Una cultura Modello 3D Ormone-sensibile della Human ghiandola mammaria Epithelium

Introduction

Diversamente culture standard 2D, modelli surrogati di coltura cellulare 3D permettono lo studio del comportamento delle cellule epiteliali in un contesto fisiologicamente rilevanti, uno simile a un tessuto. culture 3D della ghiandola mammaria hanno contribuito a chiarire molti aspetti dello sviluppo della ghiandola mammaria e neoplasie. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di coltura 3D attualmente disponibili non sono adatti per studiare l'azione ormonale perché le linee di cellule epiteliali umane utilizzate per l'attività carenti dell'ormone del recettore espressione ^6,7,9.

Qui, descriviamo un modello di coltura 3D dell'epitelio mammario umano che è adatto per studiare l'azione dell'ormone ^12. Questo modello utilizza la linea commercialmente disponibile ormono-sensibile umano epiteliali seno cellule, T47D ^3,11,13, originariamente derivato da un versamento pleurico ottenuto da 54 anni paziente con un carcinoma duttale infiltrante della mammella. Usiamo ratto collagene coda di tipo 1 come matrice. Questo culto 3DModello ure è appropriato per lo studio dell'azione dei tre principali ormoni mammotropic (estradiolo, promegestone (un analogo di progesterone), e prolattina) sulle cellule epiteliali del seno umane. Ormone-indotta morfologia epiteliale può essere valutata quantitativamente nel tempo da analisi morfometrica ^12.

Una densità di semina adeguato permette a queste culture 3D per essere conservati per 2 settimane. A questo punto, lo sviluppo di strutture è sufficiente per un robusto valutazione quantitativa dell'azione ormonale sulla morfologia epiteliale. I gel possono essere raccolte in momenti precedenti per la proliferazione cellulare e le analisi di espressione genica. Inoltre, questo modello è adatto per testare gli effetti di un trattamento ormonale sequenziale; per esempio, dopo il trattamento con estradiolo durante la prima settimana e la sostituzione con altro ormone / combinazione di ormoni durante la settimana seguente. L'effetto dei composti estrogenici e antiestrogeni, come ICI 182,780, può anche essere Stuè morto con questa cultura modello 3D ^12.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti

1. Sciogliere il promegestone sintetico progestinico (R5020) e 17-β-estradiolo (E2) in etanolo per fare 10 ^-3 soluzioni madre M. Sciogliere prolattina in acqua deionizzata distillata per fare un / Soluzione 1 mg ml. Sciogliere il antiestrogeno ICI 182,780 in DMSO per ottenere una soluzione stock 10 ^-2 M. Conservare queste soluzioni a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
2. Carbone destrano (CD) messo a nudo siero e medie CDFBS:
   1. Calore inattivare siero bovino fetale (FBS) in un bagno di acqua 57 ° per 30 min.
      Nota: utilizzare solo vetreria d'acido per il resto di questo protocollo.
   2. Calcolare la quantità di carbone necessaria. Utilizzando 10% di volume rispetto alla quantità di siero per compensare lo spostamento causato dal carbone, pesare 5% peso / volume carbone attivo in polvere.
   3. Lavare carbone due volte con acqua distillata deionizzata fredda utilizzando lo stesso volume come la quantità di siero. Per ogni lavaggio centrifuge a 50 g per 2 minuti per far sedimentare il carbone. Rimuovere l'acqua tra un lavaggio. Aggiungere 0,5% peso / volume Destrano T-70 all'ultimo pellet carbone. Risospendere con acqua distillata, acqua deionizzata e centrifugare a 100 xg per 5 min. Aspirare l'acqua.
   4. Aggiungere il volume appropriato di siero al pellet e risospendere il pellet carbone destrano nel siero. Incubare, durante il rotolamento (6 giri), a 37 ° C per 60 min. Centrifugare a 2000 xg per 20 min. Se surnatante appare torbida, ripetere la centrifugazione; tuttavia, siero non sia completamente chiaro in questo momento, ma verrà eliminato durante la filtrazione.
   5. Filtrare attraverso un filtro 0,80 micron e poi di nuovo attraverso un filtro da 0,45 micron per rimuovere le particelle più grandi. Infine, filtro sterilizzare con filtro 0.20 micron. Conservare CDFBS in tubi di vetro o T-25 fiasche di coltura filtrato a -20 ° C.
   6. Carbone Destrano Stripped fetale bovino contenenti supporti (CDFBS media): miscelare 375 ml di fenolo rosso-libero DMEM e 125 ml di DMEM/ F-12. Rimuovere 37,5 ml e sostituirlo con lo stesso volume di carbone Destrano Stripped siero fetale bovino. Aggiungere 10 ⁶ U / ml di penicillina e L-glutammina per 2 mm concentrazione finale. I media risultante è del 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, il 7,5% del carbone di legna destrano spogliato-FBS, 2 MM L-glutammina, e 10 ⁶ U / ml di penicillina.
3. Preparare 10X PBS, 1N NaOH e acqua deionizzata distillata. Preparare sufficiente volume di ciascuna funzione del volume di soluzione di collagene necessario. Sterilizzare tutte le soluzioni di filtraggio. Conservare il 10X PBS e acqua deionizzata sterile distillata a 4 ° C per un massimo di 1 mese. Non conservare la soluzione di NaOH 1N.
4. Preparare la soluzione di collagene a 1 mg / ml concentrazione finale secondo il protocollo per la "Procedura gelificazione alternativa per collagene I, coda di topo", fornito dal produttore. Ogni gel è costituito da 1,5 ml di soluzione di collagene. Ad esempio, preparare 18,5 ml (0,5 ml per tenere conto di perdite durante il pipettaggio) di soluzione di collagene per preparare12 gel. Utilizzare la soluzione di collagene immediatamente o tenere in ghiaccio per un massimo di 2-3 ore.
5. Carmine Alum dye:
   1. Combina 1 g Carmine e 2,5 g di solfato di potassio e alluminio in 500 ml di acqua distillata. Ebollizione agitazione per 20 min. Guarda con attenzione per evitare bollente. Regolare il volume finale di nuovo a 500 ml con acqua distillata aggiuntivo.
   2. Aggiungere un cristallo di timolo per l'attività antimicrobica e coprire bottiglia con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Filtrare su un filtro di carta di laboratorio di grado prima di ogni utilizzo. Riutilizzare la soluzione Carmine per un massimo di tre mesi. Conservare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
6. soluzione di collagenasi: sciogliere collagenasi in medium / F12 DMEM ad una concentrazione di 0,125% w / v. Non conservare questa soluzione.

