Introduction
In tegenstelling tot standaard 2D culturen 3D celkweek surrogaat apparaten kan de studie van epitheelcel gedrag in een fysiologisch relevante context, iemand als een weefsel. 3D culturen van de borstklier geholpen verhelderen vele aspecten van ontwikkeling van de borstklier en neoplasie. De meeste van de 3D cultuurmodellen momenteel beschikbaar zijn ongeschikt hormoonactie bestuderen omdat het menselijke epitheliale cellijnen gebruikt voor de taak missen hormoonreceptor expressie 6,7,9.
Hierin beschrijven we een 3D cultuurmodel van de menselijke borst epitheel die geschikt is om hormooninwerking 12 bestuderen. Dit model maakt gebruik van de commercieel verkrijgbare hormoon reagerende menselijke borst epitheel cellijn, T47D 3,11,13, die oorspronkelijk waren afgeleid van een pleurale effusie verkregen uit een 54 jaar oude vrouwelijke patiënt met een infiltrerend ductaal carcinoom van de borst. We maken gebruik van rattenstaart collageen type 1 als een matrix. Deze 3D culture model is geschikt voor de studie van de werking van de drie mammotropic hormonen (estradiol, promegeston (een analoog van progesteron) en prolactine) menselijke borst epitheelcellen. Hormoon-geïnduceerde epitheliale morfologie kan kwantitatief worden geëvalueerd na verloop van tijd door morfometrische analyse 12.
Een geschikte zaaidichtheid kunnen deze 3D kweken gedurende 2 weken worden bewaard. Tegen die tijd, de ontwikkeling van structuren is voldoende voor een robuuste kwantitatieve beoordeling van hormoonwerking op epitheliale morfologie. Gels kunnen ook worden geoogst eerdere tijdstippen voor celproliferatie en genexpressie analyses. Daarnaast heeft dit model geschikt om de effecten van een sequentiële hormonale behandeling getest; bijvoorbeeld na behandeling met estradiol gedurende de eerste week en vervanging door andere hormonen / combinatie van hormonen in de volgende week. Het effect van oestrogene stoffen en anti-oestrogenen, zoals ICI 182.780, kan worden stustierf het gebruik van deze 3D-cultuur model 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
- Los het synthetische progestageen promegeston (R5020) en 17-β-estradiol (E2) in ethanol tot 10 -3 M voorraadoplossingen te maken. Prolactine lossen in gedestilleerd gedeïoniseerd water om een 1 mg / ml voorraadoplossing te maken. Ontbinding van de anti-oestrogeen ICI 182.780 in DMSO om een 10 -2 M voorraad oplossing te maken. Bewaar de oplossingen bij -20 ° C maximaal 6 maanden.
- Charcoal dextran (CD) gestript serum en CDFBS medium:
- Warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) in een 57 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
Opmerking: Gebruik alleen zuur gewassen glaswerk voor de rest van dit protocol. - Bereken de hoeveelheid houtskool nodig. Gebruik 10% meer volume dan de hoeveelheid serum te compenseren voor de verplaatsing door de houtskool Weeg 5% gew / vol actieve poederkool.
- Was houtskool tweemaal met koud gedeïoniseerd gedestilleerd water waarbij hetzelfde volume als de hoeveelheid serum. Voor elke wasbeurt centrifuge bij 50 xg gedurende 2 minuten om de houtskool te pelleteren. Verwijder het water tussen de wasbeurten. Voeg 0,5% gewicht / volume dextraan T-70 de laatste pellet houtskool. Resuspendeer met gedestilleerd, gedemineraliseerd water en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten. Zuig het water.
- Voeg de juiste hoeveelheid serum aan de pellet en resuspendeer de houtskool dextran pellet in het serum. Incubeer, terwijl rollen (6 rpm) bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 20 min. Als bovenstaande blijkt bewolkt, herhaal centrifugeren; kan echter serum niet helemaal duidelijk op dit moment, maar tijdens het filtreren worden gewist.
- Filtreer door een 0,80 micron filter en dan weer door een 0,45 micron filter om grotere deeltjes te verwijderen. Tot slot, filter-steriliseren met een 0.20 micron filter. Store gefilterd CDFBS in glazen buizen of T-25 cultuur kolven bij -20 ºC.
