Introduction
Contrairement cultures 2D standard, culture cellulaire 3D modèles de substitution permettent l'étude du comportement des cellules épithéliales dans un contexte physiologiquement pertinente, l'un ressemble à un tissu. cultures 3D de la glande mammaire ont permis d'élucider de nombreux aspects du développement de la glande mammaire et la néoplasie. Cependant, la plupart des modèles de culture 3D actuellement ne conviennent pas pour étudier l'action des hormones parce que les lignées de cellules épithéliales humaines utilisées pour la tâche manquent de l'expression du récepteur d'hormone 6,7,9.
Nous décrivons ici un modèle de culture 3D de l'épithélium du sein humain qui est approprié pour étudier l'action de l'hormone 12. Ce modèle utilise la ligne disponible dans le commerce hormono-sensible humain epithelial du sein cellulaire T47D 3,11,13, qui ont été à l'origine dérivée d'une effusion pleurale provenant d'une patiente de 54 ans femelle avec un carcinome canalaire infiltrant du sein. Nous utilisons rat de type queue de collagène 1 comme matrice. Ce culte 3Dmodèle de ure est approprié pour l'étude de l'action des trois principales hormones mammotropic (estradiol, promégestone (un analogue de la progestérone), et de prolactine) sur les cellules épithéliales mammaires humaines. Hormone induit morphologie épithéliale peut être évaluée quantitativement au fil du temps par analyse morphométrique 12.
Une densité de semis appropriée permet à ces cultures 3D pour être conservés pendant 2 semaines. A cette époque, le développement de structures est suffisant pour une évaluation quantitative robuste de l'action des hormones sur la morphologie épithéliale. Les gels peuvent également être récoltées à des moments antérieurs pour la prolifération cellulaire et les analyses d'expression génique. En outre, ce modèle est adapté à tester les effets d'un traitement hormonal séquentiel; par exemple, après le traitement avec l'oestradiol pendant la première semaine et son remplacement par un autre hormone / combinaison d'hormones au cours de la semaine suivante. L'effet des composés oestrogéniques et anti-œstrogènes, tels que ICI 182,780, peut également être Stumortes en utilisant ce modèle de culture de 12 3D.
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Protocol
1. Préparation des réactifs
- Dissoudre le promégestone synthétique progestatif (R5020) et 17-β-estradiol (E2) dans l'éthanol pour faire 10 -3 M solutions mères. Dissoudre la prolactine dans l'eau déminéralisée distillée pour faire un / ml solution mère à 1 mg. Dissoudre l'anti-oestrogène ICI 182,780 dans le DMSO pour faire un M solution mère à 10 -2. Stocker ces solutions à -20 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
- dextran de charbon (CD) dépouillé sérum et moyennes CDFBS:
- Inactiver à la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) dans un bain d'eau à 57 ° C pendant 30 min.
Remarque: Utilisez uniquement la verrerie lavée à l'acide pour le reste de ce protocole. - Calculer la quantité de charbon de bois nécessaire. Utilisation de 10% plus de volume que la quantité de sérum pour compenser le déplacement provoqué par le charbon, peser 5% en poids / volume de charbon actif en poudre.
- Laver le charbon deux fois avec de l'eau désionisée froide distillée en utilisant le même volume que la quantité de sérum. Pour chaque lavage centrifuge à 50 x g pendant 2 min pour sédimenter le charbon de bois. Retirer l'eau entre les lavages. Ajouter 0,5% en poids / volume Dextran T-70 à la dernière charbon granulés. Re-suspendre avec distillée, eau déminéralisée et centrifuger à 100 g pendant 5 min. Aspirer l'eau.
- Ajouter le volume approprié de sérum au culot et remettre en suspension le culot de charbon dextran dans le sérum. Incuber, tout en roulant (6 RPM), à 37 ° C pendant 60 min. Centrifuger à 2000 g pendant 20 min. Si surnageant apparaît trouble, répéter centrifugation; Cependant, le sérum peut ne pas être tout à fait clair à ce moment, mais il sera effacé lors de la filtration.
- Filtrer à travers un filtre de 0,80 microns, puis à nouveau à travers un filtre de 0,45 microns pour éliminer plus grand de particules. Enfin, le filtre-stériliser avec un filtre de 0,20 micron. Magasin CDFBS dans des tubes de verre ou T-25 flacons de culture filtré à -20 ºC.
