Introduction
Till skillnad från vanliga 2D kulturer, 3D cellodlings surrogat modeller möjliggör studier av epitelceller beteende i en fysiologiskt relevant sammanhang, en som liknar en vävnad. 3D kulturer av bröstkörteln har hjälpt belysa många aspekter av bröstkörtlarna utveckling och neoplasi. Men de flesta av de 3D-odlingsmodeller för närvarande är tillgängliga är olämpliga för att studera hormonverkan eftersom de humana epiteliala cellinjer som används för uppgiften saknar hormonreceptoruttryck 6,7,9.
Häri beskriver vi en 3D-kultur modell av det mänskliga bröst epitel som är lämplig för att studera hormonverkan 12. Denna modell använder den kommersiellt tillgängliga hormon responsiv human bröst epitelcellinje, T47D 3,11,13, som ursprungligen var härledda från en pleurautgjutning erhållen från en 54 år gammal kvinnlig patient med en infiltrerande duktalt karcinom i bröstet. Vi använder råttsvanskollagen typ 1 som en matris. Denna 3D kulture modell är lämplig för att studera inverkan av de tre huvud mammotropic hormoner (östradiol, promegeston (en analog av progesteron), och prolaktin) på humana bröst epitelceller. Hormon-inducerad epitel morfologi kan utvärderas kvantitativt med tiden genom morfometrisk analys 12.
En lämplig sådd densitet gör att dessa 3D kulturer hållas under 2 veckor. Vid denna tid är tillräckligt för en robust kvantitativ bedömning av hormonverkan på epitel morfologi utvecklingen av strukturer. Geler kan också skördas vid tidigare tidpunkter för celltillväxt och genuttryck analyser. Dessutom är denna modell är lämplig för att testa effekterna av en sekventiell hormonell behandling; till exempel, efter behandling med estradiol under den första veckan och utbyte med andra hormon / kombination av hormoner under den följande veckan. Effekten av östrogenföreningar och antiöstrogener, såsom ICI 182780, kan också Studog använder denna 3D-kultur-modellen 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagenser
- Upplösa den syntetiska progestagen promegeston (R5020) och 17-β-östradiol (E2) i etanol för att göra 10 -3 M förrådslösningar. Upplösa prolaktin i destillerat avjoniserat vatten till en 1 mg / ml stamlösning. Upplösa antiöstrogenet ICI 182780 i DMSO för att göra en 10 -2 M förrådslösning. Lagra dessa lösningar vid -20 ° C i upp till 6 månader.
- Träkol dextran (CD) avskalade serum och CDFBS medium:
- Värmeinaktivering av fetalt bovint serum (FBS) i en 57 ° C vattenbad i 30 min.
Obs! Använd endast syratvättad glas för återstoden av detta protokoll. - Beräkna mängden kol behövs. Med användning av 10% mer volym än den mängd serum för att kompensera för förskjutningen som orsakas av träkol, väger 5% vikt / volym aktivt kolpulver.
- Tvätta träkol två gånger med kallt avjoniserat destillerat vatten med samma volym som mängden av serum. För varje tvätt centrifuge vid 50 xg under 2 minuter för att pelletera träkol. Avlägsna vattnet mellan tvättar. Tillsätt 0,5% vikt / volym Dextran T-70 till den sista kol pellets. Återsuspendera med destillerat, avjoniserat vatten och centrifugera vid 100 xg under 5 min. Aspirera vattnet.
- Tillsätt lämplig volym av serum till pelleten och återsuspendera träkol dextran pelleten i serum. Inkubera, medan valsning (6 rpm), vid 37 ° C i 60 min. Centrifugera vid 2000 xg under 20 min. Om supernatanten grumlig, upprepa centrifugering; kan dock serum inte vara helt klar vid denna tidpunkt men kommer att rensas under filtreringen.
- Filtrera genom ett 0,80 mikron filter och sedan igen genom ett 0,45 mikron filter för att avlägsna större partiklar. Slutligen filter-sterilisera med en 0,20 mikron filter. Store filtreras CDFBS i glasrör eller T-25 odlingsflaskor vid -20 ° C.
