Introduction
standart 2D kültürlerin aksine, 3D hücre kültürü vekil modelleri fizyolojik ilgili bağlamda, biri doku andıran epitel hücre davranış çalışma için izin verir. meme bezi 3D kültürleri meme bezi gelişimi ve neoplazi birçok açıdan aydınlatmak yardımcı olmuştur. Ancak, şu anda mevcut 3D kültür modellerinin en görev için kullanılan insan epitel hücre hatları hormon reseptör ifadesini 6,7,9 eksikliği nedeniyle hormon etkisini incelemek için uygun değildir.
Bu yazıda, hormon etkisini 12 incelemek için uygundur insan meme epitel 3D kültür modeli açıklanmaktadır. Bu model, ilk olarak göğüs infiltratif duktal karsinom olan 54 yaşındaki bir kadın hastadan elde edilen bir plöral efüzyonundan elde edilmiştir ticari olarak temin edilebilen hormon duyarlı insan meme epitelyal hücre kuşağı, T47D 3,11,13 kullanır. Bir matris olarak fare kuyruk kolajeni tip 1 kullanın. Bu 3D kültURE modeli insan meme epitelyal hücreleri üzerinde üç mammotropic hormon (estradiyol, promegeston (progesteron bir analog) ve prolaktin) etki çalışma için uygundur. Hormon oluşan epitel morfolojisi morfometrik analizi 12 zamanla miktar olarak tespit edilebilir.
Uygun tohum yoğunluğu, bu 3D kültürler 2 hafta muhafaza edilmesini sağlar. Bu zamana kadar, yapıların geliştirilmesi epitel morfolojisi üzerinde hormon eylem sağlam bir nicel değerlendirilmesi için yeterlidir. Jeller, hücre proliferasyonu için daha önceki zaman noktalarında toplandı edilebilir ve gen ekspresyonu analizi. Buna ek olarak, bu model sıralı bir hormon tedavisinin etkilerini test etmek için uygun olan; örneğin, bir hafta boyunca hormonların diğer hormon / kombinasyonu ile ilk haftasında estradiol ile muamele değiştirildikten sonra. örneğin ICI 182.780 olan östrojenik bileşikler ve antiöstrojenler, etkisi de stu edilebilirBu 3D kültür modeli 12 kullanılarak öldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Reaktiflerin 1. Hazırlık
- 10 -3 M stok solüsyonlar yapmak üzere, sentetik progesteron promegeston (R5020) ve etanol 17 β-estradiol (E2) içinde çözülür. 1 mg / ml stok çözelti yapmak için damıtılmış, deiyonize su içinde prolaktin eritin. 10 -2 M stok çözelti yapmak için DMSO içinde antiöstrojen ICI 182.780 eritin. en fazla 6 ay süreyle -20 ° C'de bu çözümleri saklayın.
- Kömür dekstran (CD) serum ve CDFBS orta elimden:
- 30 dakika boyunca 57 ° C su banyosu içinde cenin sığır serumu (FBS) ısı etkisiz hale getirirler.
Not: kullan Bu protokolün geri kalanı için sadece asitle yıkanmış cam. - ihtiyaç duyulan kömür miktarını hesaplayın. , Kömür nedeniyle yerinden telafi% 5 ağırlık / hacim toz kömür aktif tartmak serum miktarının% 10'undan fazla hacim kullanma.
- serum miktarı aynı hacim kullanılarak soğuk deiyonize distile su ile iki kez kömür yıkayın. Her yıkama ckömür pelet 2 dakika 50 xg'de entrifuge. yıkar arasında su çıkarmak. Son karbon pelet,% 0.5 ağırlık / hacim Dekstran T-70 ekleyin. 5 dakika boyunca 100 x g'de damıtılmış, iyonu giderilmiş su ve santrifüj ile yeniden askıya. su aspire.
- pelet serum uygun hacim kazandırmak ve serum içine kömür dekstran pelet yeniden askıya. 60 dakika boyunca 37 ° C'de, (6 RPM) hareket ettirirken, inkübe edin. 20 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant bulutlu görünürse, santrifüj tekrarlayın; Ancak, serum, şu anda tamamen net olmayabilir ama filtrasyon sırasında temizlenecektir.
- Daha büyük parçacık maddenin ayrılması için 0.45 mikronluk bir filtreden sonra tekrar 0.80 mikronluk bir filtreden filtre edilir ve. Son olarak, 0.20 mikron filtre ile filtre sterilize edin. Mağaza -20 ° C'de cam tüpler ya da T-25 kültür şişelerinde CDFBS süzülür.