- Charcoal Dextran Stripped fœtal bovin contenant des médias (médias CDFBS): mélanger de 375 ml de phénol DMEM exempt de rouge et 125 ml de DMEM/ F-12. Retirer 37,5 ml et le remplacer par le même volume de sérum de veau fœtal charbon Dextran Stripped. Ajouter 10 6 U / ml de pénicilline et de la L-glutamine à une concentration finale de 2 mM. Le support obtenu est 75% de DMEM, 25% de DMEM / F-12, de 7,5% à charbon dextran dépouillée de FBS, 2 mM de L-glutamine, et 10 6 U / ml de pénicilline.
- Inactiver à la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) dans un bain d'eau à 57 ° C pendant 30 min.
- Préparez 10X PBS, NaOH 1N et de l'eau déminéralisée distillée. Préparer un volume suffisant de chaque selon le volume de la solution de collagène est nécessaire. Stériliser toutes les solutions de filtrage. Stocker le 10x PBS et de l'eau déminéralisée distillée stérile à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois. Ne pas conserver la solution de NaOH 1N.
- Préparer la solution de collagène à 1 mg / ml de concentration finale selon le protocole de "procédure de gélification suppléant de collagène I, queue de rat" fourni par le fabricant. Chaque gel est constitué de 1,5 ml d'une solution de collagène. Par exemple, préparer 18,5 ml (0,5 ml pour tenir compte des pertes au cours de pipetage) d'une solution de collagène pour préparer12 gels. Utiliser la solution de collagène immédiatement ou tenir sur de la glace jusqu'à 2-3 heures.
- Carmine Alum colorant:
- Mélanger 1 g Carmine et 2,5 g de sulfate d'aluminium de potassium dans 500 ml d'eau distillée. Faire bouillir tout en agitant pendant 20 min. Regardez attentivement pour éviter de déborder. Ajuster le volume final de retour à 500 ml d'eau distillée supplémentaire.
- Ajouter un cristal de thymol de l'activité antimicrobienne et couvrir la bouteille avec du papier d'aluminium pour le protéger de la lumière. Filtrer à travers un filtre en papier de qualité laboratoire avant chaque utilisation. Réutiliser la solution de carmin pour un maximum de trois mois. Magasin à la température ambiante, à l'abri de la lumière.
- solution de collagénase: dissoudre la collagénase dans du milieu DMEM / F12 à une concentration de 0,125% p / v. Ne rangez pas cette solution.
2. 3D culture de cellules T47D dans Queue Rat collagène de type 1 et Gels Traitement hormonal
Remarque: garder pipettes sérologiques stériles et des embouts de pipette à 4 ° C.
- Prepare une suspension à cellule unique et d'effectuer une numération cellulaire. des cultures de cellules de Split T47D avant qu'ils atteignent 70% de confluence. Centrifuger le volume qui contient la quantité de cellules nécessaires. Considérer que l'un de gel devrait contenir environ 75.000 T47D cellules.
- En utilisant une pipette à froid, remettre en suspension le culot cellulaire dans le volume approprié de collagène. Considérons que chaque gel est constitué de 1,5 ml de collagène. Mélanger les cellules et le collagène avec précaution pour éviter l'introduction de bulles.
- Pour éviter l'effet de l'électricité statique sur la distribution de cellules, brosser la frontières, haut et en bas de la plaque de 12 puits avec une brosse antistatique réducteur après déballer la plaque. Pour éviter l'accumulation de charge statique lors du contact avec la surface de travail de la hotte, placer cette plaque sur le dessus d'une autre plaque de 12 puits (plaque vierge) qui a également été brossé avec le brush.Gently statique de réduction, versez 1,5 ml du mélange dans chaque puits de la plaque de 12 puits.
- Placer la plaque dans une étuve à 37 ° C pendant 30 min. Retirer ee plaque de l'incubateur et le replacer dans la hotte.
- En utilisant une pointe stérile p200, détacher soigneusement le gel dans un mouvement circulaire de la frontière du puits. Le gel doit également se détacher du fond du puits.
