Summary
I nostri obiettivi erano di progettare, produrre e testare stent ferromagnetici per la cattura delle cellule endoteliali. Dieci stent sono stati testati per la frattura e altre 10 stent sono stati testati per magnetismo mantenuto. Infine, 10 stent sono stati testati in vitro e altre 8 stent sono stati impiantati in 4 maiali per mostrare la cattura e la conservazione delle cellule.
Abstract
È necessario un rapido endotelizzazione di stent cardiovascolari per ridurre la trombosi dello stent e per evitare la terapia anti-piastrinica che può ridurre il rischio di sanguinamento. La possibilità di utilizzare forze magnetiche per catturare e trattenere le cellule endoteliali escrescenza (EOC) marcate con nanoparticelle di ossido di ferro super-paramagnetiche (spion) è stato indicato in precedenza. Ma questa tecnica richiede lo sviluppo di uno stent meccanicamente funzionale da un materiale magnetico e biocompatibile seguita da in-vitro e in vivo alcune prove endotelizzazione rapida. Abbiamo sviluppato uno stent debolmente ferromagnetico in acciaio inox 2205 duplex utilizzando computer aided design (CAD) e il suo design è stata ulteriormente raffinata con analisi agli elementi finiti (FEA). Il disegno finale dello stent mostrato una deformazione principale sotto del limite frattura del materiale durante crimpatura meccanica ed espansione. Cento stent sono stati fabbricati e un loro sottoinsieme è stato utilizzato per prove meccaniche, retained misure di campo magnetico, studi in vitro di cattura delle cellule, e in vivo studi di impianto. Dieci stent sono stati testati per la distribuzione per verificare se sono sostenuti aggraffatura e l'espansione del ciclo senza guasti. Altri 10 sono stati magnetizzati con stent un forte magnete al neodimio e il loro campo magnetico conservato è stato misurato. Gli stent hanno mostrato che il magnetismo trattenuto era sufficiente a catturare spion marcato EOC nei nostri studi in vitro. Spion marcato EOC cattura e la conservazione sono stati verificati in modelli animali di grandi dimensioni mediante l'impianto di stent 1 magnetizzato e 1 stent controllo non magnetizzato in ognuno dei 4 maiali. Le arterie stent sono stati espiantati dopo 7 giorni e analizzati istologicamente. Gli stent debolmente magnetici sviluppati in questo studio sono stati in grado di attrarre e trattenere le cellule endoteliali spion marcato che possono promuovere una rapida guarigione.
Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Utilization (IACUC) presso la Mayo Clinic.
1. Progettazione e analisi di un 2205 in acciaio inossidabile Stent
- Progettare un stent di metallo nudo con CAD
- Effettuare un cilindro cavo estruso selezionando in funzione 'Estrusione / base' con lo spessore di parete pari allo spessore stent puntone.
- Progettare un modello di stent su un piano di schizzo diverso tangente al cilindro estruso. Effettuare la larghezza del modello piatto per abbinare la circonferenza del cilindro cavo estruso.
- Trasferire sul cilindro cavo utilizzando la funzione di avvolgere il design modello piatto.
- Salvare la parte nel suo formato nativo e anche in formato ACIS deve essere esportato per FEA.
- Analisi agli elementi finiti per i modelli stent
- Importare la geometria solida salvato in formato ACIS nel modulo parte del software FEA per ulteriori analysè.
- Modello 2 cilindri analitici coassialmente allo stent nella parte modellatore del software FEA. Il cilindro esterno ha un diametro iniziale maggiore del diametro dello stent per simulare la pressa e il cilindro interno ha un diametro iniziale di 1 mm per simulare un pallone per gonfiaggio.
- Fare doppio clic sulla voce di albero del modellatore assemblea 'casi' di montare sopra dette parti in posizioni relative.
- Utilizzare il modulo di maglia del software FEA, specificare il tipo di elemento come 20 nodi elemento esaedrica con l'integrazione ridotta, specificare le dimensioni dell'elemento, e maglie dello stent.
- Specificare attrito coppie a contatto rigide tra lo stent e due cilindri, rispettivamente nelle "Proprietà" della interazione del modello.
- Assegnare comportamento sforzo-deformazione elasto-plastico di acciaio inossidabile 2205 al modello dello stent.
- Definire condizioni al contorno per crimpare primo luogo il cilindro esterno di 1 mm che simula il cRimping dello stent. Rimuovere il cilindro esterno per simulare il rilassamento dello stent crimpato. Espandere il cilindro interno di 3 mm per simulare l'espansione e, infine, rimuovere il cilindro interno per simulare recoil dello stent.
