Summary
Nos objectifs étaient de concevoir, fabriquer et tester stents ferromagnétiques pour la capture des cellules endothéliales. Dix stents ont été testés pour la fracture et 10 autres stents ont été testés pour le magnétisme retenu. Enfin, 10 stents ont été testés in vitro et 8 autres stents ont été implantés dans 4 porcs pour montrer capture et la conservation cellule.
Abstract
Endothélialisation rapide des endoprothèses vasculaires est nécessaire pour réduire la thrombose de stent et d'éviter la thérapie anti-plaquettaire qui peut réduire le risque de saignement. La faisabilité de l'utilisation des forces magnétiques pour capturer et conserver les cellules endothéliales excroissance (COE) marqués avec des nanoparticules d'oxyde de fer super-paramagnétiques (SPION) a été montré précédemment. Mais cette technique nécessite la mise au point d'un stent mécaniquement fonctionnelle à partir d'un matériau magnétique et biocompatible suivi par in-vitro et in-vivo des tests pour prouver endothélialisation rapide. Nous avons développé un stent faiblement ferromagnétique acier inoxydable duplex 2205 en utilisant conception assistée par ordinateur (CAD) et sa conception a été affinée en utilisant une analyse par éléments finis (FEA). La conception finale du stent présenté une déformation principale sous la limite de rupture du matériau pendant le sertissage mécanique et d'expansion. Une centaine de stents ont été fabriqués et un sous-ensemble d'entre eux a été utilisé pour les essais mécaniques, retained mesures de champ magnétique, des études in vitro de capture de cellules, in vivo et des études d'implantation. Dix stents ont été testés pour déploiement pour vérifier si elles soutenue sertissage et l'expansion du cycle sans défaillance. 10 autres ont été magnétisés stents utilisant un aimant de néodyme forte et leur champ magnétique retenu a été mesurée. Les stents ont montré que le magnétisme retenu était suffisante pour capturer SPION marqué EOC dans nos études de in vitro. Capture et la conservation des COE SPION marqué a été vérifiée dans les grands modèles animaux par l'implantation d'une endoprothèse magnétisé et 1 non-aimanté stent de contrôle dans chacun des 4 porcs. Les artères ont été explantées stentées après 7 jours et analysés histologiquement. Les stents faiblement magnétiques développés dans cette étude étaient capables d'attirer et de retenir les cellules endothéliales Spion marqué qui peut favoriser la guérison rapide.
Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité d'utilisation institutionnel de protection des animaux et (IACUC) à la Clinique Mayo.
1. Conception et analyse d'un stent en acier inoxydable 2,205
- Conception d'un stent en métal nu en utilisant CAD
- Faites un cylindre creux extrudé en sélectionnant sur option 'extrudé patron / de base »avec l'épaisseur de paroi égale à l'épaisseur de l'entretoise stent.
- Concevoir un modèle de stent sur un plan d'esquisse différents tangent au cylindre extrudé. Faire de la largeur du motif plat en fonction de la circonférence du cylindre creux extrudé.
- Transférer la conception de modèle à plat sur le cylindre creux en utilisant la fonction de rembobinage.
- Enregistrez la pièce dans son format natif et aussi en format ACIS être exportés pour être FEA.
- Analyse par éléments finis pour les modèles de stent
- Importez la géométrie solide enregistrée au format ACIS dans le module de partie du logiciel de FEA pour d'autres analysest.
- Modèle 2 cylindres analytiques coaxiale au stent dans la partie modeleur du logiciel FEA. Le cylindre extérieur a un diamètre initial supérieur au diamètre du stent pour simuler la pince et le cylindre intérieur a un diamètre initial de 1 mm pour simuler un ballonnet de gonflage.
- Double-cliquez sur l'élément du modeleur de montage de l'arbre «instances» pour assembler le dessus dudit pièces dans des positions relatives.
- Utilisez le module de maillage du logiciel FEA, spécifier le type d'élément comme élément hexaédrique 20 nœuds avec intégration réduite, spécifier la taille de l'élément, et la maille du stent.
- Spécifiez paires de contact rigides friction entre le stent et les deux cylindres respectivement dans les «propriétés d'interaction» de l'arbre du modèle.
- Attribuer contrainte-déformation comportement élasto-plastique de l'acier inoxydable 2,205 pour le modèle de stent.
- Définir les conditions aux limites pour le sertissage d'une part le cylindre extérieur à 1 mm qui simule le cRimping du stent. Retirer le cylindre extérieur pour simuler la relaxation du stent serti. Développez le cylindre intérieur à 3 mm pour simuler l'expansion et enfin, retirer le cylindre intérieur pour simuler le recul du stent.