- Kömür Dekstran fetal ortamı (CDFBS ortamı) Sığır içeren Soyulmuş: fenol kırmızısı içermeyen DMEM 375 ml ve DMEM 125 ml karışımı/ F-12. 37.5 ml çıkarın ve Kömür Dextran Stripped Fetal Sığır serum aynı hacimde ile değiştirin. 2 mM nihai bir konsantrasyona kadar 10 6 U / ml penisilin ve L-glutamin ekleyin. Elde edilen ortam% 75 DMEM,% 25 DMEM / F-12,% 7.5 kömür dekstran soyulmuş FBS, 2 mM L-glutamin ve 10 6 U / ml penisilin.
- 30 dakika boyunca 57 ° C su banyosu içinde cenin sığır serumu (FBS) ısı etkisiz hale getirirler.
- 10X PBS, 1 N NaOH ve damıtılmış iyonu giderilmiş su hazırlayın. gerekli kollajen çözüm hacmine göre her yeterli hacim hazırlayın. filtreleme bütün çözümleri sterilize edin. 1 aya kadar 4 ° C 'de 10 x PBS ve steril damıtılmış iyonu giderilmiş su saklayın. 1N NaOH çözeltisi tutmayın.
- Üretici tarafından sağlanan "Kollajen I, fare kuyruk için alternatif Jelleşme Prosedürü" protokolüne göre 1 mg / ml nihai konsantrasyonda, kolajen çözeltisi hazırlayın. Her bir kolajen jel çözeltisi, 1.5 ml yapılmıştır. Örneğin hazırlanması için kollajen çözeltisi (pipetleme sırasında hasar hesaba 0.5 mi) 18.5 ml hazırlanması12 jeller. hemen kollajen çözümü kullanın veya en fazla 2-3 saat buz üzerinde tutun.
- Carmine Şap boya:
- 500 ml damıtılmış su içinde 1 gr Carmine ve 2.5 g alüminyum potasyum sülfat birleştirin. 20 dakika boyunca karıştırılarak kaynatılır. üzerine kaynar önlemek için dikkatle izleyin. Ek damıtılmış su ile geri 500 ml son ses seviyesini ayarlayın.
- antimikrobiyal aktivitesi için timol bir kristal ekleyin ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile bir şişe kapağı. Her kullanımdan önce, bir laboratuvar sınıfı kağıt filtre içinden filtre ediniz. en fazla üç ay süreyle karmin çözümü tekrar kullanın. Oda sıcaklığında, ışıktan korunmalıdır.
- Kolagenaz çözelti: a / h% 0.125'lik bir konsantrasyonda DMEM / F12 ortamı içinde kolajenaz çözülür. Bu çözüm tutmayın.
Sıçan Kuyruk Kollajen Tip 1 jeller ve Hormon Tedavisi 2. 3D Kültür T47D hücreleri
Not: 4 ° C'de steril serolojik pipetler ve pipet uçları tutun.
- PrepaBir tek hücre süspansiyonu tekrar ve hücre sayımı gerçekleştirin. Bölünmüş T47D hücre kültürleri onlar% 70 izdiham ulaşmadan. gerekli hücrelerin miktarını içeren birim santrifüj. bir jel yaklaşık 75.000 T47D hücreleri içermesi gerektiğini düşünün.
- Soğuk pipet kullanarak, kollajen, uygun hacimde hücre pelletini yeniden askıya. Her bir kolajen jel 1.5 ml oluşur düşünün. kabarcıkları almaktan kaçınması yavaşça hücreleri ve kollajen karıştırın.
- , Hücre dağılımı üzerinde statik elektriğin etkisini önlemek plaka unwrapping sonra bir statik düşürücü fırça ile 12 plaka sınırları, üst ve alt fırçalayın. başlık çalışma yüzeyi ile temas sırasında statik yük birikmesini önlemek için, statik düşürücü brush.Gently fırçalanmış edilmiş bir 12-çukurlu bir tablaya (boş levha) üzerine, bu plaka yerleştirmek karışımı 1.5 ml dökün 12 oyuklu plakanın her oyuğuna.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir kuluçka plaka koyun. th kaldıre inkübatör plaka ve kaputu geri yerleştirin.
- P200 steril ucu kullanarak, dikkatle kuyunun sınırına yumuşak dairesel hareketlerle jel ayırın. bir jel kuyunun dibinden ayırmak gerekir.
- CDFBS medya seyreltilir hormonlar oyuklara ilave edin. 10 7 M son konsantrasyonda bir bir 10 -10 M son konsantrasyon ve prolaktin E2 ve R5020 kullanın. Kontrol olarak, katma hormonların ama hala kullanılan hormon stoklarının eşit DMSO yüksek ses içeren olmadan CDFBS ortamını kullanın. Her iyi medya 1.5 ml içerdiğinden emin olun. 37 ° C,% 5 CO2,% 100 içinde 3B kültürleri yerleştirin nem doku kültürü inkübatör. her 2 günde bir ortam değiştirme, 1 ya da 2 hafta kültür koruyun.