- Definire i parametri di simulazione, tra cui il numero di processori e quantità di RAM allocati nella voce albero modello di 'Analisi' ed eseguire la simulazione.
- Una volta che la simulazione, aprire il file risultato (filename.odb) e post-elaborare i risultati di studiare le deformazioni principali e migliorare iterativamente il disegno stent per ottenere una deformazione principale del 20%, che è inferiore al limite cedimento del materiale, .
2. Stent fabbricazione e la sperimentazione per la piegatura e di espansione
- Stent fabbricazione
- Ottenere i tubi in acciaio inossidabile 2205 di pistola foratura e molatura di precisione barra magazzino materiale presso una società di lavorazioni meccaniche di precisione, come azione di precisione Prodotti in Pioneer,OH.
- Trasferire i tubi a terra di precisione e il modello di progettazione dello stent piatta ad una società di stent taglio come Laserage Technology Corporation a Waukegan, IL per taglio laser e elettrolucidatura.
- Passivare la superficie degli stent elettrolucidate da essi submersing in un acido forte (50% HCl) per 10 minuti seguiti da una base (10% NaHCO3) per altri 10 min. ATTENZIONE: maneggiare sostanze chimiche con i dispositivi di protezione adeguata e sotto una cappa aspirante. Infine, lavare gli stent con alcool etilico e acqua deionizzata. Questo processo è chiamato decapaggio acido.
- Prove di stent fabbricati per la piegatura e l'espansione
- Crimp lo stent su un pallone a tre ante con una mano tesa strumento di piegatura. Tenere lo stent e il pallone a tre ante in pinza. Premere la maniglia per deformare radialmente lo stent da crimpare sul pallone.
- Ispezionare lo stent a pressare utilizzando un microscopio per uniforme aggraffatura e qualsiasi segno di fallimento nella struttura a causaper deformazione plastica.
- Espanderlo al diametro progettato 3 mm pressurizzando il palloncino a tre ante con acqua. Esaminare gli stent espanso per le fratture microscopiche e l'espansione uniforme.
3. Caratterizzazione di stent per Retained Campo Magnetico
NOTA: magnete cilindrico del diametro di 2 pollici e 1 pollice di altezza è stato utilizzato in questo studio. I poli del magnete sono allineate lungo l'asse. La densità di flusso magnetico superficiale del magnete è di circa 1 T.
- Magnetizzare gli stent diametralmente o assiale con un forte magnete al neodimio. Tenere il stent vicino al magnete forte per circa 1 min per la magnetizzazione.
- Tenere il stent su una delle facce piane con il suo diametro lungo le linee del campo magnetico per essere magnetizzate diametralmente o tenere lo stent accanto alla superficie cilindrica con asse lungo le linee del campo magnetico per magnetizzare assialmente. Fiel magnetico a nuovod dello stent è risultato essere stabile per almeno 24 ore, ma utilizzare lo stent non appena possibile dopo magnetizzazione.
- Montare gli stent individualmente su mandrini di vetro e poi montare i mandrini di vetro nel mandrino precisione dell'apparecchio sondaggio magnetica. Sonda microsensore magnetica può essere posizionata con precisione vicino allo stent senza toccare la superficie con la XYZ fasi di montaggio del dispositivo di tastatura magnetica (Figura 4).
- Misurare la lettura basale della microsensore magnetico lontano dallo stent e quindi misurare il campo magnetico trattenuto sulla superficie dello stent posizionando la sonda con le fasi XYZ del proiettore tastatura magnetica.
4. magnetici Studi cellulare Capture
- Ottenere cellule, l'etichettatura con spion e colorazione con colorante fluorescente
- Derivare le cellule endoteliali escrescenza (EOC) da sangue periferico suino come descritto in 5,7. Cultura in un pallone T-75 until circa l'80% confluenti (5x10 6 a 8x10 6 cellule).
- Sintetizzare SPIONs come diametro di 10 nm magnetite (Fe 3 O 4) nucleo circondato da 50 poli di spessore nm (lattico-co-glicolico acido) (PLGA) Coperture come descritto in 8,9.
- Incubare la EOC derivato con spion ad una concentrazione di 200 ug / ml di mezzo di coltura cellulare per 16 ore a 37 ° C.
- Aspirare il mezzo di coltura cellulare delicatamente. Lavare delicatamente le cellule aggiungendo 10 ml di tampone fosfato salino (PBS) al pallone, dondolo, e aspirare il PBS.
