Introduction
不同于标准的2D文化，3D细胞培养替代模型允许的上皮细胞行为生理相关方面，一是类似组织的研究。乳腺三维培养有助于阐明乳腺发育和肿瘤的许多方面。然而，大多数现有的三维培养模型的不适合学习激素的作用，因为用于该任务的上皮细胞缺乏激素受体 表达6,7,9。
在此，我们描述了人类乳腺上皮细胞，适合研究激素作用12的三维培养模型。该模型采用的可商购的激素响应性人乳腺上皮细胞系，T47D 3,11,13，其最初从与乳房的浸润性导管癌从54岁的女性患者获得的胸腔积液而得。我们使用鼠尾胶原1型作为基质。这种3D崇拜URE模型适合于对人乳腺上皮细胞中的三个主要mammotropic激素（雌二醇，promegestone（孕酮类似物），和催乳素）的作用的研究。激素诱导的上皮形态可以定量随时间通过形态分析12进行评估。
适当的接种密度允许保持2周这些3D培养。而此时，结构的发展是足以对上皮形态激素作用的强大的定量评估。凝胶也可以在较早的时间点收获细胞增殖和基因表达分析。此外，这种模式是合适的测试顺序激素治疗的效果;例如，在第一周期间用雌二醇处理和置换在随后一周激素等激素/组合之后。雌激素化合物和抗雌激素，例如ICI 182,780的效果，也可以苹果塞进袋子使用这种三维培养模型12死亡。
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Protocol
1.试剂的制备
- 溶解合成的孕激素promegestone（R5020）并在乙醇中17-β雌二醇（E2），以使10 -3 M储备溶液。溶解于去离子蒸馏水催乳素，制成1毫克/毫升储液。溶解抗雌激素的ICI 182,780在DMSO中，制成10 -2米原液。长达6个月的储存在-20℃下这些解决方案。
- 木炭右旋糖酐（CD）剥离血清和CDFBS介质：
- 在57℃水浴热灭活胎牛血清（FBS）30分钟。
注：仅使用了本协议的剩余部分酸洗玻璃器皿。 - 计算出所需的木炭的量。使用比血清的量多10％的体积，以补偿所引起的木炭的位移，称量5％重量/体积活性木炭粉。
- 使用相同体积的血清的量冷的去离子蒸馏水洗涤木炭两次。对于每一个洗Çentrifuge在50×g离心2分钟以沉淀木炭。除去洗涤之间的水。添加0.5％重量/体积葡聚糖T-70到最后木炭颗粒。用蒸馏水，去离子水和离心机在100×g离心5分钟重新暂停。吸出的水。
- 血清的适当体积添加到沉淀和重新悬浮的木炭葡聚糖沉淀成血清。孵育，而轧件（6 RPM），在37ºC60分钟。离心在2000 xg离心20分钟。如果出现上清液浑浊，重复离心;然而，血清可能不会在这个时候完全清楚，但过滤期间将被清除。
- 通过一个0.80微米的过滤通过0.45微米的过滤器过滤，然后再次以除去较大的颗粒物质。最后，用0.20微米的过滤器过滤，消毒。储存于-20ºC过滤在玻璃管或T-25培养瓶中CDFBS。
- 木炭葡聚糖剥离含牛介质（CDFBS介质）胎儿：混合375毫升含酚红的DMEM中和125的10ml DMEM/ F-12。除去37.5毫升并用相同体积的木炭葡聚糖剥离胎牛血清的更换。添加10 6 U / ml的青霉素和L-谷氨酰胺至2mM的终浓度。所得介质是75％DMEM，25％DMEM / F-12，7.5％木炭葡聚糖剥离-FBS，2mM L-谷氨酰胺，和10 6 U / ml的青霉素。
- 在57℃水浴热灭活胎牛血清（FBS）30分钟。
- 制备10X PBS，1N NaOH和去离子蒸馏水。根据需要的胶原溶液的体积制备各足够体积。消毒通过过滤所有的解决方案。存储10×PBS和无菌去离子蒸馏水在4℃下长达1个月。不要存放1N NaOH溶液。
- 根据该协议用于由制造商提供“备用胶凝程序胶原I，鼠尾”以1毫克/毫升的最终浓度制备胶原溶液。每个凝胶是由1.5毫升胶原溶液。例如，准备18.5毫升（0.5毫升移液过程中的损失）的胶原溶液准备12凝胶。立即使用胶原溶液或持有冰上长达2-3小时。
- 胭脂红明矾染料：
