Protocol
培養培地、抗生物質の調製、及び2- [2-ニトロ-4-（トリフルオロメチル）ベンゾイル] -1,3-シクロヘキサンジオン（NTBC）
- 適切なボリュームにLBブロス（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、H 2 O中 0.25％のNaCl）、アリコートを行います。オートクレーブにより滅菌します。室温で保管してください。
- 250 mlのフラスコに100 mlのLB寒天培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.25％のNaCl、H 2 O中の1.5％寒天）を作ります。室温でオートクレーブとストアによって滅菌します。寒天プレートに注ぐ前に溶けていることを確認します。
注：LB寒天100mlを含有するフラスコを4板が得られます。 LB寒天培地の量は、アッセイに必要なプレートの数に対応するように変更することができます。 - PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、10mMのの Na 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4）16ください。室温でオートクレーブまたは濾過し、ストアによって滅菌します。
- ゲンタマイシンのための抗生物質のストック溶液を準備し、カナマイシン、Dトブラマイシン。
- Pの適切な抗生物質ストック濃度を準備100 mg / mlのゲンタマイシン、30 mg / mlのカナマイシン、および10mg / mlのトブラマイシンを含む緑膿菌菌株 。 4℃の水、フィルター滅菌し（0.2ミクロン）、および店舗での抗生物質を溶解します。研究細菌に応じて抗生物質および濃度を変更します。
- NTBCストック溶液を準備します。 DMSOの400μlのNTBC 10mgを溶解します。これは、75.9 mMのNTBCの濃度が得られます。 -20℃で保存NTBC原液。必要に応じて室温でソリューションを解凍します。
注：NTBCの異なるソースは、溶解度の差があります。メーカーの推奨に基づいて、NTBCを溶解し、それに応じてステップ1.5を調整するためにする適切な車両を決定します。
細菌株の2 NTBC滴定
- テストされる株の一晩培養を設定します。 16×150 mmの試験管に2 mlのLBブロスを加えますS（1株あたり1）と、各株から1に単離したコロニーを接種します。空気インキュベーター中で組織培養回転子に通気しながら37℃で一晩インキュベートします。
- 次の日は、LBブロス中でNTBCの滴定を準備します。異なる株がNTBCに対する感受性の違いを持っているので、0から900μMNTBCの初期範囲を使用してください。
- 1株あたり4〜5本の試験管（16×150ミリメートル）に1ミリリットルのLBブロスを追加します。
- 濃度の範囲内で試験管（16×150ミリメートル）にNTBC原液（75.9 mm）を追加します。 LBブロスの1mlに追加するには、NTBCの濃度とそれに対応する株式ボリュームについては、表1を参照してください。
- 一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelanin排除するためにOD 600読み取りを行う前に、文化を洗ってください。
- 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。上清を除去し、持つ任意の緩くペレット化した細胞ピペットとは、1ミリリットルのLB固体細胞ペレットを再懸濁
- OD 600 0.05で滴定チューブを接種します。チューブに接種するために必要な洗浄文化の量を計算します。
注：pyomelaninが存在してはならないので、予防接種のための洗浄の文化を使用してください。 - 空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で約24時間滴定チューブをインキュベートします。
- 滴定チューブを撮影し、MICおよび酸化ストレスアッセイのために使用するNTBCの量を決定するために、内および系統間で色素産生を比較します。無細胞培養上清中pyomelaninの量を決定し、細胞密度を決定するために、OD 600測定値を使用します。
注：細胞の培養上清中のpyomelaninのOD 600比は、NTBCで処理した後pyomelanin生産の違いを定量化するために計算することができます。
3.抗生物質の最小Inhibi96ウェルプレートでトリー濃度（MIC）アッセイ
- し、NTBCないLBにテストされる株の一晩培養を設定します。
注：このプロトコルは、300μMのNTBCの代表レベルを用いて説明します。使用されるNTBCの適切なレベルは、ステップ2.6で決定されます。- 2ミリリットルのLBに300μMのNTBCを追加無NTBC条件の2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の同等のボリュームを追加します。
- 滅菌爪楊枝を使用して、細菌のつの単離されたコロニーをチューブに接種。 NTBCと1つの培養し、各株についてNTBCせずに1つの培養があります。空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で一晩インキュベートします。