- Colorare le cellule con colorante fluorescente (CM-DII) per la visualizzazione durante gli esperimenti. Ciò avviene secondo le istruzioni del fabbricante aggiungendo il colorante a 10 ml di mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione di 5 microlitri / ml e incubando le cellule con per 30 minuti a 37 ° C.
- Lavare le cellule con PBS come al punto 4.1.4 e incubare con 3 ml di 0,25% soluzione di tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C persollevare le cellule dal pallone.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml, rabboccare con PBS e centrifugare a 500 xg per 5 min a formare un pellet di cellule.
- Risospendere il pellet cellulare in PBS ad una concentrazione di 1-2x10 6 cellule / ml e miscelare accuratamente pipettando in e fuori del tubo conico più volte.
- Studi in vitro di cellule
- Progettare e fabbricare (ad esempio, stampa 3D) un semplice attrezzo per tenere lo stent appena sopra la superficie di un vetrino di vetro.
- Smagnetizzare uno stent utilizzando un degausser elettromagnetica o magnetizzare uno stent diametralmente o assiale con un forte magnete al neodimio.
- Pipettare il EOC spion marcato sospesa in PBS nel piatto contenente gli stent di controllo assiale magnetizzati o diametralmente magnetizzate o non magnetizzate. Immagine gli stent con EOC sospesa in PBS immediatamente per la fluorescenza usando un microscopio a fluorescenza invertito.
- Impianto di stent
- Disegna sangue periferico da 4 maiali Yorkshire sani - peso di circa 50 kg - tre settimane prima di impianto di stent, rispettivamente, e la cultura EOC come descritto in 5,7.
- Somministrare farmaci anti-piastrinici di partenza 3 giorni prima dell'intervento (aspirina 325 mg e clopidogrel 75 mg al giorno).
- Il giorno impianto dello stent, anestetizzare i maiali con intramuscolare Telazol, Xilazina, e atropina (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, rispettivamente), come indicato nelle linee guida istituzionali applicabili cura degli animali e l'uso.
- Intubare e posizionare il maiale inalazione di 1-2,5% anestesia isoflurano.
- Radere la regione ventrale del collo del maiale e condurre la procedura in condizioni sterili generali.
- Implant 1 magnetizzato e 1 stent non magnetizzato nell'arteria coronaria destra (RCA) usando la tecnica di cateterizzazione cardiaca standard.
- Catheterizzazione di animali deve essere effettuata da un cardiologo interventista addestrato. Accedere alla carotide destra con una guaina French 9.
- Incannulare l'obiettivo coronarica e iniettare mezzo di contrasto iodato per ottenere immagini fluoroscopiche.
- Mettere un filo guida coronarico standard di 0.014 pollici nell'arteria. Far avanzare il palloncino e stent utilizzando questo filo guida e distribuire il stent in un vaso di diametro 3-3,5 mm.
- Occludere il flusso di sangue all'interno prossimale RCA agli stent impiantati utilizzando un over pallone filo e fornire circa 2x10 6 EOC autologo marcato con spion sospeso in 4 ml di PBS attraverso il catetere centrale su un periodo di 2 min.
- Ripristinare il flusso di sangue al RCA dopo 2 min di occlusione aggiuntivo.
- Trasferire l'animale alla sala di risveglio e monitorare attentamente l'animale fino a che non ha ripreso conoscenza.
- Continuare a somministrare farmaci anti-piastrinici (aspirina 325 mg e clopidogrel 75 mg) inviare operativamente fino sacrificio.
- Espianto stent e istologia
- Euthanize gli animali 7 giorni dopo l'intervento dapprima anestetizzare l'animale come spiegato precedentemente e quindi somministrare per via endovenosa una dose letale di pentobarbital sodio (100 mg / kg) secondo le linee guida istituzionali applicabili cura degli animali e di uso.
- Chirurgicamente raccogliere i segmenti arteriosi stent. Fissare le arterie espiantati in 10% formalina tampone per almeno 30 min. Lasciare i campioni in buffer di formalina per ulteriori analisi istologica.
- Esternalizzare il campione fissato alle strutture in grado di svolgere l'istologia con stent di metallo. Durante questo processo, i campioni vengono incorporare in metilmetacrilato, in sezione, e analizzati istologicamente usando la tecnica di colorazione di Mallory con Prussia macchia blu per particelle di ferro.