- 在500毫升蒸馏水中结合1克胭脂红和2.5克硫酸铝钾。而搅拌20分钟煮沸。仔细观察，以避免沸腾了。调节最终体积回至500ml用另外的蒸馏水。
- 添加百里酚的结晶为抗菌活性和覆盖瓶用铝箔避光保护。通过每次使用前一个实验室级过滤纸过滤。重复使用长达三个月的胭脂红的解决方案。商店在RT，避光。
- 胶原酶溶液：溶于DMEM / F12培养基胶原酶以0.125％w / v的浓度。不要存放这种解决方案。
2. T47D的3D文化细胞在鼠尾胶原1型凝胶和激素治疗
注意：保持无菌血清移液管和枪头在4℃。
- 准备工作再一个单细胞悬浮液并进行细胞计数。拆分T47D细胞培养才达到70％汇合。离心含有所需细胞的量的体积。考虑到一种凝胶应该包含约75,000 T47D细胞。
- 使用冷移液管，在胶原的适当体积再悬浮细胞沉淀。考虑到每个凝胶制成1.5ml的胶原组成。混合细胞和胶原轻轻以避免引入气泡。
- 防止静电对细胞分布的影响，展开该板后刷12孔板的边界，顶部和底部用一个静电减少刷。以避免与罩的工作表面接触期间静电荷的积累，放置该板上另一个也被刷与静电减少brush.Gently 12孔板（空白盘）的顶部，倾1.5混合毫升入12孔板的每个孔中。
- 放置在培养箱的板在37℃下30分钟。删除次从孵化器e盘，并把它背在引擎盖。
- 使用P200无菌尖端，仔细分离凝胶从井的边框轻柔打圈。凝胶还应该从井的底部脱离。
- 在CDFBS介质稀释激素被添加到孔中。使用E2和R5020在在10 -10米决赛中浓度和催乳素在10 -7米决赛浓度。作为对照，使用CDFBS媒体不添加激素，但仍含有DMSO量最高相当于所使用的激素类股。确保每个孔包含将1.5ml介质。放置3D培养37℃，5％CO 2，100％的内部 湿度组织培养的孵化器。维持培养1周或2周，改变介质每2天。
3.凝胶处理的全挂载
- 移除培养基，并添加1.5毫升的PBS至每个孔中。
- 转移凝胶的幻灯片。使用曲线切割凝胶在半ð手术刀片。继续处理以一半并保存，另一半用于组织学分析。
- 转移半凝胶整体安装到幻灯片。让凝胶干燥5分钟，然后在滑动转移到含有10％福尔马林一个科普林缸。
注意：所有的孵育应在室温下进行。 - 修正了在振动台上O / N一科普林罐子凝胶。
- 洗涤滑动用PBS两次在摇床上各10分钟。转印滑动以70％的乙醇;孵育在摇床上1小时。转移幻灯片胭脂红明矾O / N。
- 第二天，脱水上滑动摇床中70％乙醇，95％乙醇和100％EtOH中的每个1小时。转移滑动以二甲苯为每1小时两次，不断振动筛。使用基于甲苯安装介质装入凝胶和1.5毫米厚的盖玻片。
- 检查定期光（显微镜体视镜）整个坐骑。对形状和腔的更详细的分析使用共聚焦显微镜和可视胭脂红染料与氦氖633纳米的激光。
4.凝胶处理加工的组织学分析
- 凝胶的剩余的一半转移到含有10％的福尔马林20ml的玻璃小瓶中，并固定在摇床O / N。
- 用PBS洗涤凝胶两次在摇床上各10分钟。地方凝胶成石蜡包埋处理匣。
- 转移的凝胶至70％乙醇，孵育1小时，并按照用95％EtOH中1小时，更改到新鲜的95％EtOH中1小时，100％的乙醇1小时，并改变到新鲜100％EtOH中1小时。此时，凝胶可以被存储在100％EtOH中O / N在室温或用二甲苯温育1小时，然后再在新鲜的二甲苯为1小时。
- 转移盒于真空培养箱石蜡1小时，在60℃，用新鲜石蜡两次重复。
- 填充塑料模具用干净的石蜡。打开纸盒，取出凝胶，并将其放置在塑料模具含有石蜡。用石蜡填满，并添加包含在上面的标签盒的顶部，让凉爽的块。
- 取出PLASTIC模具及部分使用切片块。获得5微米厚的切片HE染色和免疫组化。
5.使用胶原酶处理提取细胞的细胞从凝胶
- 从井除去凝胶，并将其转移到含有PBS的培养皿。冲洗凝胶简要介绍。
- 转移凝胶含2ml 0.125％胶原酶的15毫升管。吸管上下4-5次，以打破将凝胶切成小块。
- 在37℃孵育25分钟（直到凝胶溶解和细胞是在悬浮液中）
- 加入2毫升血清补充培养基。通过离心（1000 xg离心，5分钟）后，弃去上清液收集细胞，重悬浮细胞并计数。