2. La cultura 3D di T47D celle a coda di ratto collagene di tipo 1 Gel e trattamento ormonale

Nota: tenere pipette sierologiche sterili e punte per pipette a 4 ° C.

1. Prepare una cella singola sospensione ed eseguire una conta cellulare. colture cellulari Split T47D prima di raggiungere il 70% di confluenza. Centrifugare il volume che contiene la quantità di cellule necessarie. Si consideri che un gel dovrebbe contenere circa 75.000 T47D cellule.
2. Usando una pipetta a freddo, risospendere il pellet cellulare in volume appropriato di collagene. Si consideri che ciascun gel è costituito da 1,5 ml di collagene. Mescolare le cellule e il collagene delicatamente per evitare l'introduzione di bolle.
3. Per impedire l'effetto di elettricità statica sulla distribuzione delle celle, spazzolare i bordi, superiore e inferiore della piastra 12 pozzetti con una spazzola statica di riduzione dopo scartare la piastra. Per evitare la formazione di elettricità statica durante il contatto con la superficie di lavoro della cappa, collocare il piatto sopra l'altro 12-pozzetti (piatto vuoto) che è stato anche spazzolato con il brush.Gently statico-riduzione, versare 1,5 ml della miscela in ogni pozzetto della piastra 12 pozzetti.
4. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min. rimuovere °e piastra dall'incubatore e rimetterlo nella cappa.
5. Utilizzando una punta sterile p200, staccare con cura il gel in un delicato movimento circolare dal bordo del pozzo. Il gel deve anche staccare dal fondo del pozzo.
6. Diluire ormoni nei media CDFBS da aggiungere ai pozzetti. Utilizzare E2 e R5020 ad una concentrazione finale di 10 ^-10 M e prolattina a a 10 ^-7 M concentrazione finale. Come controllo, utilizzare supporti CDFBS senza ormoni aggiunto, ma ancora contenente il più alto volume di DMSO pari alle scorte ormone utilizzato. Assicurarsi che ogni pozzetto contiene 1,5 ml di media. Collocare le culture 3D all'interno di un 37 ° C, 5% CO _2, 100% umidità tessuto cultura incubatore. Mantenere le culture per 1 o 2 settimane, cambiando i media ogni 2 giorni.