- Charcoal Dextran Stripped Fetal Bovine-bevattende media (CDFBS media): meng 375 ml fenol rood-vrij DMEM en 125 ml DMEM/ F-12. Verwijder 37,5 ml en te vervangen door hetzelfde volume van Charcoal Dextran Stripped Fetal Bovine serum. Voeg 10 6 U / ml penicilline en L-glutamine een 2 mM eindconcentratie. Het resulterende materiaal is 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% dextran houtskool gestript FBS-, 2 mM L-glutamine en 10 6 U / ml penicilline.
- Warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) in een 57 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
- Bereid 10X PBS, 1N NaOH en gedestilleerd gedemineraliseerd water. Bereid voldoende volume van elk naar de hoeveelheid collageen oplossing nodig. Steriliseren alle oplossingen door te filteren. Bewaar de 10x PBS en steriel gedestilleerd gedeïoniseerd water bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. Laat de 1N NaOH-oplossing niet bewaren.
- Bereid collageen oplossing bij een 1 mg / ml uiteindelijke concentratie volgens het protocol voor "Alternatieve Gelatinevorming Procedure voor Collageen I, staart Rat" die door de fabrikant. Elke gel bestaat uit 1,5 ml collageenoplossing. Zij bijvoorbeeld 18,5 ml (0,5 ml te verantwoorden verlies tijdens pipetteren) van collageenoplossing te bereiden12 gels. Gebruik het collageen oplossing onmiddellijk of te houden op ijs tot 2-3 uur.
- Carmine Aluin kleurstof:
- Combineer 1 g en 2,5 g Carmine aluminiumkaliumsulfaat in 500 ml gedestilleerd water. Kook onder roeren gedurende 20 min. Kijk goed om te voorkomen dat overkoken. Pas uiteindelijke volume terug tot 500 ml met extra gedestilleerd water.
- Voeg een kristal van thymol voor antimicrobiële activiteit en bedek fles met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. Filteren door middel van een laboratorium rang papieren filter voor elk gebruik. Hergebruik het karmijn oplossing voor maximaal drie maanden. Bewaren bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht.
- Collagenase oplossing: los de collagenase in DMEM / F12-medium in een concentratie van 0,125% w / v. Mis deze oplossing niet op te slaan.
2. 3D Cultuur van T47D cellen in Rat Tail Collageen Type 1 Gels en Hormoonbehandeling
Let op: houd steriel serologische pipetten en pipetpunten bij 4 ° C.
- Prepaopnieuw een single-celsuspensie en het uitvoeren van een celgetal. Split T47D celculturen voordat ze 70% samenvloeiing. Centrifugeer het volume dat de hoeveelheid cellen die nodig bevat. Bedenk dat een gel ongeveer 75.000 T47D cellen moeten bevatten.
- Met behulp van een koude-pipet, resuspendeer de cel pellet in het juiste volume van collageen. Bedenk dat elke gel bestaat uit 1,5 ml collageen. Meng de cellen en collageen voorzichtig te voorkomen dat er luchtbellen.
- Om het effect van statische elektriciteit op celverdeling voorkomen borstel de randen, boven- en onderkant van de 12-well plaat met een statische-reducerende borstel na het uitpakken de plaat. Om statische lading opbouw tijdens het contact met de werkende oppervlak van de kap te voorkomen, plaats deze plaat op de top van een andere 12-well plaat (blanco plaat), die ook is geborsteld met de statische-reducerende brush.Gently, giet er 1,5 ml van het mengsel in elk putje van de 12-well plaat.
- Plaats de plaat in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Verwijder the plaat uit de incubator en plaats het terug in de kap.
- Met behulp van een p200 steriele tip, voorzichtig los van de gel in een zachte cirkelvormige beweging vanaf de rand van de put. De gel dient ook los van de bodem van de put.
- Verdun hormonen CDFBS media aan de putjes toegevoegd. Gebruik E2 en R5020 op 10 -10 M eindconcentratie en prolactine op bij 10 -7 M eindconcentratie. Als controle gebruikt CDFBS medium zonder hormonen toegevoegd, maar toch heel hoog percentage DMSO gelijk aan het hormoon voorraden die daarin. Ervoor te zorgen dat elk putje bevat 1,5 ml van media. Plaats de 3D kweken in een 37 ° C, 5% CO2, 100% luchtvochtigheid weefselkweek incubator. Handhaaf de kweken gedurende 1 of 2 weken, veranderen de media om de 2 dagen.
