Introduction
A diferencia de los cultivos 2D estándar, modelos sustitutos de cultivo de células 3D permiten el estudio del comportamiento de las células epiteliales en un contexto fisiológicamente relevante, uno parecido a un tejido. culturas 3D de la glándula mamaria han ayudado a aclarar muchos aspectos del desarrollo de la glándula mamaria y la neoplasia. Sin embargo, la mayoría de los modelos de cultivo 3D disponibles actualmente no son adecuados para estudiar la acción hormonal porque las líneas de células epiteliales humanos utilizados para la tarea carecen de expresión del receptor de la hormona 6,7,9.
En este documento, se describe un modelo de cultivo 3D del epitelio de mama humano que es adecuado para estudiar la acción hormonal 12. Este modelo usa la línea disponible en el mercado sensible a hormonas humana epiteliales de mama celular, T47D 3,11,13, que se deriva originalmente de un derrame pleural obtenida de un paciente femenino de 54 años con un carcinoma ductal infiltrante de la mama. Utilizamos rata colágeno de cola de tipo 1 como una matriz. Este culto 3Dmodelo ure es apropiado para el estudio de la acción de las tres hormonas mammotropic principales (estradiol, promegestona (un análogo de progesterona), y prolactina) en células epiteliales de mama humanos. La morfología del epitelio inducida por la hormona se puede evaluar cuantitativamente a través del tiempo mediante análisis morfométricos 12.
Una densidad de siembra apropiada permite a estos cultivos en 3D que se le mantenga durante 2 semanas. Por este tiempo, el desarrollo de estructuras es suficiente para una evaluación cuantitativa robusta de la acción hormonal en la morfología epitelial. Los geles también se pueden cosechar en puntos de tiempo anteriores para la proliferación celular y los análisis de la expresión génica. Además, este modelo es adecuado para probar los efectos de un tratamiento hormonal secuencial; por ejemplo, después del tratamiento con estradiol durante la primera semana y el reemplazo con otra hormona / combinación de hormonas durante la siguiente semana. El efecto de los compuestos y antiestrógenos estrogénicos, tales como ICI 182780, también se puede Stumurió el uso de este modelo de cultivo 3D 12.
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Protocol
1. Preparación de los reactivos
- Se disuelve el promegestona sintético progestágeno (R5020) y 17-β-estradiol (E2) en etanol para hacer 10 -3 soluciones madre M. Disolver la prolactina en agua desionizada destilada para hacer una solución stock 1 mg / ml. Disolver el antiestrógeno ICI 182780 en DMSO para preparar una solución de stock 10 -2 M. Almacenar estas soluciones a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
- dextrano carbón (CD) despojado suero y medio CDFBS:
- Heat-inactivar suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 57 ° durante 30 min.
Nota: Utilice sólo material de vidrio lavado con ácido durante el resto de este protocolo. - Calcular la cantidad de carbón necesaria. El uso de 10% más de volumen que la cantidad de suero para compensar el desplazamiento causado por el carbón de leña, pesar 5% en peso / vol carbón activo en polvo.
- Lavar carbón dos veces con agua destilada desionizada fría usando el mismo volumen que la cantidad de suero. Para cada lavado centrifuge a 50 xg durante 2 min para sedimentar el carbón vegetal. Eliminar el agua después de cada lavado. Añadir 0,5% peso / vol de dextrano T-70 a la última pastilla de carbón. Vuelva a suspender con agua destilada, desionizada y se centrifuga a 100 xg durante 5 min. Aspirar el agua.
- Añadir el volumen apropiado de suero al sedimento y volver a suspender el sedimento de carbón dextrano en el suero. Incubar, mientras que rueda (6 rpm), a 37 ° C durante 60 minutos. Centrifugar a 2000 xg durante 20 min. Si sobrenadante aparece nublado, repetir la centrifugación; Sin embargo, el suero puede no ser del todo claro en este momento, pero será limpiado durante la filtración.
- Filtrar a través de un filtro de 0,80 micras y luego de nuevo a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar las partículas más grandes. Finalmente, filtro de esterilizar con un filtro de 0,20 micras. Tienda filtra CDFBS en tubos de vidrio o T-25 frascos de cultivo a -20 ºC.
