenase. (A) CDFBS médio, (B) CDFBS meio mais E2 no 1x10 -10 M, (C) ICI 182,780 na 1x10 -8 M mais E2 no 1x10 -10 M e (D) ICI 182.780 em 1x 10-7 M mais E2 a 1x10 -10 M. Bares:. SEM Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Acknowledgments
Agradecemos imensamente as contribuições editoriais pela Cheryl Schaeberle. Esta pesquisa foi apoiada pela Avon Grants # 02-2009-093 e 02-2011-095, e NIEHS / NIH ES 08.314 para AMS. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental ou o National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
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