- Träkol Dextran Stripped fetalt bovint innehållande medium (CDFBS media): blanda 375 ml fenolrött-fritt DMEM och 125 ml DMEM/ F-12. Avlägsna 37,5 ml och ersätta den med samma volym Charcoal dextran fetalt bovint serum. Tillsätt 10 6 U / ml penicillin och L-glutamin till en 2 mM slutlig koncentration. Den resulterande mediet är 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% Charcoal dextran stripped-FBS, 2 mM L-glutamin och 10 6 U / ml penicillin.
- Värmeinaktivering av fetalt bovint serum (FBS) i en 57 ° C vattenbad i 30 min.
- Förbered 10X PBS, 1 N NaOH och destillerat avjoniserat vatten. Förbered tillräckligt med volym av var och en efter volymen av kollagen lösning behövs. Sterilisera alla lösningar genom filtrering. Lagra 10x PBS och sterilt destillerat avjoniserat vatten vid 4 ° C i upp till en månad. Förvara inte 1N NaOH-lösning.
- Bered kollagen lösning på 1 mg / ml slutkoncentration enligt protokollet för "Alternate Gelning ordningen för Collagen I, råttsvans" som tillhandahålls av tillverkaren. Varje gel är tillverkad av 1,5 ml av kollagenlösningen. Till exempel, förbereda 18,5 ml (0,5 ml till svars för förlust under pipettering) av kollagen lösning för att förbereda12 geler. Använd kollagenlösningen omedelbart eller hålla på is i upp till 2-3 timmar.
- Karmin Alum färgämne:
- Kombinera 1 g Carmine och 2,5 g aluminiumkaliumfosfat i 500 ml destillerat vatten. Koka under omröring under 20 min. Titta noga för att undvika överkokning. Anpassa den slutliga volymen tillbaka till 500 ml med ytterligare destillerat vatten.
- Lägg en kristall tymol för antimikrobiell aktivitet och täcka flaska med aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Filtrera genom en laboratoriekvalitet pappersfilter före varje användning. Återanvända karmin lösning för upp till tre månader. Förvaras vid RT, skyddad från ljus.
- Kollagenaslösning: upplösa kollagenas i DMEM / F12-medium i en koncentration av 0,125% vikt / volym. Förvara inte denna lösning.
2. 3D kultur av T47D-celler i råttsvanskollagen typ 1 Gel och hormonbehandling
Obs: Håll sterila serologiska pipetter och pipettspetsar vid 4 ° C.
- Prepare en encelliga fjädring och utföra en celltal. Split T47D cellkulturer innan de når 70% konfluens. Centrifugera den volym som innehåller den mängd celler som behövs. Tänk på att en gel skall innehålla cirka 75.000 T47D celler.
- Med hjälp av en kall pipett återsuspendera cellpelleten i en lämplig volym av kollagen. Anser att varje gel består av 1,5 ml av kollagen. Blanda cellerna och kollagen försiktigt för att undvika att införa bubblor.
- För att förhindra effekten av statisk elektricitet på cellfördelning, borsta gränser, toppen och botten av den 12-brunnar med en statisk-reducerande borste efter uppackning plattan. För att undvika statisk laddning byggs upp under kontakt med arbets ytan av huven, placera denna platta ovanpå en annan 12-brunnar (blank platta) som också har borstat med den antistatiska minska brush.Gently, häll 1,5 ml av blandningen in i varje brunn på 12-brunnars platta.
- Placera plattan i en inkubator vid 37 ° C under 30 min. avlägsna the plattan från inkubatorn och placera den tillbaka i huven.
- Med hjälp av en P200 steril spets, försiktigt loss gelén i en mild cirkelrörelse från gränsen av brunnen. Gelén bör också lossna från botten av brunnen.