- Définir les paramètres de simulation, y compris le nombre de processeurs et la quantité de RAM alloués dans le 'Analyse' élément de modèle de l'arbre et exécuter la simulation.
- Une fois la simulation terminée, ouvrez le fichier de résultat (filename.odb) et post-traitement des résultats pour étudier les principales souches et itérative améliorer la conception de stent pour obtenir une souche principale de 20%, ce qui est inférieur à la limite de l'échec de la matière .
2. Stent fabrication et les essais pour le sertissage et expansion
- Stent fabrication
- Obtenir les 2205 tubes en acier inoxydable par le forage des armes à feu et la précision bar à broyer la matière à une entreprise d'usinage de précision tels que l'action Precision Products dans Pioneer,OH.
- Transférer les tubes au sol de précision et la conception modèle de stent à plat pour une entreprise de stent coupe comme Laserage Technology Corporation à Waukegan, IL pour la coupe et le polissage électrolytique laser.
- Passiver la surface des stents en les immergeant électropoli dans un acide fort (HCl 50%) pendant 10 min, suivie par une base (10% de NaHCO 3) pour un autre 10 min. ATTENTION: manipuler des produits chimiques avec un équipement de protection approprié et sous une hotte. Enfin, lavez les stents à l'alcool éthylique et de l'eau déminéralisée. Ce processus est appelé décapage à l'acide.
- Essai de stent fabriqué pour le sertissage et l'expansion
- Sertir le stent sur un ballon à trois volets en utilisant une main tendue outil de sertissage. Tenez le stent et le ballon à trois volets dans l'outil de sertissage. Appuyez sur la poignée pour déformer radialement le stent à être sertie sur le ballon.
- Inspectez le stent serti en utilisant un microscope pour uniforme sertissage et aucun signe de défaillance de la structure en raisonà déformation plastique.
- Développer pour le diamètre de 3 mm conçu en pressurisant le ballon à trois volets avec de l'eau. Examiner les stents élargis pour les fractures microscopiques et l'expansion uniforme.
3. Caractérisation de stent pour le champ magnétique conservée
REMARQUE: aimant cylindrique de 2 pouces de diamètre et 1 pouce de hauteur a été utilisé dans cette étude. Les pôles de l'aimant sont alignés le long de l'axe. La densité de surface de flux magnétique de l'aimant est d'environ 1 T.
- Magnétiser les stents diamétralement ou axialement l'aide d'un aimant néodyme forte. Tenez le stent à proximité de l'aimant puissant pour environ 1 min pour la magnétisation.
- Maintenir l'extenseur sur l'une des faces plates avec son diamètre le long des lignes de champ magnétique d'être magnétisés diamétralement ou tenir le stent à côté de la surface cylindrique avec son axe le long des lignes de champ magnétique pour magnétiser axialement. Fiel magnétique retenuD du stent a été jugée stable pendant au moins 24 heures, mais utiliser le stent dès que possible après aimantation.
- Montez les stents individuellement sur des mandrins de verre et puis montez les mandrins de verre dans le mandrin de précision de l'appareil de sondage magnétique. Sonde de microcapteurs magnétiques peut être positionné précisément à proximité du stent sans toucher la surface en utilisant la scène XYZ ensemble de l'appareil de sondage magnétique (Figure 4).
- Mesurer la lecture de référence du micro magnétique loin du stent, puis mesurer le champ magnétique retenu à la surface de l'endoprothèse en positionnant la sonde en utilisant les stades XYZ de l'appareil de sondage magnétique.
4. Études cellule de capture magnétiques
- Obtention de cellules, l'étiquetage avec SPION et coloration avec un colorant fluorescent
- Dériver les cellules endothéliales excroissance (COE) du sang périphérique porcine comme décrit dans 5,7. Culture dans un flacon T-75 until environ 80% de confluence (5x10 6 à 8x10 6 cellules).
- Synthétiser SPIONs que le diamètre de 10 nm de la magnétite (Fe 3 O 4) de noyau entouré par 50 nm d'épaisseur de poly (lactique-co-acide glycolique) (PLGA) comme décrit dans l'enveloppe 8,9.
- Incuber les COE dérivé avec SPION à une concentration de 200 ug / ml de milieu de culture cellulaire de 16 h à 37 o C.
- Aspirer le milieu de culture cellulaire doucement. Laver avec précaution les cellules en ajoutant 10 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le ballon, à bascule, et en aspirant le PBS.