- 次の日、MICアッセイを設定するためのLB + NTBCし、LB + DMSOマスターソリューションを作ります。接種物は、300μMの最終濃度を得、追加されたときに、これは2倍に希釈されるように、600μMの濃度でNTBCを追加します。
- 1 antibiをテストするには1株について、耳、2ミリリットルのLBに600μMのNTBCを追加し、NTBCマスター溶液を作製するために混ぜます。 2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の等量を追加し、何のNTBCマスター溶液を作成しないように混ぜます。抗生物質の原液を作成するだけでなく、96ウェルプレート中の希釈系列を設定するため、これらのソリューションを使用してください。
注：マスター溶液製剤は、ピペッティングの誤差を考慮して余分な溶液が得られます。試験した抗生物質および株の数に応じて必要に応じてマスターソリューションは拡大または縮小することができます。
- 1 antibiをテストするには1株について、耳、2ミリリットルのLBに600μMのNTBCを追加し、NTBCマスター溶液を作製するために混ぜます。 2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の等量を追加し、何のNTBCマスター溶液を作成しないように混ぜます。抗生物質の原液を作成するだけでなく、96ウェルプレート中の希釈系列を設定するため、これらのソリューションを使用してください。
- LB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションの抗生物質溶液を調製します。
注：これらの溶液中の抗生物質濃度は、二重の最終的な所望の濃度にする必要があります。十分な溶液を、96ウェルプレートの4ウェルに100μlのを転送するようになされるべきです。- 64μgの/ mlのゲンタマイシン+/- NTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450にゲンタマイシン株式（100 mg / mlの）の0.288μlを添加しますμlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューション。
注：Pのゲンタマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、32μgの/ mlです。 - カナマイシン+/- 256 / mlのでNTBC原液を作ります。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにカナマイシンストック（30 mg / mlの）の3.84μlを添加します。
注：Pのカナマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、128μgの/ mlです。 - トブラマイシン+/- 8 / mlのでNTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにトブラマイシンストック（10mg / ml）の0.36μlを添加します。
注：Pの緑膿菌 PAO1、トブラマイシンの最大濃度は、4 / mlのです。
注：細菌を試験するために、抗生物質との濃度を調整することができます。
- 64μgの/ mlのゲンタマイシン+/- NTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450にゲンタマイシン株式（100 mg / mlの）の0.288μlを添加しますμlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューション。
- 96ウェルプレートの4つのウェルにそれぞれ2倍の抗生物質溶液100μlを追加します。 examplの行Aにこれらのソリューションを配置しますeは、ゲンタマイシンがA4を通じてA1に配置する必要があり、カナマイシンはA8を通じてA5に配置する必要があり、およびトブラマイシンはA12を通じてA9に配置する必要があります。セットアップ、96ウェルプレートの図については、図1Aを参照してください。
注：複数の抗生物質は、一枚のプレートで試験することができるが、唯一の1株は他の株からの交差汚染の可能性を排除するために、プレートごとにテストする必要があります。 - 96ウェルプレートのHを通じて行BにLB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液50μlを追加します。一方のプレートは、LB + NTBCであることを確認し、一方のプレートは、LB + DMSOです。 図1Aを参照してください。
- LB + NTBCにおける抗生物質のためのLB + NTBCを使用してください。 LB + DMSO中の抗生物質のためのLB + DMSOを使用してください。
- マイクロピペットを使用すると、ピペットチップを変更、Bのミックスにソリューションを行ごとにAから溶液50μlを転送することにより、抗生物質の2倍連続希釈を行い、のためのC.繰り返しを行ごとにBから溶液50μlを転送remainingの行。行Gを希釈した後、その行から溶液50μlを除去し、廃棄します。細菌の増殖のための抗生物質のないコントロールとしてH列を使用してください。 図1Bを参照してください 。