Tüm Mounts 3. Jel İşleme
- Kültür ortamını çıkarın ve her bir oyuğa, PBS, 1.5 ml ekleyin.
- Bir slayta jel aktarın. Bir eğrisi kullanılarak yarısında jel kestid cerrahi bıçak. yarısı ile işleme devam edin ve histolojik analiz için diğer yarısını kaydedin.
- Bütün bir slayt monte yarım jel aktarın. 5 dakika boyunca jel kurumaya bırakın ve daha sonra% 10 formalin içeren bir coplin kavanoza slayt aktarın.
Not: Bütün inkübasyonlar oda sıcaklığında yapılmalıdır. - Bir sallama O / N bir coplin kavanoza jeller sabitleyin.
- Yıkama çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri için iki kez PBS ile. Aktarım% 70 EtOH için slaytlar; çalkalayıcı üzerinde 1 saat süreyle inkübe edin. Carmine Şap O / N Transfer slaytlar.
- Bir sonraki gün, 1 saat için her% 70 EtOH,% 95 EtOH ve% 100 EtOH içinde bir karıştırıcı üzerinde slaytlar dihidrat. Transferi iki kez 1 saat her ksilen ve çalkalayıcı üzerinde tutmak için slaytlar. jeller ve 1.5 mm kalınlığında lamelleri monte toluen bazlı montaj ortamı kullanın.
- Düzenli ışık (mikroskop veya stereoskop) kapsamında tüm bağlar inceleyin. şekil ve lümen daha ayrıntılı bir analizi için konfokal mikroskopi kullanımı ve HeNe 633 nm lazer ile Carmine boya görselleştirmek.
Histoloji Analiz İşleme 4. Jel İşleme
- % 10 formalin içeren 20 ml'lik bir cam şişeye jel kalan yarısı aktarın ve çalkalama O / N üzerine sabitlenir.
- çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri için iki kez PBS ile jeller yıkayın. parafine için işlem kasetleri içine yerleştirin jeller.
- % 70 EtOH transfer jeller, 1 saat boyunca inkübe edilir ve 1 saat için% 95 EtOH ile izleyin, 1 saat boyunca, taze% 95 EtOH değiştirmek,% 100 EtOH, 1 saat ve 1 saat süre ile, taze% 100 EtOH değiştirin. 1 saat boyunca, taze ksilen içinde yeniden Bu noktada, jeller oda sıcaklığında% 100 EtOH O / N depolanabilir ya 1 saat süreyle ksilen ile inkübe edilir ve.
- Aktarım kasetleri iki kez daha fazla taze parafin ile tekrar vakum inkübatöründe 60 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca Parafin.
- temiz parafin ile plastik kalıp doldurun. , Kaseti açın jel çıkarın ve plastik kalıp içeren parafin yerleştirin. parafin ile doldurun ve üstüne etiketi içeren kasetin üst eklemek ve blok soğumaya bırakın.
- plast kaldıric kalıp ve bölüm mikrotom kullanılarak blok. HE boyama ve immünsitokimya 5 um kalınlığında kesitler elde edin.
Kollajenaz muamelesi kullanılarak jellerden hücreleri hücreleri 5. Ekstraksiyon
- kuyudan jel çıkarın ve PBS içeren bir petri tabağına aktarın. Durulayın jel kısaca.
- % 0.125 kolajenaz 2 ml içeren 15 ml'lik bir tüpe jel aktarın. küçük parçalar halinde jel kırmak için yukarı pipet ve aşağı 4-5 kez.
- 25 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir (jel eritildi ve hücreler, süspansiyon içinde olan kadar)
- Serum takviyeli kültür ortamında 2 ml ilave edilir. santrifüj (1.000 xg, 5 dk), ıskarta süpernatant hücreleri toplamak, hücrelerin yeniden askıya ve saymak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, hormona duyarlı 3D kültürleri hazırlanması için prosedürü özetlenmektedir. Epitel yapıları yalnız E2 mevcudiyetinde 2 hafta kültürlendi ve hormonlar ile kombinasyon içinde jeller, tüm bağlar gözlenmektedir. Resim hormonlar kültür ortamında (CDFBS ortamı) (Şekil 2) eklendiğinde sadece tek hücreler veya 2-3 hücre grupları bulunmaktadır. Bu durum, bir negatif kontrol olarak hizmet etmektedir.