3. Gel Processing voor Whole Mounts
- Verwijderen cultuurmedia en voeg 1,5 ml van PBS aan elk putje.
- Breng de gel aan een dia. Snijd de gel doormidden met een curved chirurgisch mes. Ga verder verwerken met de ene helft en sla de andere helft voor histologische analyse.
- Breng de helft gel voor geheel monteren op een glijbaan. Laat gel drogen gedurende 5 minuten en vervolgens over de dia naar een Coplin pot met 10% formaline.
Opmerking: Alle incubaties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. - Fix gels in een Coplin pot op een shaker O / N.
- Wassen glijdt tweemaal met PBS gedurende 10 minuten elk op shaker. Overdracht dia's tot 70% EtOH; incubeer gedurende 1 uur op shaker. Overdracht dia's Carmine Aluin O / N.
- De volgende dag, gedehydreerd slides on shaker in 70% EtOH, 95% EtOH en 100% EtOH gedurende 1 uur elk. Overdracht dia's twee keer gedurende 1 uur per xyleen en blijf op de shaker. Gebruik op basis van tolueen montage medium om de gels en 1,5 mm dik dekglaasjes monteren.
- Onderzoek hele mounts onder normale licht (microscoop of stereoscoop). Voor een meer gedetailleerde analyse van vorm en lumen gebruiken confocale microscopie en visualiseren Carmine kleurstof met HeNe 633 nm laser.
4. Gel Processing voor verwerking voor histologie Analyse
- Draagt de resterende helft van de gel naar een 20 ml glazen flesje met 10% formaline en vast op shaker O / N.
- Wassen gels tweemaal met PBS gedurende 10 minuten elk op shaker. Plaats gels in de verwerking van cassettes voor paraffine inbedding.
- Transfer gels tot 70% EtOH, incubeer gedurende 1 uur en volgt met 95% EtOH gedurende 1 uur, veranderen in de frisse 95% EtOH gedurende 1 uur, 100% EtOH gedurende 1 uur, en veranderen om verse 100% EtOH gedurende 1 uur. Op dit punt, kunnen gels worden opgeslagen in 100% EtOH O / N bij kamertemperatuur en geïncubeerd met xyleen gedurende 1 uur en daarna weer in verse xyleen gedurende 1 uur.
- Transfer cassettes paraffine gedurende 1 uur bij 60 ° C onder vacuüm incubator, herhaal met verse paraffine tweemaal.
- Vul plastic mallen met schone paraffine. Open de cassette, verwijdert u de gel en plaats deze in de plastic mal met paraffine. Opvullen met paraffine en voeg de bovenkant van de cassette met het etiket naar boven en laat blok afkoelen.
- Verwijder de plastic schimmel en deel het blok met behulp van een microtoom. Verkrijgen 5 um dikke secties voor HE kleuring en immunocytochemie.
5. Extractie van cellen van cellen van Gels gebruiken Collagenase behandeling
- Verwijder gel uit de put en overbrengen naar een petrischaaltje met PBS. Rinse gel kort.
- Breng de gel een 15 ml buis met 2 ml 0,125% collagenase. Pipet op en neer 4-5 keer in om het gel te breken in kleine stukjes.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 25 minuten (totdat gel opgelost en cellen in suspensie)
- Voeg 2 ml serum aangevuld kweekmedium. Verzamel cellen door centrifugeren (1000 x g, 5 min), teruggooi supernatant, resuspendeer cellen en tellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure voor het bereiden van de hormoongevoelige 3D culturen. Epitheelstructuren worden waargenomen in whole mounts gelen gekweekt gedurende 2 weken in de aanwezigheid van E2 alleen en in combinatie met andere hormonen. Slechts enkele cellen of groepen van 2-3 cellen zijn aanwezig wanneer geen hormonen worden toegevoegd aan het kweekmedium (CDFBS gemiddeld) (figuur 2). Deze voorwaarde dient als negatieve controle.
