Introduction
결장 상피 라이닝 상주 줄기 세포가 수일마다 한 조직 보급과 고도로 재생 조직이다. 이러한 재생 처리는 증식 성 줄기 세포 구획의 유지 보수를 필요로한다. 시간이 지남에 따라 새로 생성 된 딸 세포는 증식 잠재력을 잃고 장의 내강면을 향해 이동한다. 마이그레이션과 일치는 전구 세포는 성숙한 배리어 형성 장 세포 또는 점액 생산 배 세포로 분화. 이 분화 프로그램의 실패는 염증성 장 질환 및 결장암 2,3-에서 관찰 된 바와 같이 상피 장벽을 저하에 기여하는 것으로 생각된다.
위의 과정의 자세한 연구는 토굴베이스 및 표면 세포 인구를 분리하는 방법이 필요합니다. 여러 방법이 고유 한 장점과 단점이 각각 존재한다. 장 상피 세포의 분리를위한 현재의 방법은 채널을 포함실험 조건에 의존하는 전체 4,5- 지하실, 상피 시트, 또는 단일 세포의 분리 결과 elating 에이전트 및 기계적 해리. 이러한 높은 수율의 방법이 있습니다, 아직 세포 간 신호의 변화는 네이티브 환경 6,7를 대표하지 않을 수 있습니다 이러한 조건에서보고되었다. 레이저 캡처 미세 절제는 공간 별개의 자료의 수집을 허용하지만, 저 분자량 수익률 8,9을 달성한다. 인간 결장 조직, 일련의 수평 저온 절편 방법 10이 개발되었다. 그러나 쥐의 점막 조직이 기술의 직접 처분에 대한 엄청나게 작다. 사람에서 대장 (지하실베이스 및 표면 세포 사이의 먼) 장 토굴 길이는 μm의 100-1,000 ~ 11 사이의 다릅니다. 마우스에서, 지하실 길이는 μm의 50-300 ~ 사이 (그림 1A 참조)이다. 쥐 지하실의 작은 크기는 솔라에 도전을 선물한다기존의 프로토콜을 사용하여 두 세포 집단의 기.
우리는 이제 저렴한 비용으로, 토굴베이스의 분리를위한 높은 수율 방법을 설명하고 쥐의 대장 조직에서 상피 세포 인구 표면. 이러한 방식으로 수확 된 조직을 면역 염색 한 다음, RT-PCR (실시간 중합 효소 연쇄 반응) 또는 웨스턴 블 롯팅을 포함하여 표준 하류 애플리케이션들에 의해 분석 될 수있다.
Protocol
실험은 나이 10 12 주 사이에 C57BL / 6 마우스를 사용했다. 동물을 사용하는 모든 절차를 검토하고에 모리 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 보건 기준의 국립 연구소에 따라 수행 하였다되었다.
1. 실험 설정
- 의 저온는 설정
- 마이크로톰 블레이드와 척을 포함, -20 ° C의 저온 유지 장치를 평형 (블레이드 주위에 극단적 인주의를 기울여야!).
- 10월와 빈 cryomold (최적의 절단 온도 화합물)를 작성하고 -20 ° C (~ 30 분)에 평형. 금형에서 냉동 OCT를 제거하고 액체 월에 척에 고정합니다. 마이크로톰 팔 블록 / 척을 배치하고 OCT를 10 분 동안 설정할 수 있습니다.
- 섹션 당 10 μm의 저온 유지 장치를 설정하고 평면 때까지 OCT의 블록을 면도. 몇 센티미터 떨어진 날로부터 마이크로톰 팔을 백업합니다. 이 시점에서 EXPER의 나머지 날 또는 척을 조정하지 마십시오iment.
- 면도날을 준비 : 샘플 당 2 면도날을 준비합니다. 금속 파일을 사용하여, 블레이드 에지의 sharped 무딘. 다음, 집게와 알루미늄 플랜지를 제거합니다.