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Representative Results
Disegno stent iterativo basato su FEA (Figura 1) ha mostrato uno stent che può crimpare ed espandere con un ceppo principale 20%, che è inferiore al 30% deformazione ultima. Piegatura e di prova di espansione (Figura 2) non ha mostrato segni di frattura. Immagini di stent deformato mostrato buon accordo con deformazioni FEA calcolate e anche foto microscopia mostrato fratture (Figura 3). Come previsto dalle misure di campo magnetico a nuovo (figure 4 e 5), le cellule spion marcati sono stati preferenzialmente attratti da segmenti piegati a stent assialmente magnetizzate e più uniforme attratti da segmenti rettilinei di stent diametralmente magnetizzati (figura 6). Istologia immagini mostrano colorazione ferro prossimità delle maglie dello stent comprovanti EOC attrazione e retention allo stent durante il periodo di impianto 7 giorno (Figura 7).
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Figura 1. modellazione stent e il flusso di analisi grafica. Lo schema mostra la modellazione computerizzata e analisi a elementi finiti che mostra un processo step-by-step applicato ad uno stent in acciaio inox 2205. Modificato da Uthamaraj et al. 2014 6 con il permesso ri-stampa.
Figura 2. stent in acciaio inossidabile di piegatura e di espansione. Tagliato al laser e stent elettrochimica a) come taglio, b) a pressare su un catetere a palloncino a tre ante, e c) ampliato a 3 mm con il palloncino a tre ante. Modificato da Uthamaraj et al. 2014 6 con il permesso ri-stampa.
Figura 3. L'esame microscopico di stent. La microscopia ottica è stato utilizzato per l'immagine dello stent espansa che è stato paragonato a simulazione FEA.
Figura 4. Sonda magnetica di impostazione fase di misurazione. Le tappe XYZ e le fasi di rotazione sono stati assemblati per il posizionamento dei stent e sonda magnetica durante le misurazioni del campo magnetico.
Figura 5. regioni di misura campo magnetico su uno stent ed i valori di misurazione. L'immagine mostra i campi magnetici a nuovo misurati 2205 stent in configurazioni assiale magnetizzati e diametralmente magnetizzati. Modificato da Uthamaraj et al. 2014 6 con il permesso ri-stampa.
Immagini Figura 6. Studi in vitro delle cellule di cattura. Microscopia a fluorescenza di 2205 stent in acciaio inox che mostrano la cattura delle cellule in (A) non magnetizzato stent, (B) stent diametralmente magnetizzato e (C) stent assialmente magnetizzato. Modificato da Uthamaraj et al. 2014 6 con il permesso ri-stampa.
Figura 7. Le immagini di sezioni trasversali istologiche di stent segmenti delle arterie coronariche di (A) stent magnetica con colorazione ferro blu vicino al puntone e (B) stent di controllo non magnetico mostrando alcuna colorazione blu nei pressi del puntone. I campioni sono stati colorati con colorazione di Mallory tecnica con particelle di ferro snuto con Prussia macchia blu. Il simbolo "*" indica località stent puntone. Modificato da Uthamaraj et al. 2014 6 con il permesso ri-stampa.
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Discussion
Abbiamo sviluppato uno stent magnetica che può funzionare come un stent di metallo nudo e in grado di attirare le cellule endoteliali spion marcato. In studi precedenti che coinvolgono stent magnetici, i ricercatori hanno usato nichel stent rivestiti commerciali e bobine o mesh in materiali magnetici a causa della indisponibilità di uno stent ferromagnetico 5,10-14. Altri gruppi hanno usato anche la natura paramagnetica attualmente in commercio stent in acciaio inox 304-grado per il targeting di nanoparticelle caricate cellule endoteliali 3. Rivestimenti di nichel possono essere allergizzanti per i pazienti che ricevono stent e stent paramagnetici bisogno di un campo magnetico esterno di attrarre e mantenere nanoparticelle magnetiche 3,5. Quindi, progettare e sviluppare uno stent ferromagnetico funzionale è importante per le applicazioni di consegna delle cellule, nonché altre applicazioni cliniche 10,15-20. La natura duplex del materiale scelto per questo studio - inox 2.205 - rende wEakly ferromagnetico. Inoltre, l'acciaio inossidabile 2205 ha una deformazione ultima inferiore del 30% rispetto ad altri acciai inossidabili utilizzati per realizzare stent come acciaio inossidabile 316L (70%) 6,21,22.