Cellen in 3D cultuur vorm structuren die variëren in vorm, grootte, en de aanwezigheid lumen. De verdeling van structuren in de gel is typisch heterogeen. Zoals eerder aangegeven, zijn er over het algemeen structuren langs de randen van de gel dan gezien in het midden 4. Vanwege deze ruimtelijke heterogeniteit dient vergelijkingen tussen monsters te beperken tot overeenkomstige gebieden in monsters.
De diersoort waarvan collageen type 1 wordt afgeleid beïnvloedt het fenotype eennd kwaliteit van de resulterende epitheelstructuren 5. Rattenstaart collageen type 1, zoals hier gebruikt, is gekozen omdat zaaien in boviene collageen type 1 resulteerde in de vorming van ongeorganiseerde celgroepen (figuur 3).
Een gedetailleerde analyse van de epitheliale structuren kan worden verkregen door confocale microscopie (figuur 4). Behandeling E2 resultaten afgeronde en langwerpige structuren (Figuur 4A). De aanwezigheid van E2 en prolactine leidt tot meer ontluikende structuren (figuur 4B), terwijl de aanwezigheid van E2 en promegeston resulteert in onregelmatige structuren met cellulaire uitsteeksels herinnerend zijdelingse vertakking (Figuur 4C). E2 staan E2 plus prolactine dikker weefselstructuren gemeten door groei in de z-richting, en in vergelijking met die welke waargenomen E2 plus promegeston.
Om het aantal cellen te kwantificeren na hormoonbehandeling, cellen, extractend uit de gel met behulp collagenase behandeling. Bijvoorbeeld met behulp van deze werkwijze kunnen we onderzoeken hoe de anti-oestrogeen ICI 182.780 tot gevolg E2 celproliferatie in de 3D-kweken (figuur 5) remt.
Figuur 1. Procedure voor de bereiding van hormoongevoelige 3D culturen. Kortom, een eencellige suspensie van T47D-cellen wordt gemengd met rattenstaart collageen type 1 en in putjes van een 12-wells plaat gegoten. De gels mogen stollen gedurende 30 minuten in een 37 ° C / 5% CO2 incubator. Cultuurmedium toegevoegd en de gels wordt losgemaakt van de put. Culturen kan worden geoogst na 1 of 2 weken naar het eindpunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 2. whole mounts 3D kweken na kleuring met Carmine Alum kleurstof (A) Whole mount halve gel gekleurd met karmijn aluin het epitheelstructuren een voorbeeld van ROI morfologische analyse zichtbaar wordt aangegeven door een box; WM 3D kweken gekweekt gedurende 2 weken in (B) CDFBS media (geen hormonen toegevoegd) en (C) CDFBS medium aangevuld met E2 en prolactine. Schaal bars zijn 5.000 urn (A) en 500 pm (B & C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van de matrices gebruikt in 3D cultuur. (A) Bovine collageen type 1 leidt tot ongeorganiseerd clusters van cellen, in tegenstelling tot de georganiseerde structuren (B) waargenomen bij het gebruik van rattenstaart collageen type 1. Schaal bar:. 100 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Confocale beelden van T47D structuren waargenomen in 3-D collageengels na 2 weken. Behandeling met (A) E2, (B) + E2 prolactine en (C) E2 + R5020. Pijlen wijzen naar cytoplasma projecties. Dikte van epitheelstructuren was 24, 40 en 20 urn respectievelijk. Schaal bar:. 40 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. 3D kweken behandeld met alleen E2 of E2 plus ICI 182.780 gedurende 1 week. Celtellingen na celextractie gebruik collagenase behandeling. (A) CDFBS medium, (B) CDFBS medium plus E2 1x10 -10 M, (C) ICI 182.780 op 1x10 -8 M plus E2 1x10 -10 M en (D) bij ICI 182.780 1x 10-7 M plus E2 op 1x10 -10 M. Bars. SEM Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We waarderen de redactionele bijdragen van Cheryl Schaeberle. Dit onderzoek werd gesteund door Avon Grants # 02-2009-093 en 02-2011-095 en NIEHS / NIH ES 08.314 naar AMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Environmental Health Sciences of de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