- Carbón de leña con dextrano-fetal bovino que contiene los medios de comunicación (medios CDFBS): mezclar 375 ml de fenol DMEM libre de rojo y 125 ml de DMEM/ F-12. Retire 37,5 ml y reemplazarlo con el mismo volumen de suero fetal bovino de carbón dextrano. Añadir 10 6 U / ml de penicilina y L-glutamina a una concentración final de 2 mM. Los medios de comunicación resultante es 75% de DMEM, 25% de DMEM / F-12, 7,5% de dextrano con carbón vegetal-FBS, 2 mM de L-glutamina, y 10 6 U / ml de penicilina.
- Heat-inactivar suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 57 ° durante 30 min.
- Preparar 10X PBS, NaOH 1 N y agua desionizada destilada. Preparar suficiente volumen de cada uno de acuerdo con el volumen de solución de colágeno sea necesario. Esterilizar todas las soluciones de filtrado. Almacenar el 10x PBS y agua destilada desionizada estéril a 4 ° C por hasta 1 mes. No almacene la solución de NaOH 1N.
- Preparar la solución de colágeno a una 1 mg / ml de concentración final de acuerdo con el protocolo para el "Procedimiento de gelificación alternativo para el colágeno I, de cola de rata" proporcionado por el fabricante. Cada gel se hace de 1,5 ml de solución de colágeno. Por ejemplo, preparar 18,5 ml (0,5 ml para dar cuenta de la pérdida durante el pipeteado) de solución de colágeno para preparar12 geles. Utilice la solución de colágeno inmediatamente o mantener en hielo durante un máximo de 2-3 horas.
- Carmín alumbre tinte:
- Combinar 1 g Carmine y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio en 500 ml de agua destilada. Hervir mientras se agita durante 20 min. Observe cuidadosamente para evitar una ebullición más. Ajustar el volumen final de nuevo a 500 ml con agua destilada adicional.
- Añadir un cristal de timol para la actividad antimicrobiana y cubrir botella con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Filtrar a través de un filtro de papel de grado de laboratorio antes de cada uso. Reutilizar la solución de carmín para un máximo de tres meses. Almacenar a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- solución de colagenasa: disolver la colagenasa en medio DMEM / F12 en una concentración de 0,125% w / v. No guarde esta solución.
2. Cultura 3D de T47D células en la cola de la rata colágeno tipo 1 Geles y Tratamiento Hormonal
Nota: mantener las pipetas serológicas estériles y puntas de pipeta a 4 ° C.
- AEEre una suspensión de una sola célula y realizar un recuento de células. cultivos de células T47D de división antes de que alcancen el 70% de confluencia. Se centrifuga el volumen que contiene la cantidad de células necesarias. Tenga en cuenta que un gel debe contener aproximadamente 75.000 células T47D.
- Usando una pipeta de frío, vuelva a suspender el sedimento celular en el volumen apropiado de colágeno. Tenga en cuenta que cada gel se compone de 1,5 ml de colágeno. Mezclar las células y el colágeno suavemente para evitar la introducción de burbujas.
- Para evitar el efecto de la electricidad estática en la distribución de células, cepillo de la frontera, la parte superior e inferior de la placa de 12 pocillos con un cepillo de reducción estática después de abrir el plato. Para evitar la acumulación de carga estática durante el contacto con la superficie de trabajo de la campana, colocar esta placa en la parte superior de la otra placa de 12 pocillos (placa en blanco) que también ha sido aplicado con brocha con la brush.Gently reductores estática, verter 1,5 ml de la mezcla en cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
- Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 30 minutos. Retire THe placa de la incubadora y colocarlo de nuevo en la campana.
- Utilizando una punta estéril p200, separar cuidadosamente el gel en un suave movimiento circular de la frontera del pozo. El gel también se debe separar de la parte inferior del pozo.
- Diluir hormonas en los medios de comunicación CDFBS que se añaden a los pocillos. Use E2 y R5020 a una concentración final 10 -10 M y prolactina en un en 10 -7 M concentración final. Como control, utilizar medios CDFBS sin hormonas, pero que todavía contiene el mayor volumen de DMSO iguales a las reservas de hormonas utilizadas. Asegúrese de que cada pocillo contiene 1,5 ml de medio. Coloque las culturas 3D dentro de una 37 ° C, 5% de CO 2, el 100% tejido humedad cultura incubadora. Mantener los cultivos durante 1 o 2 semanas, el cambio de los medios de comunicación cada 2 días.