- Utspädda hormoner i CDFBS medier som skall tillsättas till brunnarna. Använd E2 och R5020 vid 10 -10 M slutlig koncentration och prolaktin vid en på 10 -7 M slutlig koncentration. Som kontroll, använd CDFBS medier utan hormoner tillsatta men som fortfarande innehåller den största mängden DMSO lika med hormon lager som används. Se till att varje brunn innehåller 1,5 ml av media. Placera 3D kulturerna inuti en 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet vävnadsodlingsinkubator. Bibehålla kulturerna för 1 eller 2 veckor, ändra media varje 2 dagar.
3. Gel Behandling för hela monteringar
- Avlägsna odlingsmedia och tillsätt 1,5 ml PBS till varje brunn.
- Överför gelén till en bild. Skär gel i hälften med hjälp av en kurvad kirurgiskt blad. Fortsätta bearbetningen med en halv och spara den andra hälften för histologisk analys.
- Överför halv gel för hela montera på en bild. Låt gelén torka i 5 minuter och sedan överföra bilden till en coplinkärlet innehållande 10% formalin.
Obs: alla inkubationer bör ske vid RT. - Fix geler i en coplinkärlet på en skakare O / N.
- Tvätta objektglasen två gånger med PBS under 10 min vardera på skakanordning. Överför objektglasen till 70% EtOH; inkubera under en timme på shaker. Överför diabilder till Carmine Alum O / N.
- Nästa dag, dehydrera diabilder på skakanordning i 70% EtOH, 95% EtOH och 100% EtOH under 1 timme vardera. Överför objektglasen till xylen två gånger under 1 timme varje och hålla på shaker. Använd toluen baserat monteringsmedel för att montera geler och 1,5 mm tjocka Täckglas.
- Undersök hela monteringar under regelbunden ljus (mikroskop eller stereoskop). För en mer detaljerad analys av formen och lumen använder konfokalmikroskopi och visualisera Carmine färgämne med HeNe 633 nm laser.
4. Gel Behandling för bearbetning för histologi analys
- Överför den återstående hälften av gelén till en 20 ml glasflaska innehållande 10% formalin och fastställa om shaker O / N.
- Tvätta gelerna två gånger med PBS under 10 min vardera på skakanordning. Placera geler i bearbetnings kassetter för paraffininbäddning.
- Överför geler till 70% EtOH, inkubera under 1 timme och följ med 95% EtOH under 1 timme, byt till ny 95% EtOH under 1 timme, 100% EtOH under 1 timme, och ändra till färska 100% EtOH under 1 timme. Vid denna punkt, kan geler lagras i 100% EtOH O / N vid RT eller inkuberades med xylen under 1 h och sedan igen i färsk xylen under 1 timme.
- Överföringskassetter paraffin under 1 timme vid 60 ° C i vakuum inkubator, upprepa med färsk paraffin ytterligare två gånger.
- Fyll plastformar med ren paraffin. Öppna kassetten, ta bort gelen och placera den i plastform som innehåller paraffin. Fyll upp med paraffin och lägg ovanpå kassett innehållande etiketten på toppen och låt blocket svalna.
- Ta bort plastic mögel och avsnitt blocket med hjälp av en mikrotom. Skaffa 5 um tjocka sektioner för HE-färgning och immunocytokemi.
5. Utvinning av celler från celler från geler Använda kollagenas behandling
- Ta gel från brunnen och överföra den till en petriskål med PBS. Skölj gel kort.
- Överför gelén till ett 15 ml rör innehållande 2 ml av 0,125% kollagenas. Pipettera upp och ned 4-5 gånger för att bryta gelén i små bitar.
- Inkubera vid 37 ° C under 25 min (tills gelén har lösts upp och cellerna är i suspension)
- Tillsätt 2 ml serum kompletterat odlingsmedium. Samla cellerna genom centrifugering (1000 xg, 5 min), kassera supernatanten, återsuspendera celler och räkna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 sammanfattar förfarandet för framställning av hormonkänslig 3D kulturer. Epitelceller strukturer observeras i hela monteringar av geler odlade i 2 veckor i närvaro av E2 ensam och i kombination med andra hormoner. Endast enskilda celler eller grupper av 2-3 celler är närvarande när inga hormoner tillsätts till odlingsmediet (CDFBS medium) (Figur 2). Detta tillstånd tjänar som en negativ kontroll.