- Diluer hormones dans les médias CDFBS à être ajoutés aux puits. R5020 et utiliser E2 à une concentration finale de 10 -10 M et de la prolactine à une 10 -7 M à une concentration finale. Comme contrôle, utiliser les médias CDFBS sans hormones ajoutées, mais qui contient encore le plus grand volume de DMSO égale aux stocks d'hormones utilisées. Veiller à ce que chaque puits contient 1,5 ml de milieu. Placer les cultures 3D à l'intérieur de 37 ° C, 5% CO 2, 100% Taux d'humidité de la culture tissulaire de l'incubateur. Maintenir les cultures pour 1 ou 2 semaines, en changeant les médias tous les 2 jours.
3. Traitement Gel pour toute Mounts
- Retirer les milieux de culture et d'ajouter 1,5 ml de PBS à chaque puits.
- Transférer le gel à une diapositive. Couper le gel en deux à l'aide d'une courbelame chirurgicale d. Continuer le traitement avec une moitié et sauver l'autre moitié pour l'analyse histologique.
- Transférer le gel de la moitié de toute la montagne à une diapositive. Laissez gel sec pendant 5 min, puis transférer la diapositive à un bocal de Coplin contenant 10% de formol.
Remarque: toutes les incubations doivent être effectués à la température ambiante. - Fixer des gels dans un bocal de Coplin sur un agitateur O / N.
- Laver les lames deux fois avec PBS pendant 10 min chacun sur shaker. Transfert glisse à 70% EtOH; incuber pendant 1 heure sur un agitateur. diapositives de transfert aux Carmine Alum O / N.
- Le lendemain, déshydrater diapositives sur un agitateur à 70% de EtOH, EtOH à 95% et 100% EtOH pendant 1 heure chacune d'elles. Transfert glisse au xylène deux fois pendant 1 heure chacun et continuer à shaker. Utilisez milieu de montage à base de toluène de monter les gels et 1,5 mm Lamelles épaisses.
- Examiner montures entières sous une lumière ordinaire (microscope ou stéréoscope). Pour une analyse plus détaillée de la forme et de la lumière en utilisant la microscopie confocale et de visualiser Carmine colorant avec HeNe 633 nm laser.
4. Traitement Gel pour le traitement de l'analyse histologique
- Transférer la moitié restante du gel dans un flacon en verre de 20 ml contenant 10% de formol et de fixer sur un agitateur O / N.
- Lavez gels deux fois avec PBS pendant 10 min chacun sur shaker. La place des gels dans des cassettes de traitement pour inclusion dans la paraffine.
- gels de transfert à 70% EtOH, incuber pendant 1 h et suivent avec 95% EtOH pendant 1 heure, changent à nouveau de 95% EtOH pendant 1 heure, 100% EtOH pendant 1 heure, et se transforment en frais EtOH à 100% pendant 1 heure. À ce stade, les gels peuvent être stockés dans EtOH à 100% O / N à la température ambiante ou incubées avec du xylène pendant 1 heure, puis à nouveau dans le xylène frais pendant 1 heure.
- cassettes de transfert de paraffine pendant 1 heure à 60 ° C dans un incubateur à vide, répéter avec de la paraffine frais deux fois plus.
- Remplir les moules en plastique avec de la paraffine propre. Ouvrez la cassette, enlever le gel et le placer dans le moule contenant la paraffine plastique. Remplir avec de la paraffine et ajoutez haut de cassette contenant l'étiquette sur le dessus et laisser bloc cool.
- Retirez le plastic moule et la section du bloc en utilisant un microtome. Obtenez 5 um sections d'épaisseur pour coloration HE et immunocytochimie.
5. extraction de cellules à partir de cellules à partir de gels en utilisant un traitement collagénase
- Retirer le gel du puits et le transférer à une boîte de Pétri contenant du PBS. brièvement de gel rinçage.
- Transférer le gel dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de 0,125% de collagénase. Introduire à la pipette de haut en bas 4-5 fois pour briser le gel en petits morceaux.
- Incuber à 37 ° C pendant 25 min (jusqu'à ce que le gel se soit dissous et les cellules sont en suspension)
- Ajouter 2 ml de sérum supplémenté le milieu de culture. Recueillir les cellules par centrifugation (1000 x g, 5 min), surnageant rejet, remettre en suspension les cellules et à compter.
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Representative Results
La figure 1 résume la procédure pour la préparation des cultures 3D hormono-sensibles. structures epitheliales sont observés dans les montures de gels entiers cultivés pendant 2 semaines en présence de E2 seul ou en combinaison avec d'autres hormones. Des cellules ou des groupes de 2-3 cellules simples sont présents seulement lorsque aucun hormones sont ajoutées au milieu de culture (milieu CDFBS) (figure 2). Cette condition sert de contrôle négatif.
