Introduction
В отличие от стандартных 2D культур, 3D клеточных культур суррогатных модели позволяют для изучения эпителиального клеточного поведения в физиологически соответствующей контексте, одной напоминающей ткань. 3D культуры молочной железы помогли выяснить многие аспекты развития молочных желез и неоплазии. Тем не менее, большинство моделей культуры 3D доступных в настоящее время являются неподходящими для изучения гормональное действие, поскольку эпителиальные клеточные линии человека, используемые для выполнения этой задачи лишены экспрессии 6,7,9 рецептора гормона.
Здесь мы описываем 3D модель культуры эпителия молочной железы человека, который подходит для изучения гормона действие 12. Эта модель использует коммерчески доступный гормон реагирует человеческий клеточную линию рака молочной эпителиальных, T47D 3,11,13, которые были первоначально полученную из плеврит, полученной из 54-летней пациентки в с проникающими раком протоков молочной железы. Мы используем крысиного хвоста коллагена типа 1 в качестве матрицы. Эта 3D культЮр модель подходит для изучения действия трех основных mammotropic гормонов (эстрадиола, promegestone (аналог прогестерона), и пролактина) на клетках рака молочной эпителиальных человека. Гормон-индуцированный эпителиальный морфология может быть оценена количественно с течением времени с помощью морфометрического анализа 12.
Необходимости повышения плотности посева дает эти 3D культур должны храниться в течение 2-х недель. К этому времени, разработка структур является достаточным для надежного количественной оценки действия гормонов на эпителиальной морфологии. Гели могут также быть собраны в более ранних временных точках для клеточной пролиферации и экспрессии генов анализов. Кроме того, эта модель подходит для проверки эффектов последовательного гормонального лечения; Например, после обработки эстрадиола в течение первой недели и замены с другими гормона / комбинации гормонов в течение следующей недели. Эффект эстрогенных соединений и антиэстрогены, такие как ICI 182,780, также могут быть стуумер использовании этого 3D культуры модель 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов
- Растворите синтетический прогестаген promegestone (R5020) и 17-бета-эстрадиол (Е2) в этаноле, чтобы сделать 10 -3 м растворы. Растворите пролактин в дистиллированной деионизированной водой, чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора. Растворите антиэстроген ICI 182780 в ДМСО сделать 10 -2 М маточного раствора. Храните эти решения при -20 ° С до 6 месяцев.
- Древесный уголь декстрана (CD) раздели сыворотку и CDFBS среду:
- Тепло-инактивации фетальной бычьей сыворотки (FBS) в водяной бане 57 ° C в течение 30 мин.
Примечание: Использовать только промывают стеклянную посуду на оставшуюся часть этого протокола. - Рассчитать количество угля, необходимого. Используя 10% больше объема, чем количество сыворотки, чтобы компенсировать смещения, вызванного углем, весят 5% вес / объем активированного порошкообразного угля.
- Промыть уголь дважды холодной деионизированной дистиллированной водой с использованием того же объема, что и количества сыворотки. Для каждого мытья Centrifuge при 50 мкг в течение 2 мин для осаждения уголь. Удалить воду между стирок. Добавить 0,5% вес / объем декстран Т-70 до последней углем гранул. Повторное приостановить с дистиллированной деионизированной водой и центрифугируют при 100 х г в течение 5 мин. Аспирируйте воду.
- Добавить соответствующий объем сыворотки к осадку и повторно приостанавливать уголь декстрана осадок в сыворотке крови. Инкубируйте, при прокатке (6 оборотов в минуту), при 37 ° С в течение 60 мин. Центрифуга при 2000 х г в течение 20 мин. Если супернатант появляется облачно, повторите центрифугирования; Однако, сыворотка может быть не совсем понятно в это время, но будет очищен в процессе фильтрации.
- Смесь фильтруют через 0,80-микронный фильтр, а затем снова через 0,45-микронный фильтр для удаления крупных твердых частиц. Наконец, фильтр-стерилизуют при 0,20-микронный фильтр. Магазин фильтруют CDFBS в стеклянных трубках или Т-25 колб культуры при -20 ° С.