Celler i 3D kultur bildar strukturer som varierar i form, storlek, och lumen närvaro. Fördelningen av strukturer i gelén är typiskt heterogen. Som visats tidigare, finns det i allmänhet flera strukturer längs gränserna gelén än sett i mitten 4. På grund av detta rumsliga heterogenitet bör jämförelser mellan proverna begränsas till motsvarande regioner över prover.
De arter som kollagen typ 1 härrör påverkar fenotypen ennd kvaliteten på de epiteliala strukturerna 5. Råttsvanskollagen typ 1, som den används här, valdes, eftersom ympning i bovint kollagen typ 1 resulterade i bildningen av oorganiserade cellgrupper (Figur 3).
En detaljerad analys av de epiteliala strukturer kan uppnås med användning av konfokalmikroskopi (fig 4). E2 behandlingsresultat i rundade och långsträckta strukturer (Figur 4A). Närvaron av E2 och prolaktin resultat i fler spirande strukturer (Figur 4B), medan närvaron av E2 och promegeston resulterar i oregelbundna strukturer med cellulära utsprång som påminner om sidoförgrenings (Figur 4C). ensam E2 och E2 plus prolaktin tjockna vävnadsstrukturer när den mäts genom tillväxt i z-riktningen, och i jämförelse med dem som observerades i E2 plus promegeston.
För att kvantifiera cellantalet efter hormonbehandling celler är extracted från gelén med användning av kollagenas behandling. Till exempel, med hjälp av denna metod kan vi studera hur antiöstrogen ICI 182.780 hämmar effekten av E2 på celltillväxt i 3D kulturer (Figur 5).
Figur 1. Förfarande för framställning av hormonkänsliga 3D-kulturer. Kortfattat är en enkelcellsuspension av T47D-celler blandades med råttsvanskollagen typ 1 och hälldes i brunnar i en 12-brunnars platta. Gelerna får stelna under 30 minuter i ett 37 ° C / 5% CO2 inkubator. Odlingsmedium tillsätts och gelerna är fristående från brunnen. Kulturer kan skördas efter 1 eller 2 veckor beroende på slutpunkten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2. Hela fästen av 3D-kulturer efter färgning med Carmine Alum färgämne (A) Hela Mount halv gel färgades med karmin alun att visualisera epiteliala strukturer, ett exempel på ROI för bildanalys indikeras av en ruta, WM 3D kulturer som odlas för 2 veckor i (B) CDFBS Media (inget hormoner tillsatta) och (C) CDFBS medium kompletterat med E2 och prolaktin. Skala barer är 5000 m (A) och 500 m (B & C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Jämförelse av matriser som används i 3D-kulturen. (A) Bovine kollagen typ 1 resulterar i oorganiserade kluster av celler, i motsats till de organiserade strukturerna (B) observerades vid användning av råttsvanskollagen typ 1. Skala bar. 100 um klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Confocal bilder av T47D strukturer observerats i 3-D koUagengeler efter 2 veckor. Behandling med (A) E2, (B) E2 + prolaktin och (C) E2 + R5020. Pilarna pekar mot cytoplasmatiska projektioner. Tjocklek av epitelceller strukturer var 24, 40 och 20 pm respektive. Skala bar. 40 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. 3D kulturer behandlades med antingen E2 ensam eller E2 plus ICI 182.780 för en vecka. Cellräkningar efter cell extraktion med kollagenas behandling. (A) CDFBS medium (B) CDFBS medium plus E2 på 1x10 -10 M, (C) ICI 182.780 vid 1x10 -8 M plus E2 på 1x10 -10 M och (D) ICI 182.780 vid 1x 10-7 M plus E2 vid 1x10 -10 M. Bars. SEM klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi uppskattar det redaktionella arbete av Cheryl Schaeberle. Denna forskning stöds av Avon Grants # 02-2009-093 och 02-2011-095, och NIEHS / NIH ES 08.314 till AMS. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of Environmental Health Sciences eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