3. Tratamiento Gel para toda Monturas
- Retire los medios de cultivo y añadir 1,5 ml de PBS a cada pocillo.
- Transferir el gel a una diapositiva. Cortar el gel en un medio utilizando una curvacuchilla quirúrgica d. Continuar con el procesamiento con una mitad y guardar la otra mitad para el análisis histológico.
- Transferir el gel de la mitad de todo el montaje a una diapositiva. Deje secar gel durante 5 minutos y luego transferir la diapositiva a una jarra de Coplin que contiene un 10% de formalina.
Nota: todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente. - Fijar geles en una jarra Coplin en un agitador O / N.
- Lavar los portaobjetos dos veces con PBS durante 10 min cada uno en agitador. Transferencia desliza a 70% EtOH; incubar durante 1 hr en un agitador. transferencia de diapositivas a Carmine Alum O / N.
- El día siguiente, deshidratar diapositivas en un agitador en 70% de EtOH, 95% de EtOH y 100% de EtOH durante 1 hora cada uno. Transferencia desliza a xileno dos veces durante 1 hora cada uno y mantener en un agitador. Utilice medio de montaje a base de tolueno para montar los geles y 1,5 mm de espesor cubreobjetos.
- Examine su conjunto se monta bajo luz normal (microscopio o estereoscopio). Para un análisis más detallado de la forma y el lumen utilizar microscopía confocal y visualizar colorante carmín con 633 nm láser de He-Ne.
4. Tratamiento Gel para transformación para el análisis Histología
- Transferir el medio restante de la gel a un vial de vidrio de 20 ml que contiene 10% de formalina y fijar en un agitador O / N.
- Lavar geles dos veces con PBS durante 10 min cada uno en agitador. Coloque los geles en casetes de procesamiento para la inclusión en parafina.
- geles de transferencia de hasta 70% de EtOH, se incuban durante 1 hora y siguen con EtOH al 95% durante 1 hora, cambian al fresco EtOH al 95% durante 1 hora, EtOH al 100% durante 1 hora, y cambian a fresca EtOH al 100% durante 1 hora. En este punto, los geles se pueden almacenar en 100% de EtOH O / N a temperatura ambiente o se incubaron con xileno durante 1 hr y luego de nuevo en xileno fresco para 1 hr.
- casetes de transferencia de parafina durante 1 hora a 60 ° C en una incubadora de vacío, repetir con parafina fresca dos veces más.
- Rellenar los moldes de plástico con parafina limpia. Abra el casete, retire el gel y lo coloca en el molde que contiene parafina plástico. Llenar el depósito de parafina y añadir la parte superior de casete que contiene la etiqueta en la parte superior y dejar que el bloque frío.
- Retire el plastic molde y la sección del bloque utilizando un microtomo. Obtener secciones de 5 um de espesor para la tinción HE e inmunocitoquímica.
5. La extracción de células a partir de células a partir de geles Uso de tratamiento con colagenasa
- Eliminar gel del pozo y la transfiere a una placa de Petri que contiene PBS. Enjuague el gel brevemente.
- Transferir el gel a un tubo de 15 ml que contiene 2 ml de 0,125% de colagenasa. Pipetear arriba y abajo 4-5 veces con el fin de romper el gel en trozos pequeños.
- Incubar a 37 ° C durante 25 min (hasta que el gel se haya disuelto y las células están en suspensión)
- Añadir 2 ml de medio de cultivo suplementado con suero. Recoger las células por centrifugación (1.000 xg, 5 min), el sobrenadante de descarte, volver a suspender las células y contar.
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Representative Results
La Figura 1 resume el procedimiento para la preparación de las culturas 3D sensibles a las hormonas. estructuras epiteliales se observan en preparaciones completas de los geles se cultivaron durante 2 semanas en presencia de E2 solo y en combinación con otras hormonas. Sólo las células individuales o grupos de 2-3 células están presentes cuando se añaden ninguna hormona al medio de cultivo (medio CDFBS) (Figura 2). Esta condición sirve como un control negativo.