注：Gを通じて行Aの各ウェルは現在の2倍でLB + NTBCまたはLB + DMSO中の抗生物質、50μlの最終的な所望の濃度が含まれています。 H列は、抗生物質なしでLB + NTBCまたはLB + DMSOが含まれています。 - 一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelaninを排除するためにOD 600読み取りを行う前に、すべての文化を洗ってください。
- 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。ピペットで上清を除去し、1mlのLBに細胞ペレットを再懸濁
- LBの中で2.75x10 5 CFU / mlに一晩培養を希釈
注：1 OD 600ユニットは、Pの 1×10 9 CFU / mlと同等であると仮定緑膿菌 。 CFU / mlの変換へのODは、Dすることができます他の細菌でifferent。 - 適切なウェルに希釈した細菌培養物の50μlのを追加します。
注：NTBCで増殖させた培養物は、DMSO中で増殖させ、培養物NTBCを含むウェルに添加されるべきではDMSOを含有するウェルに添加されるべきです。 図1Bを参照してください 。- 各菌株と抗生物質濃度のための3つのウェルに細菌を追加します。細菌汚染のための対照として機能する第四ウェルにLB50μlのを追加します。 図1Bを参照してください 。
- 井戸を接種するために、マルチチャンネルピペットを使用してください。近隣の井戸の汚染を防止するために、接種材料を追加する際にピペットチップは、ウェルの底近くにあることを確認してください。
注：ウェルに細菌培養を追加すると、抗生物質とNTBC濃度2倍に希釈します。
- パラフィルムを有する96ウェルプレートを覆い、37℃で約24時間インキュベートします。空気インキュベーター中、静的96ウェルプレートをインキュベートします。
- 調べウェル中の細菌増殖のためのプレート。 MICには、細菌の増殖を、各株のすべての3つの複製のために見ていないされている抗生物質の最低濃度です。
- 視覚的な成長のためにプレートを調べたり、OD 600に設定し、プレートリーダーを用いて読み取ります。
酸化ストレス応答4.スポットプレートアッセイ
- ステップ3.1で説明したようにNTBCとないLB中でテストされる株の一晩培養を設定します。
- 翌日、酸化的ストレッサーとしてH 2 O 2を含有する LB寒天プレートを調製します。 0〜1 mMのからのH 2 O 2濃度の範囲は、良い出発点です。
- LB寒天フラスコを溶かします。室温で約50℃に冷却するメディア。
- 所望の濃度の冷却媒体に直接H 2 O 2 を追加します 。スワールフラスコを混合します。 H 2 O 2の濃度は 、表2を参照そして濃縮し、H 2 O 2のボリュームが追加されます。これらの値は、LB寒天100mlのに基づいています。
- すぐにH 2 O 2を添加した後 、プレートを注ぎ、気泡を除去するために表面を火炎。収率はLB寒天の100ミリリットル当たり4板です。マーク・H 2 O 2濃度でプレート。
- プレートから余分な水分を除去するために、30分間実行しているファンとの生物学的な流フードで明らかになったプレートを置きます。
注：プレート、それらが用意されている同じ日に使用します。そうしないと、一貫性のないデータになることがあります。
注：例えば、パラコートなどの酸化ストレスは、このアッセイにおけるH 2 O 2の代わりに用いることができます。他の酸化ストレスのために使用される濃度は、H 2 O 2のために使用されるものと異なってもよいです。
- 洗浄ステップ3.7で説明したように一晩培養のOD 600を測定します 。
- すべて一晩のcuのOD 600を正規化テストされている株のセットの最低値にltures。P.緑膿菌は、一般的に 、LB + NTBCまたはLB + DMSO中で一晩増殖させ、約2.5のOD 600を持っています。
- 1ミリリットルの全容量で最低のOD 600に文化を希釈するために必要な培養物の容量を決定します。例えば、培養物がOD 3の600を有しており、株のセットのための最小のOD 600が 2.5であり、次の計算実行する場合：（2.5）（1ミリリットル）=（3）（X）。 X = 0.833ミリリットル。文化の0.833ミリリットルをマイクロチューブ内に配置されます。
- 1mlに培養容量をもたらすために必要なLB + NTBC（300μM）またはLB + DMSOの量を計算します。ステップ4.4.1の例では、LB + NTBCまたはLB + DMSOの量は0.167ミリリットル（ - 0.833ミリリットル文化1ミリリットル総容量）になる培養液に添加。 LB + NTBCし、LB + DMSOのストック溶液は、すべての株を希釈するために必要な量に基づいて、これらの希釈液に使用するようにしてください。
- 文化とLB + Nを混ぜますボルテックスによってTBCまたはLB + DMSO。
- NTBCまたはDMSOの一定濃度で培養を維持するために、PBS + NTBCまたはPBS + DMSO中の正規化された一晩培養の10倍連続希釈を行います。
- PBS + NTBCし、PBS + DMSOのストック溶液を作ります。 1株についての希釈液の1セットでは、720μLの総容量を得るために、PBSで300μMのNTBCまたはDMSOの等量を混ぜます。テストされてどのように多くの株に応じて上下にこれらの株式をスケール。