Sulla base di questa nuova applicazione di acciaio inossidabile 2205, il protocollo presentato in questo studio spiega i metodi per progettare, produrre e testare uno stent debolmente magnetica. Innanzitutto, un semplice modello di progettazione stent è stato sviluppato usando un modello di stent esistente come guida. I risultati delle simulazioni FEA suggerito che materiale necessario per aggiungere ai segmenti piegati della stent per ottenere una massima deformazione principale 20%, che è inferiore rispetto al ceppo di rottura del materiale. Il disegno finale stent aveva uno spessore di 90 micron puntone. In secondo luogo, gli stent sono stati fabbricati magnetizzati e loro campi magnetici non distribuiti sono stati misurati. L'intensità del campo magnetico mantenuto dello stent in acciaio inox 2.205 dipende l'orientamento del campo magnetico applicato
CAD e FEA utilizzato nel nostro studio possono essere applicati per la corretta progettazione e l'analisi di palloncino simile stent espandibili. Nel protocollo corrente, Passi 1.2.5, 1.2.6, 1.2.7 e sono fondamentali per la creazione delle condizioni al contorno e assegnazione di proprietà materiali e sono necessari per la progettazione di uno stent correttamente. Con conseguente magnetizzati 2205 stent in acciaio inox impiantati in animali di grandi dimensioni ha mostrato la cattura e la conservazione delle cellule. I passaggi 5.1.7 e 5.1.8 sono anche fondamentali per ottenere una corretta semina delle cellule su stent magnetizzate. Inoltre, l'introduzione di cellule al sito di impianto dello stent magnetica durante 2 minuti di occlusione è unica per il nostro studio presentato.
Gli stent sviluppati in questo studio sono stati in grado di endothelialize e sostenere l'impianto a breve termine rapidamente, ma non è chiaro se gli stent in grado di sopportare l'impianto a lungo termine. Fino ad oggi, materiali ferromagnetici, non sono stati studiati approfonditamente per capire i loro limiti per le applicazioni cliniche. Tuttavia, i nostri dati di impianto maiale 7 giorni ha dimostrato che l'acciaio inossidabile 2205 ha avuto buon sangue e la compatibilità dei tessuti. I metodi presentati in questo studio non fannot affrontare le tecniche di advanced prove meccaniche degli stent come prove di fatica o interazione a lungo termine del materiale magnetico con il sangue 24-28. Inoltre, la natura debole ferromagnetico inossidabile 2.205 era in grado di catturare le cellule marcate magneticamente, ma un nuovo materiale con forti proprietà magnetiche può migliorare la cattura delle cellule. Sono inoltre necessari ulteriori ricerche per studiare la biocompatibilità e la sicurezza a lungo termine di materiali ferromagnetici. Le cellule endoteliali escrescenza utilizzati in questo studio sono stati ottenuti seguendo un protocollo precedentemente pubblicato che ha mostrato come isolare e caratterizzare le cellule endoteliali escrescenza 5,7. L'attuale studio è stato anche limitato dal piccolo numero di animali.
In sintesi, la rapida endotelizzazione di stent è stato limitato finora causa della mancata disponibilità di dispositivi di erogazione ottimali e scarsa adesione delle cellule endoteliali. Gli stent ferromagnetici sviluppati in questo studiohanno il vantaggio di funzionare come un BMS fornendo anche abbastanza campo magnetico mantenuto per catturare le cellule endoteliali magneticamente marcate. Come parte dei nostri studi continui effetti di impianto a lungo termine, gli stent hanno bisogno di sottoporsi a più rigorosi test meccanici e biocompatibile. Lo stent sviluppato in questo studio mostra grande promessa come stent ferromagnetica funzionale capace di cattura delle cellule endoteliali e la ritenzione ed i metodi presentati in questo studio può essere usato per lo sviluppo futuro stent e test.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2205 Stainless steel | Carpenter Technology Corporation | Round bar stock material | |
| Abaqus | Dassault systems | Software | |
| Atropine | Prescription drug. | ||
| Clopidogrel | Commercial name: Plavix. Prescription drug. | ||
| CM-DiI | Life Technologies | V-22888 | Molecular Probes, Eugene, OR |
| Endothelial growth medium-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Hand Held Crimping tool | Blockwise engineering | M1-RMC | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | MFCD00011324 | CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood |
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care, Inc. | ||
| Ethyl alcohol | Sigma Aldrich | MFCD00003568 | |
| NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick | Amazing magnets | D1000P | Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces |
| Over-The-Wire trifold balloon | Any commercially available OTW trifold balloon can be used | ||
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | Commonly known as PBS |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | MFCD00003528 | |
| Sodium pentobarbital | Zoetis | Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi. Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian | |
| SolidWorks | Dassault systems | Software | |
| SpinTJ-020 micro sensor | MicroMagneitcs Sensible Solutions | Long probe STJ-020 microsensor | |
| SPION | Mayo Clinic | Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004)) | |
| Telazol | Zoetis | Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200-056 | Gibco, Grand Island, NY |
| Xylazine | Bayer Animal Health | Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian |
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