- Древесный уголь декстрана Лишенный эмбриональной бычьей среде, содержащей (CDFBS СМИ): смешать 375 мл фенола красного свободной DMEM и 125 мл DMEM/ F-12. Удалить 37,5 мл и заменить его таким же объемом уголь декстрана Stripped эмбриональной телячьей сыворотки. Добавьте 10 6 ед / мл пенициллина и L-глутамин до конечной концентрации 2 мМ. Полученный носитель 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% Уголь декстран раздели-FBS, 2 мМ L-глутамина, и 10 6 ед / мл пенициллина.
- Тепло-инактивации фетальной бычьей сыворотки (FBS) в водяной бане 57 ° C в течение 30 мин.
- Подготовьте 10X PBS, 1N NaOH и дистиллированной деионизированной воды. Подготовьте достаточным объемом каждого по объему раствора коллагена, необходимого. Стерилизовать все решения от фильтрации. Хранить 10x PBS и стерильной дистиллированной деионизированной воды при 4 ° С в течение до 1 месяца. Не храните раствор 1N NaOH.
- Подготовьте раствора коллагена в / мл конечной концентрации 1 мг в соответствии с протоколом для "альтернативная методика гелеобразование для Collagen I, крысиный хвост", предоставленного производителем. Каждый гель изготовлен из 1,5 мл раствора коллагена. Например, приготовить 18,5 мл (0,5 мл для учета потерь во время пипетки) коллагенового раствора, чтобы подготовить12 гели. немедленно Используйте раствора коллагена или держать на льду в течение до 2-3 ч.
- Кармин Квасцы краситель:
- Объедин ют 1 г Carmine и 2,5 г сульфата алюминия калия в 500 мл дистиллированной воды. Кипение при перемешивании в течение 20 мин. Смотрите внимательно, чтобы избежать выкипания. Регулировка конечного объема обратно до 500 мл дополнительным количеством дистиллированной воды.
- Добавить кристалл тимола для антимикробной активности и охватывают бутылку с алюминиевой фольгой для защиты от света. Смесь фильтруют через бумажный фильтр лабораторное класса перед каждым использованием. Повторное решение кармин на срок до трех месяцев. Хранить при комнатной температуре, в защищенном от света.
- Раствора коллагеназы: растворить коллагеназы в DMEM / F12, при концентрации 0,125% вес / объем. Не храните это решение.
2. 3D культуры T47D клетки крысы хвост коллагена типа 1 Гели и Гормональное лечение
Примечание: держать стерильные серологические пипетки и наконечники при 4 ° С.
- Подготовительномповторно одноклеточного подвеску и выполнить подсчет клеток. культуры Split T47D клеток, прежде чем они достигают 70% слияния. Центрифуга том, содержащий количество клеток, необходимых. Учтите, что один гель должен содержать около 75000 T47D клетки.
- Использование холодного пипетки, повторно приостанавливать осадок клеток в соответствующий объем коллагена. Рассмотрим, что каждый гель состоит из 1,5 мл коллагена. Смешайте клетки и коллаген осторожно, чтобы избежать введения пузырьков.
- Для предотвращения воздействия статического электричества на распределение клеток, чистить границ, верхнюю и нижнюю часть 12-луночного планшета со статическим снижения кисти после разворачивания пластину. Чтобы избежать накопления статического заряда заряда при контакте с рабочей поверхностью капота, поместите эту пластину поверх другого 12-луночного планшета (заглушку), что также матового со статическим снижения brush.Gently, залить 1,5 мл смеси в каждую лунку 12-луночного планшета.
- Место пластины в инкубаторе при 37 ° С в течение 30 мин. Удалить тысе пластины из инкубатора и поместить его обратно в капюшоне.
- Использование P200 стерильную наконечник, тщательно отделить гель в нежном круговом движении от границы скважины. Гель также должны отделяться от нижней части скважины.