Les cellules en 3D des structures de forme de culture qui varient en forme, la taille, et la présence de lumière. La répartition des structures dans le gel est généralement hétérogène. Comme montré précédemment, il y a généralement plus de structures le long des frontières du gel de vue au centre 4. En raison de cette hétérogénéité spatiale, les comparaisons entre les échantillons doivent être limités à des régions correspondantes entre les échantillons.
Les espèces à partir de laquelle le collagène de type 1 est dérivé influences le phénotype d'unend qualité des structures épithéliales résultant 5. Queue de rat du collagène de type 1, tel qu'il est utilisé ici, a été choisi depuis l'ensemencement en collagène bovin de type 1 conduit à la formation de groupes de cellules désorganisées (figure 3).
Une analyse détaillée des structures épithéliales peut être obtenue en utilisant la microscopie confocale (figure 4). Les résultats du traitement dans les structures E2 arrondis et allongés (figure 4A). La présence de E2 et les résultats prolactine dans des structures en herbe plus (figure 4B), tandis que la présence de E2 et les résultats de la promégestone dans les structures cellulaires irrégulières de saillies rappellent côté de branchement (Figure 4C). E2 seule E2 et ainsi épaissir la prolactine structures de tissus quand elle est mesurée par la croissance dans la direction z, et par rapport à ceux observés dans E2 ainsi que la promégestone.
Afin de quantifier le nombre de cellules après un traitement hormonal, les cellules sont extracted à partir du gel en utilisant un traitement par la collagénase. Par exemple, en utilisant cette méthode, nous pouvons étudier comment l'anti-oestrogène ICI 182,780 inhibe l'effet de l'E2 sur la prolifération cellulaire dans les cultures 3D (Figure 5).
Figure 1. Procédure pour la préparation des cultures 3D hormono-sensibles. En bref, une suspension monocellulaire de cellules T47D est mélangé avec la queue de rat de collagène de type 1 et on le verse dans des puits d'une plaque à 12 puits. Les gels sont autorisés à se solidifier pendant 30 minutes dans un / incubateur 5% de CO2 à 37 ° C. Le milieu de culture est ajouté et les gels sont détachés du puits. Les cultures peuvent être récoltées au bout de 1 ou 2 semaines selon le point final. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 2. supports entiers de cultures 3D après coloration avec Carmine Alum colorant (A) de montage total d'un demi-gel coloré au carmin alun de visualiser les structures épithéliales, un exemple de retour sur investissement pour l'analyse de la morphologie est indiquée par une boîte; WM des cultures 3D cultivé pendant 2 semaines en (B) CDFBS Media (pas d'hormones ajoutées) et (C) CDFBS milieux supplémentés avec E2 et la prolactine. Barres d'échelle sont de 5000 um (A) et 500 um (B & C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Comparaison des matrices utilisées dans la culture 3D. (A) Bovine le collagène de type 1 se traduit par grappes désorganisés de cellules, par opposition aux structures organisées (B) observée lors de l'utilisation de queue de rat de collagène de type bar 1. Echelle:. 100 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Les images confocales de structures T47D observés dans trois dimensions des gels de collagène au bout de 2 semaines. Le traitement avec (A) E2, (B) + E2 prolactine et (C) E2 + R5020. Les flèches indiquent les projections cytoplasmiques. L'épaisseur des structures épithéliales était de 24, 40 et 20 um respectivement. Barre d'échelle:. 40 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Les cultures traitées avec 3D soit seul ou E2 E2 ainsi ICI 182 780 pendant 1 semaine. Les numérations cellulaires après extraction des cellules en utilisant un traitement par la collagénase. (A) CDFBS moyen, (B) CDFBS milieu plus E2 à 1x10 M -10 (C) ICI 182,780 à 1x10 -8 M plus E2 à 1x10 M -10 et (D) ICI 182,780 à 1x 10-7 M plus E2 à 1x10 -10 M. Bars:. SEM S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Acknowledgments
Nous apprécions grandement les contributions éditoriales par Cheryl Schaeberle. Cette recherche a été soutenue par des subventions Avon # 02-2009-093 et 02-2011-095 et NIEHS / NIH ES 08314 à AMS. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les positions officielles de l'Institut national des sciences de la santé de l'environnement ou de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
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