- Colorer les cellules avec un colorant fluorescent (CM-Dil) pour visualiser lors des expériences. Ceci est réalisé selon les instructions du fabricant en ajoutant le colorant à 10 ml de milieu de culture cellulaire à une concentration de 5 ul / ml et l'incubation avec les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
- Laver les cellules avec du PBS comme à l'étape 4.1.4 et incuber avec 3 ml de solution de trypsine-EDTA 0,25% pendant 5 minutes à 37 ° C etlever les cellules de la fiole.
- Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml, de haut avec du PBS, et centrifuger à 500 g pendant 5 min pour former un culot cellulaire.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS à une concentration de 1-2x10 6 cellules / ml et bien mélanger par pipetage dans et hors du tube conique à plusieurs reprises.
- Des études in vitro de cellules
- Concevoir et fabriquer (par exemple, l'impression 3D), un appareil simple pour tenir le stent juste au-dessus de la surface d'une lamelle de verre.
- Démagnétisez un stent à l'aide d'un démagnétiseur électromagnétique ou magnétiser un stent diamétralement ou axialement l'aide d'un aimant néodyme forte.
- Pipeter l'EOC de SPION marqué en suspension dans PBS dans le plat contenant les stents de contrôle axialement magnétisés ou diamétralement magnétisés ou non magnétisées. Image les stents avec EOC en suspension dans PBS immédiatement pour fluorescence à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence.
- Implantation d'un stent
- Dessinez le sang périphérique à partir de 4 porcs Yorkshire sains - pesant environ 50 kg - 3 semaines avant l'implantation du stent, respectivement, et la culture COE comme décrit dans 5,7.
- Administrer un médicament anti-plaquettaire à partir de 3 jours avant la chirurgie (aspirine 325 mg et clopidogrel 75 mg par jour).
- Le jour stent implantation, anesthésier les porcs avec intramusculaire Telazol, xylazine, et de l'atropine (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, respectivement) comme indiqué dans les soins des animaux et de l'utilisation des directives institutionnelles applicables.
- Intuber et placer le porc sur l'inhalation de 1-2,5% isoflurane.
- Rasez la région du cou ventrale du porc et de mener la procédure dans des conditions stériles générales.
- Implant 1 magnétisé et 1 stent non-aimanté dans l'artère coronaire droite (RCA) en utilisant la technique de cathétérisme cardiaque standard.
- Catheterisation des animaux doit être réalisée par un cardiologue interventionnel formés. Accéder à l'artère carotide droite avec une gaine 9 français.
- Cathétériser l'artère coronaire cible et d'injecter un colorant de contraste iodé pour obtenir des images de radioscopie.
- Placer un fil de guidage coronaire norme 0,014 pouce dans l'artère. Avancer le ballon et le stent en utilisant ce fil de guidage et de déployer le stent dans un vaisseau 3-3,5 mm de diamètre.
- Occlure le flux sanguin à l'intérieur de l'extrémité proximale de RCA les stents implantés au moyen d'un ballonnet sur fil et d'environ 2x10 6 fournir EOC autologues marquées avec SPION en suspension dans 4 ml de PBS par l'intermédiaire du cathéter central sur une période de 2 min.
- Restaurer le flux sanguin vers le RCA après 2 min d'occlusion supplémentaire.
- Transférer l'animal à la salle de récupération et de suivre de près l'animal jusqu'à ce qu'il a repris conscience.
- Continuer à administrer des médicaments anti-plaquettaire (aspirine 325 mg et clopidogrel 75 mg) après l'opération jusqu'au sacrifice.
- Expiant stent et l'histologie
- Euthanasier les animaux 7 jours après la chirurgie par abord anesthésier l'animal comme expliqué précédemment, puis administrer par voie intraveineuse une dose létale de pentobarbital de sodium (100 mg / kg) que par le soin des animaux et de l'utilisation des directives institutionnelles applicables.
- Récolter chirurgicalement les segments artériels stentées. Fixer les artères explantées dans un tampon de formol à 10% pour un minimum de 30 min. Laissez les échantillons dans un tampon de formol pour une analyse ultérieure histologique.
- Externaliser l'échantillon fixe d'installations capables d'effectuer l'histologie avec les stents métalliques. Au cours de ce traitement, les échantillons sont incorporer dans le méthacrylate de méthyle, en coupe transversale, et analysés histologiquement en utilisant la technique de coloration de Mallory avec taches bleu de Prusse pour les particules de fer.