- Развести гормоны в CDFBS сред, которые будут добавлены к лункам. Используйте Е2 и R5020 при конечной концентрации пролактина и 10 -10 м при при 10 -7 М конечной концентрации. В качестве контроля используют CDFBS СМИ без гормонов добавлен, но все еще содержащий наибольший объем ДМСО, равной запасов гормонов, используемых. Убедитесь, что каждая лунка содержит 1,5 мл среды. Поместите 3D культур внутри 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажность тканевой культуры инкубатор. Поддерживать культуру в течение 1 или 2 недель, меняя СМИ каждые 2 дня.
3. Гель Обработка для тотальных
- Удалить питательных сред и добавить 1,5 мл PBS в каждую лунку.
- Передача гель на слайд. Вырезать гель пополам с использованием кривойd хирургическое лезвие. Продолжить обработку с одной половиной и сохранить другую половину для гистологического анализа.
- Перенести половину гель для всего смонтировать на слайде. Пусть гель сохнуть в течение 5 мин, а затем передать слайда в Коплин банку, содержащую 10% формалин.
Примечание: Все инкубации должно быть сделано при комнатной температуре. - Fix гели в Коплин банку на шейкере O / N.
- Мытье скользит дважды PBS в течение 10 минут каждый по шейкере. Передача слайды 70% этанола; инкубировать в течение 1 часа на шейкере. Передача слайдов до Carmine Alum O / N.
- На следующий день, обезвоживают слайды на шейкере в 70% этанола, 95% этанола и 100% этанола в течение 1 ч каждой. Передача слайды в ксилол дважды в течение 1 ч каждый и держать на качалке. Используйте на основе толуола гистологическая среда монтировать гели и толщиной 1,5 мм покровные.
- Изучить тотальных под обычном свете (микроскопа или стереоскоп). Для более детального анализа формы и просвета использовать конфокальной микроскопии и визуализации Carmine краситель Hene 633 нм лазер.
4. Гель Обработка переработки для гистологии анализа
- Передача оставшуюся половину геля стеклянную пробирку емкостью 20 мл, содержащую 10% формалин и зафиксировать на шейкере O / N.
- Вымойте гели дважды PBS в течение 10 минут каждый по шейкере. Место гели в переработку кассет для парафин.
- Передача гели до 70% этанола, инкубируют в течение 1 ч, а затем с 95% этанола в течение 1 ч, менять на свежий 95% этанола в течение 1 ч, 100% EtOH в течение 1 ч, и изменить на свежий 100% этанола в течение 1 часа. В этот момент, гели могут быть сохранены в 100% EtOH O / N при КТ или инкубировали с ксилолом в течение 1 ч, а затем снова в свежем ксилола в течение 1 часа.
- Передача кассеты парафином в течение 1 ч при 60 ° С в вакуумном инкубаторе, повторить со свежим парафином в два раза больше.
- Заполните пластиковые формы с чистой парафина. Откройте кассету, удалить гель и поместить его в пластиковые формы, содержащий парафин. Пополнить парафином и добавить вершину кассетой, содержащей метку на вершине, и пусть блок круто.
- Удалите пластIC плесени и раздел блок с помощью микротома. Получить 5 мкм толстые секции для HE окрашивания и иммуноцитохимия.
5. Экстракция клеток из клеток от гелей, используя коллагеназы Лечение
- Удалить гель из колодца и перенести его на чашку Петри, содержащую PBS. Промыть гель кратко.
- Передача гель 15 мл пробирку, содержащую 2 мл 0,125% коллагеназы. Внесите вверх и вниз 4-5 раз, чтобы разорвать гель на мелкие кусочки.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 25 мин (до тех пор, пока гель не растворится и клетки в суспензии)
- Добавляют 2 мл сыворотки, дополненной культуральной среде. Сбор клеток путем центрифугирования (1000 XG, 5 мин), отбросить супернатант, вновь приостановить клеток и считать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 приведена процедура для получения гормоночувствительным 3D культур. Эпителиальные структуры наблюдаются в тотальных гелей, культивированных в течение 2 недель в присутствии E2 и в комбинации с другими гормонами. Только отдельные клетки или группы клеток 2-3 присутствуют, когда никакие гормоны не будут добавлены в культуральную среду (CDFBS среднего) (рис.2). Это условие служит в качестве отрицательного контроля.