şekil, boyut, ve lümen mevcudiyetinde farklılık 3D kültür şekilde yapılarda hücreler. jelde yapıların dağılımı tipik heterojendir. Daha önce gösterildiği gibi, merkezi 4'te görülen daha jel sınırları boyunca genel olarak daha yapılar vardır. Çünkü bu mekansal heterojenite, numuneler arasında karşılaştırmalar numuneler üzerinde bölgeleri karşılık gelen sınırlı olmalıdır.
kollajen tip 1 Etkiler fenotip a türetildiği türlerElde edilen epitel yapılarının 5 nd kalitesi. Burada kullanıldığı haliyle fare kuyruk kolajeni tip 1, düzensiz hücre grupları (Şekil 3) oluşumu ile sonuçlandı edilmiş sığır kollajeni tip 1 'de tohumlama yana seçilmiştir.
Epitel yapılarının ayrıntılı bir analiz konfokal mikroskobu (Şekil 4) kullanılarak elde edilebilir. Yuvarlak ve uzamış yapılar (Şekil 4A) E2 tedavi sonuçları. E2 ve fazla tomurcuklanan yapılar (Şekil 4B) prolaktin sonuçlar varlığı iken, yan andıran hücre çıkıntılar (Şekil 4C) ile birlikte bulunan düzensiz yapıları E2 ve promegeston sonuçlanmaktadır. Z-yönünde büyüme ile ölçüldüğünde, ve E2 artı promegeston gözlenen olanlar ile karşılaştırıldığında yalnız E2 ve E2 artı prolaktin doku yapıları kalınlaşır.
Hormon tedavisi sonra hücre sayısını belirlemek için, hücreler ekstrakt olankollajenaz muamelesi kullanılarak kolloidden D. Örneğin, bu yöntemi kullanarak biz anti-östrojen ICI 182.780 3D kültürlerde hücre çoğalması üzerine E2 etkisini (Şekil 5) inhibe nasıl çalışabiliriz.
Şekil hormona duyarlı 3D kültürlerinin hazırlanması için 1. Yöntem. Kısaca, T47D hücrelerinde bir tek hücre süspansiyonu fare kuyruk kolajeni tip 1 ile karıştırıldı ve 12 gözlü bir plaka gözlerine içine dökülmüştür. jeller 37 ° C /% 5 CO2 inkübatöründe 30 dakika boyunca katılaşması için izin verilir. Kültür ortamı ilave edildi ve jeller, oyuk ayrılır. Kültürler son noktaya göre 1 veya 2 hafta sonra hasat edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Carmine Şap boya ile boyandıktan sonra 3D kültürlerin Şekil 2. Tüm bağlar epitel yapıları, morfoloji analizi için ROI bir örnek görselleştirmek için karmin şap ile boyanmış yarım jel (A) Tüm montaj bir kutu ile gösterilir; 3D kültürlerin WM 2 hafta (B) yetiştirilen E2 ve prolaktin ile takviye edilmiş ortam (eklenmiş hormon) ve (C) CDFBS ortamı CDFBS. Ölçek çubukları 5.000 mikron (A) ve 500 mikron (B & C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3D kültüründe kullanılan matris Şekil 3. karşılaştırması. (A) Bovi. 100 mikron: sıçan kuyruğu kollajen tip 1 Ölçek çubuğu kullanırken ne kollajen tip örgütlü yapılar (B) karşıt olarak hücrelerin düzensiz kümeler, 1 sonuç gözlenen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
(A), E2, (B), E2 + prolaktin ve (C) E2 + R5020 ile 2 hafta. Işlemden sonraki 3-D kollajen jel gözlenen T47D yapıları Şekil 4. Konfokal ve görüntüler. Oklar sitoplazmik projeksiyonlar etmektedir. epitel yapılarının kalınlığı sırasıyla 24, 40 ve 20 mikron idi. Ölçek çubuğu:. 40 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. 3D kültürleri yalnız E2 ile tedavi veya E2 artı ICI 182780 1 hafta. Hücre sayımı kollajenaz tedavi kullanarak hücre çıkarma sonra. (A) orta CDFBS, (B) -10 E, 1x 10-7 M artı E2 de 1x10 -10 M ve (D) ICI 182780 de 1x10 -8 M artı E2 (C) ICI 182.780 1x10 de orta artı E2 CDFBS 1x10 -10 M. de Barlar:. SEM bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz büyük ölçüde Cheryl Schaeberle tarafından editoryal katkıları için teşekkür ederiz. Bu araştırma Avon Hibe # 02-2009-093 ve 02-2011-095 ve AMS NIEHS / NIH ES 08314 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