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Representative Results
Conception de stent itératif basé sur FEA (Figure 1) a montré un stent qui peut sertir et étendre avec une souche principale de 20%, ce qui est moins que la déformation à la rupture de 30%. Sertissage et l'essai d'expansion (figure 2) ne présentaient aucun signe de fracture. Photos du stent déformé ont montré une bonne entente avec déformations FEA calculés et aussi des photos microscopie montré aucune fracture (Figure 3). Comme on s'y attendait à partir des mesures de champ magnétique conservés (figures 4 et 5), les cellules ont été marquées SPION de préférence attirées vers les segments courbés axialement magnétisés dans des stents et plus uniformément attirés par segments rectilignes diamétralement magnétisés dans stents (figure 6). Images histologiques ont montré une coloration de fer à proximité des entretoises de stent établissant EOC attraction et la rétention de l'endoprothèse vasculaire au cours de la période d'implantation de 7 jours (figure 7).
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Figure 1. modélisation de stent et le débit d'analyse graphique. Le schéma montre la modélisation assistée par ordinateur et analyse par éléments finis montrant un processus étape par étape appliquée à un inoxydable stent 2205 acier. Modifié à partir Uthamaraj et al. 2 014 6 avec la permission de réimpression.
Figure 2. stent en acier inoxydable sertissage et d'expansion. Découpe laser et un stent électropoli) comme coupe, b) serties sur un cathéter à ballonnet à trois volets, et c) élargi à 3 mm en utilisant le ballon à trois volets. Modifié à partir Uthamaraj et al. 2 014 6 avec la permission de réimpression.
Figure 3. inspection microscopique du stent. La microscopie optique a été utilisé pour l'image du stent expansé qui a été comparée à la simulation par éléments finis.
Configuration de phase de mesure 4. la sonde magnétique de la figure. Les étapes XYZ et les étapes de rotation ont été assemblés pour positionner les stents et la sonde magnétique pendant les mesures de champs magnétiques.
Figure 5. magnétiques régions de mesure de champ sur un stent et les valeurs de mesure. L'image montre les champs magnétiques retenues mesurées de 2205 stents dans des configurations axialement magnétisés et diamétralement magnétisés. Modifié à partir Uthamaraj et al. 2 014 6 avec la permission de réimpression.
Figure 6. Des études in vitro sur les cellules de capture. Images de microscopie de fluorescence de 2205 stents en acier inoxydable présentant capture cellulaire dans (A) non-magnétisé stent, (B) diamétralement magnétisé stent et (C) à aimantation axiale. Stent Modifié à partir Uthamaraj et al. 2 014 6 avec la permission de réimpression.
Figure 7. Images de coupes histologiques de stentées segments de l'artère coronaire de (A) stent magnétique avec coloration de fer bleu près de la jambe de force et (B) non magnétique stent de contrôle montrant aucune coloration bleue près de la jambe. Les échantillons ont été colorées en utilisant la coloration de Mallory technique avec des particules de fer sCONTIENT avec taches bleu de Prusse. Le symbole "*" indique les endroits stent d'entretoises. Modifié à partir Uthamaraj et al. 2 014 6 avec la permission de réimpression.
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Discussion
Nous avons développé un stent magnétique qui peut fonctionner comme un stent en métal nu et peut attirer les cellules endothéliales Spion marqué. Dans des études précédentes impliquant des stents magnétiques, les chercheurs ont utilisé nickel stents actifs commerciaux et des bobines ou des mailles en matériaux magnétiques en raison de l'indisponibilité d'un stent ferromagnétique 5,10-14. D'autres groupes ont également utilisé la nature paramagnétique disponibles dans le commerce de l'acier inoxydable 304 stents-grade pour cibler les nanoparticules chargées cellules endothéliales 3. Revêtements de nickel peut être allergique aux patients recevant les stents et les stents paramagnétiques besoin d'un champ magnétique externe pour attirer et retenir des nanoparticules magnétiques 3,5. Par conséquent, le développement et la conception d'un stent ferromagnétique fonctionnel est important pour les applications d'administration de cellules ainsi que d'autres applications cliniques 10,15-20. La nature duplex du matériau choisi pour cette étude - en acier inoxydable 2,205 - rend wEakly ferromagnétique. En outre, l'acier inoxydable présente une déformation 2,205 ultime inférieure de 30% par rapport à d'autres aciers inoxydables utilisés pour fabriquer des stents tels que l'acier inoxydable 316L (70%) 6,21,22.