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Representative Results
图1总结了制备激素敏感3D培养的过程。在2周中的E2单独存在下培养，并在与其他激素组合凝胶整个坐骑观察上皮结构。仅单个细胞或2-3细胞的基团存在时无激素添加到培养基（CDFBS培养基）（ 图2）。该条件用作阴性对照。
细胞中，在形状，大小，和管腔存在变化的3D培养形式结构。结构的凝胶中的分布通常是均相的。如先前所示，有沿比中心4中可见的凝胶的边界通常更结构。由于这种空间异质性，样本之间进行比较，应仅限于跨样本对应的地区。
从中型胶原1派生影响的表型的物种所产生的上皮结构5次质量。鼠尾胶原1型，如这里使用的，是由于在牛胶原1型晶种选择导致形成无组织细胞团（图3）的。
可以使用共聚焦显微镜（图4）来实现的上皮结构的详细分析。 E2治疗导致圆形和伸长结构（图4A）。 E2和在更出芽结构（ 图4B）催乳素结果的情况下，而E2和promegestone结果的存在下，在不规则结构与细胞突起让人想起侧的支化（ 图4C）。当由生长在z方向上测量，并与在E2加promegestone观察的那些时E2单独和E2加催乳变厚组织结构。
为了激素处理后，量化的细胞数，将细胞extracted从利用胶原酶处理的凝胶。例如，使用该方法，我们可以研究抗雌激素的ICI 182,780如何抑制E2对细胞增殖在3D培养物（ 图5） 的效果。
图1的步骤激素敏感的3D培养物的制备方法。简言之，将T47D细胞的单细胞悬浮液与鼠尾胶原1型混合，并倾入一个12孔平板的孔中。凝胶被允许在37℃/ 5％CO 2培养箱中凝结30分钟。培养基并将该凝胶是从井分离。培养可在1周或2周后，根据终点收获。 请点击此处查看该图的放大版本。
，3D文化与胭脂红明矾染料染色后图2.全坐骑 （A）一半胭脂红明矾以可视化的上皮细胞的结构，对于形态分析投资回报率的一个例子染色的凝胶整装由方框所示;三维培养物WM生长2周（B）的CDFBS介质（未添加激素）和（C）CDFBS介质补充有E2和催乳素。比例尺为5000微米（A）和500微米（B＆C）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.比较三维培养使用的矩阵。（A）Bovi100微米：NE型胶原1导致细胞排列紊乱集群，而不是有组织的结构（B）用鼠尾型胶原1.比例尺时观察到，请点击此处查看该图的放大版本。
图4.在三维胶原凝胶观察到2周后，治疗 与 （A）的E2，（B）中的E2 +催乳素和 （C）的E2 + R5020 T47D结构的共聚焦图像 。箭头指向细胞质预测。上皮结构的厚度为24，分别为40和20微米。比例尺：40微米请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 3D培养与任一单独的E2使用胶原酶处理的细胞提取后处理或E2加ICI 182,780 1周。细胞计数。 （A）CDFBS介质，（B）以1×10 CDFBS中加E2 -10男，（C）ICI 182,780以1×10 -8 M PLUS E2在1×10 -10 M和（D）ICI 182,780以1x 10-7 M PLUS E2在1×10 -10 M.酒吧：SEM 请点击此处查看该图的放大版本。
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Acknowledgments
我们非常赞赏谢丽尔Schaeberle社论贡献。这项研究是由雅芳资助＃02-2009-093和02-2011-095和NIEHS / NIH ES 08314至AMS支持。内容完全是作者的责任，并不一定代表环境健康科学研究所或美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
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