- 10 -7の連続希釈10〜-1のラベルマイクロチューブ。適切なチューブにPBS + NTBCまたはPBS + DMSO90μlのを追加します。 LB + NTBCで成長した株について、PBS + NTBCを使用し、LB + DMSO中で成長した株をPBS + DMSOを使用しています。
- 適切な10 -1希釈チューブに文化の10μlのを追加します。ボルテックスで混合し、10 -2希釈チューブに10 -1希釈液10μlを移します。すべての希釈はperfoされるまで繰り返しますrmed。希釈液の間にピペットチップを変更します。
- 各株の重複でLB + H 2 O 2のプレートに10 -7希釈液を10〜-3のスポット5μlの。スポットがメッキされている場合は、ほとんどが少なくとも希（10 -7〜10 -3）に希釈から1ピペットチップを使用してください。液体がプレートに乾燥するまでプレートを傾けたり、傾けたりしないでください。
- 歪みに応じて、37℃（空気インキュベーター）で24〜48時間、プレートをインキュベートします。
注：P。緑膿菌 PAO1は、インキュベーションの24時間後に、LBの良いサイズのコロニーを持つことになります。それらがコロニーをPAO1とほぼ同じ大きさになるまで株を培養します。 - transluminator上にCCDカメラを用いてプレートを撮影。必要に応じて、同じサイズとは対照的と作物のために写真を編集します。酸化ストレスに対する感受性の変化を決定するために各スポットにコロニー数をカウントします。
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Representative Results
NTBC滴定
NTBCはP.でpyomelanin産生を減少させることができた場合にNTBC滴定を決定するために使用されました緑膿菌 、また、追加のアッセイにおける使用のためのpyomelanin生産性を排除または低減されるNTBCの濃度を特定します。そこ異なる複製で生産pyomelaninのレベルの変化であるが、一般的な傾向は一定のままであってもよいです。 NTBC滴定アッセイはまた、他の細菌に色素産生に影響を及ぼし得る他の化合物を試験するために変更することができます。視覚的に測定または定量することができる表現型の変化がある場合にのみ、しかし、動作します。
Pの pyomelanin産生株の治療NTBCと緑膿菌は、顔料製造12の用量依存性の減少をもたらした。 図2は 、Pの異なる株を示していますピョのレベルによって示されるように緑膿菌は 、NTBCに対する感受性の違いを持っていますメラニン産生。 NTBCのより高い濃度は、実験室株HMGA :: TN 18（ワシントン大学のPAO1トランスポゾン変異体ライブラリー）に比べて（ダラフランクから得た）臨床分離株のPA1111 17に生産をpyomelanin削減する必要がありました。 NTBC処置と色素沈着の変化を示さなかったpyomelanin [18（ワシントン大学のPAO1トランスポゾン変異体ライブラリー）は、TN（キャリーハーウッドから得た）PAO1 および HPD ::]を産生しない株。我々はpyomelanin生産は、実質的に実験室株HMGAに減少したため、我々のアッセイのために300μMのNTBCを使用することにしました:: TNを 、その濃度を使用して（0μMNTBCに300μMの比較します）。本研究で用いた全ての株は、15％グリセロール中で-80℃で保存しました。
抗生物質のMIC
抗生物質のMICは、いくつかの異なる方法を用いて試験することができます。ここで説明するマイクロタイタープレート法を使用することを可能にします抗生物質濃度の範囲をテストし、リソースの最小値を使用するには、r。結果は、簡単に複製され、アッセイは、試験されるべき生物の抗生物質感受性の差異を可能にするように修飾することができます。いくつかのバリエーションは、独立した実験の間に見ることができるが、傾向はかなり一致しています。技術的反復は同じMICを示すべきです。
表3は、異なるPの結果を示していますし、NTBC、様々なアミノグリコシド系抗生物質を含まない治療緑膿菌菌株 。三つの独立したコロニーを、以下に記載される方法、三連で試験しました。 MICはすべての3つの技術的反復で、細菌の増殖を阻害する抗生物質の最低濃度として記録しました。 NTBC処置は、試験した株についてのMICアミノグリコシド系に影響を及ぼさありませんでした。
酸化ストレススポットプレートアッセイ
酸化的ストレスを試験するためのスポットプレートアッセイreproduciblを与えますeは結果他のアッセイにおいて使用されるものよりもH 2 O 2のより低いレベルを使用して。 H 2 O 2なしのプレートは、各株についての希釈系列の精度を決定するだけでなく、酸化ストレスに細胞をさらすことなく、コロニーの大きさおよび各スポットにおけるコロニーの数を決定するための制御板です。最初のスポットは、H 2 O 2を含まない培地上のコロニーの無数を持つことになりますしながら、適切な希釈系列では、最終的なスポットは、非常に少数のコロニーを持っている必要があります。希釈系列内の各スポットでのコロニー数の10倍の差があるはずです。試験した全ての株について、コロニーの同様の番号は、H 2 O 2を含まない対照プレート上の同じ希釈で見られるべきです。