3. Il trattamento del gel per l'intero Monti

1. Rimuovere terreni di coltura e aggiungere 1,5 ml di soluzione salina in ogni pozzetto.
2. Trasferire il gel ad una diapositiva. Tagliare il gel a metà con una curvad lama chirurgica. Continuare il trattamento con una metà e salvare l'altra metà per l'analisi istologica.
3. Trasferire la metà di gel per tutto il monte a una diapositiva. Lasciare asciugare il gel per 5 minuti e poi trasferire la diapositiva di una vaschetta Coplin contenente il 10% di formalina.
   Nota: tutte le fasi di incubazione dovrebbe essere fatto a temperatura ambiente.
4. Fissare gel in una vaschetta Coplin su un agitatore O / N.
5. Lavare i vetrini due volte con PBS per 10 minuti ciascuno su agitatore. Trasferire i vetrini al 70% EtOH; incubare per 1 ora su agitatore. scivoli Trasferire Carmine Alum O / N.
6. Il giorno successivo, disidratano scorre su shaker in 70% EtOH, 95% EtOH e 100% EtOH per 1 ora ciascuno. Trasferire i vetrini a xilene due volte per 1 ora ogni e continuare a shaker. Utilizzare a base di toluene mezzo di montaggio per montare i gel e 1,5 mm di spessore coprioggetto.
7. Esaminare i supporti interi in condizioni di luce normale (microscopio o stereoscopio). Per un'analisi più dettagliata della forma e lume di utilizzare la microscopia confocale e visualizzare Carmine tintura con HeNe 633 nm laser.

4. Il trattamento gel per l'elaborazione di analisi Istologia

1. Trasferire la restante metà del gel di un flaconcino di vetro da 20 ml contenente 10% di formalina e fissare sulla agitatore O / N.
2. Lavare gel due volte con PBS per 10 minuti ciascuno su agitatore. Luogo gel in cassette di elaborazione per paraffina.
3. gel Trasferire il 70% EtOH, incubare per 1 ora e seguono con il 95% EtOH per 1 ora, cambiano al fresco 95% EtOH per 1 ora, 100% EtOH per 1 ora, e cambiare al fresco 100% EtOH per 1 ora. A questo punto, i gel possono essere conservati in 100% EtOH O / N a RT o incubate con xilene per 1 ora e poi di nuovo in xilene fresco per 1 ora.
4. cassette di trasferimento di paraffina per 1 ora a 60 ° C in incubatore vuoto, ripetere con paraffina fresco due volte.
5. Riempire stampi in plastica con paraffina pulito. Aprire il cassetto, rimuovere il gel e metterlo nello stampo contenente paraffina plastica. Riempire con paraffina e aggiungere superiore del cassetto contenente l'etichetta sulla parte superiore e lasciare blocco freddo.
6. Rimuovere il plastmuffa ic e la sezione del blocco utilizzando un microtomo. Ottenere 5 um sezioni spesse per HE colorazione e immunocitochimica.

5. estrazione di cellule da cellule dal gel utilizzando un trattamento Collagenasi

1. Rimuovere il gel dal pozzo e trasferirlo ad una piastra di Petri contenente PBS. brevemente gel di risciacquo.
2. Trasferire il gel ad una provetta da 15 ml contenente 2 ml di 0,125% collagenasi. Pipettare su e giù 4-5 volte per rompere il gel in piccoli pezzi.
3. Incubare a 37 ° C per 25 min (fino gel si è sciolto e cellule sono in sospensione)
4. Aggiungere 2 ml di siero integrato terreno di coltura. Raccogliere le cellule per centrifugazione (1.000 xg, 5 min), il surnatante scarti, risospendere le cellule e contare.

Representative Results

La Figura 1 riassume il procedimento per la preparazione delle culture 3D ormone-sensibile. strutture epiteliali sono osservati in interi monti del gel in coltura per 2 settimane in presenza di E2 da solo e in combinazione con altri ormoni. Solo le cellule singole o gruppi di 2-3 cellule sono presenti quando ormoni vengono aggiunti al mezzo di coltura (media CDFBS) (Figura 2). Questa condizione serve come controllo negativo.

Le cellule in strutture di forma cultura 3D che variano per forma, dimensione e presenza lumen. La distribuzione delle strutture nel gel è tipicamente eterogenea. Come illustrato in precedenza, ci sono generalmente più strutture lungo i confini del gel di quanto visto al centro ^4. A causa di questa eterogeneità spaziale, confronti tra i campioni devono essere limitati alle regioni corrispondenti tra i campioni.

Le specie da cui collagene di tipo 1 è derivato influenza il fenotipo di unnd qualità delle risultanti strutture epiteliali ^5. Rat coda collagene di tipo 1, come qui utilizzato, è stato scelto poiché semina in bovini collagene di tipo 1 provocato formazione di gruppi di cellule disordinati (Figura 3).

Un'analisi dettagliata delle strutture epiteliali può essere raggiunto utilizzando la microscopia confocale (Figura 4). Risultati del trattamento E2 in strutture arrotondate e allungate (Figura 4A). La presenza di E2 e risultati prolattina in strutture germoglianti più (Figura 4B), mentre la presenza di E2 e risultati promegestone in strutture irregolari con proiezioni cellulari ricordano lato ramificazione (Figura 4C). solo E2 ed E2, più prolattina addensare strutture dei tessuti se misurato dalla crescita nella direzione z, e rispetto a quelli osservati nella E2 più promegestone.