Basé sur cette nouvelle application en acier inoxydable 2205, le protocole présenté dans cette étude explique les méthodes pour concevoir, fabriquer et tester un stent faiblement magnétique. Tout d'abord, un modèle de conception de stent simple a été développé en utilisant un modèle de stent existant comme un guide. Les résultats des simulations ont suggéré que FEA matériel nécessaire pour être ajoutés à des segments courbés de l'endoprothèse vasculaire pour obtenir une déformation principale maximale de 20%, ce qui est inférieur à la déformation à la rupture du matériau. La conception de stent final avait une épaisseur d'entretoise de 90 um. Deuxièmement, les stents ont été fabriqués magnétisés et leurs champs magnétiques retenus ont été mesurées. L'intensité du champ magnétique de la retenue inoxydable stent 2205 de l'acier dépend de l'orientation du champ magnétique appliqué
CAD et FEA utilisée dans notre étude peuvent être appliquées pour la conception et l'analyse des ballons similaire stents expansibles appropriée. Dans le protocole actuel, Les étapes 1.2.5, 1.2.6, 1.2.7 et sont essentiels pour la mise en place des conditions aux limites et affectation des biens matériels et sont nécessaires pour concevoir correctement un stent. Résultant aimantées 2205 stents en acier inoxydable implantés dans les grands animaux a montré capture et la conservation cellule. Les étapes 5.1.7 et 5.1.8 sont également essentiels pour assurer l'ensemencement des cellules appropriée sur les stents aimantés. En outre, l'introduction de cellules dans le site d'implantation du stent magnétique pendant 2 min une occlusion est propre à notre étude présentée.
Les stents développés dans l'étude actuelle ont pu endothélialiser rapidement et résister à court terme l'implantation, mais on ne sait pas si les stents peuvent résister à l'implantation à long terme. À ce jour, les matériaux ferromagnétiques ont pas été étudiés afin de comprendre leurs limites pour des applications cliniques. Cependant, nos données d'implantation de porc 7 jours a montré que l'acier inoxydable 2205 avait bon sang et compatibilité tissulaire. Les méthodes présentées dans cette étude ne fontt abordent les techniques d'essais mécaniques de pointe des stents tels que les essais de fatigue ou de l'interaction à long terme du matériau magnétique avec le sang 24-28. En outre, la faible nature de l'acier inoxydable ferromagnétique 2205 est capable de capturer les cellules marquées magnétiquement, mais un nouveau matériau avec des propriétés magnétiques forts peut améliorer la capture cellulaire. Des recherches supplémentaires sont également nécessaires pour étudier la biocompatibilité et à long terme la sécurité des matériaux ferromagnétiques. Les cellules endotheliales excroissance utilisés dans cette étude ont été obtenues en suivant un protocole précédemment publié qui montre comment isoler et caractériser les cellules endotheliales excroissance 5,7. L'étude actuelle a également été limité par le petit nombre d'animaux.
En résumé, endothélialisation rapide des stents a été limitée à ce jour en raison de l'indisponibilité de dispositifs de livraison optimales et une mauvaise adhérence des cellules endothéliales. Les stents ferromagnétiques développés dans cette étudeont l'avantage de fonctionner comme un BMS tout en offrant suffisamment de champ magnétique retenu pour capturer les cellules endothéliales magnétiquement marqués. Dans le cadre de nos études poursuivies d'effets d'implantation à long terme, les stents ont besoin de subir des tests mécaniques et biocompatible plus rigoureuse. Le stent développé dans cette étude montre la grande promesse comme stent ferromagnétique fonctionnelle capable de capturer des cellules endothéliales et la rétention et les méthodes présentées dans cette étude peut être utilisé pour le développement futur et les tests stent.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2205 Stainless steel | Carpenter Technology Corporation | Round bar stock material | |
| Abaqus | Dassault systems | Software | |
| Atropine | Prescription drug. | ||
| Clopidogrel | Commercial name: Plavix. Prescription drug. | ||
| CM-DiI | Life Technologies | V-22888 | Molecular Probes, Eugene, OR |
| Endothelial growth medium-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Hand Held Crimping tool | Blockwise engineering | M1-RMC | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | MFCD00011324 | CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood |
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care, Inc. | ||
| Ethyl alcohol | Sigma Aldrich | MFCD00003568 | |
| NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick | Amazing magnets | D1000P | Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces |
| Over-The-Wire trifold balloon | Any commercially available OTW trifold balloon can be used | ||
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | Commonly known as PBS |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | MFCD00003528 | |
| Sodium pentobarbital | Zoetis | Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi. Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian | |
| SolidWorks | Dassault systems | Software | |
| SpinTJ-020 micro sensor | MicroMagneitcs Sensible Solutions | Long probe STJ-020 microsensor | |
| SPION | Mayo Clinic | Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004)) | |
| Telazol | Zoetis | Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200-056 | Gibco, Grand Island, NY |
| Xylazine | Bayer Animal Health | Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian |
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