Клетки в 3D структуры образуют культура, которые различаются по форме, размеру и наличию просвета. Распределение структур в геле, как правило, неоднородны. Как было показано ранее, обычно существуют больше структур вдоль границ геля, чем видели в центре 4. Из-за этого пространственной неоднородности, сравнения между образцами должны быть ограничены соответствующих регионов по образцам.
Виды из которых коллаген типа 1, полученные, влияет на фенотип Ай качество получаемых эпителиальных структур 5. Крысиный хвост коллагена типа 1, как используется здесь, был выбран, так как посев в бычьего коллагена типа 1 приводит к образованию неорганизованных групп клеток (рисунок 3).
Подробный анализ эпителиальных структур может быть достигнуто с помощью конфокальной микроскопии (рис.4). Результаты лечения Е2 в округлых и продолговатых структур (рис 4а). Присутствие Е2 и пролактина приводит к более многообещающий структур (рис 4б), а наличие Е2 и результатов promegestone в нерегулярных структур с клеточными проекций напоминающими стороне перехода (фиг.4С). Е2 в одиночестве и E2 плюс пролактин утолщаются тканевых структур при измерении роста в направлении оси г, и, когда по сравнению с теми, наблюдаемых в E2 плюс promegestone.
Для того, чтобы определить число клеток после гормонального лечения, клетки extracteд из геля с использованием обработки коллагеназой. Например, с помощью этого метода мы можем изучить, как антиэстроген ICI 182780 ингибирует действие Е2 на пролиферацию клеток в 3D культур (рис 5).
Рисунок 1. Процедура подготовки гормоночувствительным 3D культур. Вкратце, одноклеточного суспензию клеток T47D смешивают с хвоста крыс коллагена типа 1 и выливают в лунки 12-луночного планшета. Гели могут застывать в течение 30 мин в / 5 инкубаторе% CO2 37 ° C. добавляют питательную среду и гели удаленные из скважины. Культуры могут быть собраны через 1 или 2 недели в зависимости от конечной точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
. Рисунок 2. Целые крепления 3D культур после окрашивания Кармин Alum красителя (А) вся гора половины геля, окрашенном кармин квасцов, чтобы визуализировать эпителиальные структуры, пример ROI для морфологического анализа свидетельствуют коробке; WM 3D-культур выращивают в течение 2 недель в (б) не CDFBS медиа (без добавления гормонов) и (С) CDFBS дополненной Е2 и пролактина. Масштабные бары 5000 мкм (А) и 500 мкм (Б & С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Сравнение матриц, используемых в 3D культуры. (А) Boviпе коллаген типа 1 приводит к неорганизованных скоплений клеток, в отличие от организованных структур (B) наблюдается при использовании крысиный хвост коллагена типа 1. масштабную линейку:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. конфокальных изображений T47D структур, наблюдаемых в 3-D коллагеновых гелей после 2 недель. Лечение с (А) E2, (б) E2 + пролактина и (C) Е2 + R5020. Стрелки указывают на цитоплазматических проекций. Толщина эпителиальных структур было 24, 40 и 20 мкм соответственно. Измерительная линейка:. 40 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. 3D культуры обрабатывали либо только E2 или E2 плюс ICI 182780 за 1 неделю. Подсчитанных клеток после экстракции клеток с использованием обработки коллагеназой. (А) CDFBS среду, (Б) CDFBS среду плюс Е2 1x10 -10 М, (С) ICI 182780 на 1x10 -8 М плюс Е2 на 1x10 -10 М и (D) ICI 182780 на 1x 10-7 М плюс Е2 на 1x10 -10 М. Бары:. СЭМ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы высоко ценим редакционных взносы от Шерил Schaeberle. Это исследование было поддержано Avon грантов # 02-2009-093 и 02-2011-095 и NIEHS / NIH ES 08314 до AMS. Этот материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института гигиены окружающей среды наук или Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