Las células en la cultura Forma estructuras 3D que varían en forma, tamaño, y la presencia del lumen. La distribución de las estructuras en el gel es típicamente heterogéneo. Como se indica anteriormente, por lo general hay más estructuras a lo largo de las fronteras de gel que los observados en el centro 4. Debido a esta heterogeneidad espacial, las comparaciones entre las muestras deben ser limitadas a las regiones correspondientes a través de muestras.
La especie de la que el colágeno de tipo 1 se deriva influye en el fenotipo de unand calidad de las estructuras epiteliales resultantes 5. Cola de rata colágeno de tipo 1, tal como se utiliza aquí, se eligió ya que la siembra en bovina colágeno tipo 1 como resultado la formación de grupos de células desorganizadas (Figura 3).
Un análisis detallado de las estructuras epiteliales se puede lograr mediante microscopía confocal (Figura 4). Los resultados del tratamiento E2 en las estructuras redondeadas y alargadas (Figura 4a). La presencia de E2 y resultados de prolactina en ciernes estructuras más (Figura 4B), mientras que la presencia de E2 y resultados promegestona en las estructuras irregulares con proyecciones celulares que recuerdan a lado de ramificación (Figura 4C). E2 solo y E2 más prolactina espesan las estructuras de tejido cuando se mide por el crecimiento en la dirección z, y en comparación con los observados en E2 más promegestona.
Con el fin de cuantificar el número de células después del tratamiento hormonal, las células son Extracted del gel usando tratamiento con colagenasa. Por ejemplo, usando este método se puede estudiar cómo el antiestrógeno ICI 182780 inhibe el efecto de E2 sobre la proliferación celular en los cultivos 3D (Figura 5).
Figura 1. Procedimiento para la preparación de cultivos 3D sensibles a las hormonas. Brevemente, una suspensión de una sola célula de las células T47D se mezcla con cola de rata colágeno de tipo 1 y se vertió en los pocillos de una placa de 12 pocillos. Los geles se les permite congelar durante 30 min en un / 5% de CO2 incubadora 37 ° C. se añade medio de cultivo y los geles se separan del pozo. Los cultivos pueden ser cosechados después de 1 ó 2 semanas de acuerdo con el punto final. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 2. montajes enteros de las culturas 3D después de la tinción con colorante carmín alumbre (A) Todo el montaje de la mitad de un gel teñido con alumbre carmín para visualizar las estructuras epiteliales, un ejemplo de retorno de la inversión para el análisis de la morfología se indica mediante una caja; WM de 3D culturas crecido durante 2 semanas en (B) CDFBS Media (sin hormonas añadidas) y (C) CDFBS medios suplementados con E2 y la prolactina. Las barras de escala son de 5,000 mm (A) y 500 m (B y C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de matrices utilizadas en el cultivo 3D. (A) Bovine colágeno tipo 1 resultados en grupos desorganizados de células, a diferencia de las estructuras organizadas (B) cuando se utilicen cola de rata colágeno tipo barra 1. Escala:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Las imágenes confocales de estructuras T47D observadas en geles de colágeno 3-D después de 2 semanas. El tratamiento con (A) E2, (B) E2 + prolactina y (C) E2 + R5020. Las flechas apuntan a las proyecciones citoplasmáticas. Espesor de las estructuras epiteliales fue de 24, 40 y 20 micras, respectivamente. Barra de escala:. 40 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. 3D culturas tratadas con E2 ya sea solo o E2 además ICI 182.780 durante 1 semana. Los recuentos de células después de la extracción de células mediante tratamiento con colagenasa. (A) CDFBS medio, (B) CDFBS medio más E2 en 1x10 -10 M, (C) ICI 182.780 a 1x10 -8 M más E2 en 1x10 -10 M y (D) ICI 182.780 a 1x 10-7 M más E2 en 1x10 -10 M. Bares:. SEM Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Acknowledgments
Agradecemos enormemente las contribuciones de redacción por Cheryl Schaeberle. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de Avon # 02-2009-093 y 02-2011-095, y NIEHS / NIH ES 08314 a AMS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental o de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
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