Al fine di quantificare il numero di cellulare dopo un trattamento ormonale, le cellule sono extracted dal gel mediante trattamento collagenasi. Ad esempio, con questo metodo si può studiare come l'antiestrogeno ICI 182,780 inibisce l'effetto di E2 sulla proliferazione delle cellule nelle colture 3D (Figura 5).

Figura 1. Procedimento per la preparazione di colture 3D ormone-sensibile. Brevemente, una cella singola sospensione di cellule T47D è mescolato con coda di ratto collagene di tipo 1 e versata in pozzetti di una piastra 12 pozzetti. I gel possono congelare per 30 min a 37 ° C / 5% CO2 incubatore. Terreno di coltura viene aggiunto ei gel sono staccato dal pozzo. Le culture possono essere raccolte dopo 1 o 2 settimane a seconda del punto finale. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

. Figura 2. monti interi di culture 3D dopo colorazione con colorante Carmine Allume (A) tutto il monte di mezzo gel colorato con Carmine allume per visualizzare le strutture epiteliali, un esempio di ROI per l'analisi della morfologia è indicato da una scatola; WM di culture 3D coltivato per 2 settimane in (B) CDFBS Media (senza ormoni aggiunti) e (C) CDFBS multimediale integrato con E2 e prolattina. Barre di scala sono 5.000 micron (A) e 500 micron (B & C). Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Confronto delle matrici utilizzate nella cultura 3D. (A) BoviNE collagene di tipo 1 risultati in gruppi disorganizzati di cellule, in contrasto con le strutture organizzate (B) osservato quando si utilizza coda di topo collagene di tipo bar 1. Scala:. 100 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. immagini confocali strutture T47D osservata in 3-D gel di collagene dopo 2 settimane. Il trattamento con (A) E2, (B) + E2 prolattina e (C) E2 + R5020. Le frecce indicano le proiezioni citoplasmatici. Spessore delle strutture epiteliali era 24, 40 e 20 micron rispettivamente. Barra di scala:. 40 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. culture 3D trattati con sola E2 o E2 più ICI 182,780 per 1 settimana. Conta delle cellule dopo l'estrazione delle cellule utilizzando un trattamento collagenasi. (A) CDFBS media, (B) CDFBS medio più E2 a 1x10 ^-10 M, (C) ICI 182,780 a 1x10 ^-8 M plus E2 a 1x10 ^-10 M e (D) ICI 182,780 a 1x ^10-7 M plus E2 a 1x10 ^-10 M. Bar:. SEM Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well Tissue Culture Plates (Falcon)	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml polystyrene conical Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Activated Charcoal	Sigma	C-5510
Carmine Alum	Sigma	C1022-100G
Collagenase, Type 3	Worthington	S0C11784
Confocal Microscope	Zeiss	LSM510	Equiped with HeNe 633nm laser
Dextran T-70	Abersham/Pharmacia	17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Life Technologies	11339-021	Phenol red-free media for hormone use
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Life Technologies	11054-020	Phenol red-free media for hormone use
17-β-Estradiol	EMD Millipore	3301	Dissolved in Ethanol
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30070.03	For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped
Filters (115 ml)	Nalgene	380-0080, 245-0045, 120-0020	0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively
Formalin, 10%	Fisher Scientific	SF93-20
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030-081
ICI 182,780 (fulvestrant)	Sigma Aldrich	I4409-25MG	Dissolved in DMSO
Microtome	Leica	RM2155
Tissue embedding media	McCormick Scientific	39502004
Penicillin	Sigma	7794-10MU	Dissolved in 10 ml of distilled deionized water
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
Phosphate Buffered Saline pH 7.4	Sigma Aldrich	P3813-10PAK
Prolactin	Sigma Aldrich	L4021-50UG	Dissolved in distilled deionized water
Promegestone	Perkin Elmer	NLP004005MG	Dissolved in Ethanol
Rat-Tail Collagen	Corning	354236	Lots may contain varying concentrations, note accordingly
Scalpel	Miltex	4311
Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor	Leica	TP1020
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Prepare 1N NaOH stock
StaticMaster Anti-static brush	Amstat	C3500
Stripette Serological Pipettes	Corning	4101
T-25 flasks	Corning	430168
Tissue Cassettes	Fisher Scientific	15-200-403E
Wheaton Vials, Glass, 20 ml	Fisher Scientific	03-341-25D
Xylene	VWR	95057-822