以下のような細菌の異なる株は、酸化ストレスに対して異なる感度、2 O 2濃度は、試験されるべきであるHの範囲を有することができます。 H 2 Oの濃度を増加させ
図3は Pの pyomelaninと非pyomelanin産生株のスポットプレートアッセイを示します緑膿菌 NTBCととせずに処理され、H 2 O 2誘発される酸化ストレスにさらされます。明確なdiffereがあります酸化ストレスに対する感受性のNCE生産菌をpyomelanin NTBCで処理し、また顔料を生成行うものに比べpyomelanin産生しない細菌の間でされています。自然に、または原因でNTBCの治療に、pyomelaninを生じなかった株は、pyomelaninを生産菌株よりも酸化ストレスに対してより敏感でした。
図1：最高開始濃度の2倍の抗生物質のセットアップ抗生物質のMICアッセイ96ウェルプレートの概略図（A）100μlをHを通じて行A.行Bにあるが、LB + NTBCまたはLB +のいずれかの50μlの充填されています抗生物質を含まないDMSO。 （B）2倍連続希釈液を各ウェルに2×の最終所望濃度に希釈された抗生物質の50μlの結果として、Gを介して行Aで行われます。行HはBのためによくコントロールです抗生物質を含まないacterial成長。 LBまたは接種物の50μlを、最終濃度の抗生物質に2倍に希釈し、適切なウェルに添加します。 LBは抗生物質で細菌汚染のコントロールとして機能します。 Gmは、ゲンタマイシン;キロ、カナマイシン;トブ、トブラマイシン。
図2：pyomelaninプロデューサとPの非生産者のNTBC滴定緑膿菌 。NTBCは、実験室および臨床pyomelanin生産において用量依存的にpyomelanin生産を減少させたが、pyomelaninを生成しない菌株で色素産生に影響を及ぼさありませんでした。参照12から変更されました。
図3：酸化ストレス応答のスポットプレートアッセイ細菌株は希薄でした。同じOD 600 D、連続10倍希釈し、H 2 O 2の様々な濃度を含有するLBプレート上にスポットしました。 0 mMのH 2 O 2のプレートの結果が異なる株に対して同じ希釈スポットのそれぞれにおけるコロニーの同様の番号で示されるように、すべての株が、適切に希釈したことを示しました。 H 2 O 2の濃度が増加するにつれて株は酸化ストレスに対してより感受性であったことをH 2 O 2を含有するプレートを示します。これは、無H 2 O 2状態、ならびにコロニーサイズの減少と比較して減少したスポットでのコロニー数によって示されます。参照12から変更されました。
| NTBCの最終濃度（μM） | （μl）を追加するためにNTBC（75.9ミリモル）の巻 |
| 0 | 0 |
| 50 </ TD> | 0.659 |
| 100 | 1.318 |
| 200 | 2.64 |
| 300 | 3.95 |
| 600 | 7.91 |
| 900 | 11.86 |
表1：この表は、さまざまなNTBCの濃度とNTBC株式の対応する量を与え、LBで滴定を設定するためのNTBCの濃度は 1ミリリットルのLBに追加します
| Hの最終濃度2 O 2（MM） | 9.79 H 2 O 2（30％重量）の量追加する（μL） |
| 0 | 0 |
| 0.2 | 2.04 |
| 0.4 | 4.09 |
| 0.6 | 6.13 |
| 0.8 | 8.17 |
| 1 | 10.21 |
表2：H 2 O 2の濃度は、酸化ストレスのスポットプレートアッセイのためにLB寒天に追加するには、この表では、様々なH 2 O 2濃度、100mlのLB寒天に追加する濃H 2 O 2の株式の対応する量を指定します。
| PAO1 - NTBC | PAO1 + NTBC | HMGA :: TN - NTBC | HMGA :: TN + NTBC | HPD :: TN - NTBC | HPD :: TN + NTBC | PA1111 - NTBC | L65 "> PA1111 + NTBC||
| ゲンタマイシン | 1 | 0.5 | 2 | 2 | 1 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| カナマイシン | 16 | 8 | 32 | 32 | 32 | 32 | 16 | 16 |
| トブラマイシン | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | 0.5 |
表3：抗生物質のMICの結果 3つの独立したコロニーをそれぞれストラ3連で試験しました。インチ参照12からの許可を得て再印刷。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Sigma-Aldrich | SML0269-50mg | Also called nitisinone. Soluble in DMSO. |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 216763-100ML | 30 wt. % in H2O. Stabilized. |
| Gentamicin | Gold Bio | G-400-100 | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
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