- 드라이 아이스에 파이렉스 접시 또는 기타 평평한 표면을 사전 진정.
- 10 ~ 15 해부 핀 해부 접시를 준비합니다. 실리콘 가득 10cm 조직 배양 접시 50 %는 충분합니다. 실온에서 행크스 버퍼의 5 ML을 추가합니다.
원위부 대장 조직의 2 해부
- 이소 플루 란 흡입 자궁 전위에 의해 장소 밀폐 된 챔버에 마우스 및 마우스 안락사 후 복부와 흉부 (12)에 70 % 에탄올을 스프레이.
- 가위로 복부의 피부에 작은 절개를 한 후 절개가 복강을 노출 할 수 있습니다. 비슷한 절차는 여기에 12 설명 찾을 수 있습니다.
- 항문에서 대장을 잘라 대장이 될 때까지 장간막을 떨어져 애타게.
- 원위 결장을 절제항문에서 0 ~ 6cm 사이의 세그먼트. 여기서, 토굴 깊이 ~ 150 μm의 (도 1b 참조). 가위를 사용하여 길이 방향으로 결장을 열고 배설물 내용을 제거 컷.
- 점막면이 위를 향하도록 해부 접시에 조직을 핀입니다. 행크스 완충액 실리콘 접시 조직 절개하여 핀 늘려서 RT (도 1C)에서 10 분 동안 휴식을 보자. 이 조직에서 주름을 제거하고 근육 층 휴식 할 수 있습니다.
단면 용의 저온 3. 마운트 조직
- 조직의 원하는 섹션에서 면도날을 밀어 다음 행크스 버퍼를 붓는다. 샌드위치를 만들고, 상단에 다른 면도날을 추가합니다. 조직 세그먼트를 잘라 핀을 제거합니다. 드라이 아이스에 면도날 / 조직 샌드위치를 전송합니다. (5 ~ 10 분, 그림 1D) 조직이 동결하도록 허용합니다.
- 면도기 / 조직 샌드위치를 들고는 상단 (BL)에 손가락을 배치하여 약간 따뜻하게 할 수ADE (점막면이 위로. 이것은 기저 근육층 먼저 절단되도록 조직 배향.). 샌드위치 분리하여 조직 세그먼트의 가장자리 주위 잘랐다. 조직 세그먼트 약 0.5 센티미터 X 1cm를 잘라. 엣지 영역이 직렬 섹션 많은 조직층을 포함하는 원인 컬링하는 경향이있다. 이상 절단에서 절단보다 더 사용한다는 점에 유의주의의 측면에 잘못.
- 조직의 상단에있는 얼음이 녹기 시작 때까지 조직을 따뜻하게 할 수 있습니다. 이 시점에서 신속하고 신중하게 저온 유지 장치에 OCT의 블록으로 조직을 누릅니다.
- 샘플을 통해 손가락을 배치하여 블레이드를 분리합니다. 열 전달은 조직을 방해하지 않고 블레이드를 제거 할 수 있습니다.
- 코트 OCT를 가진 조직과는 5 분 동안 평형. 10 μm의 (그림 1E, F)에서 섹션을 잘라. 지하실이 볼 때까지 시각적으로 섹션을 검사합니다. 1.5 ml의 튜브 또는 슬라이드에 배치 섹션.
- 의 mRNA 또는 단백질, 장소 (T)의 분석을 위해5 토굴베이스, 과도 (5), 및 튜브 당 5 표면 섹션 튜브에 그 샘플. RNA 수집을위한 1 ml의에게 상업 분리 시약을 추가하고 실온에서 10 분 동안 품어. 제조업체의 지침에 따라 RNA 정화를 수행합니다. cDNA의 생성을 위해 전체 RNA의 5 ~ 10 μg의를 사용합니다.
- 단백질 정제의 경우, 차가운 RIPA 0.5 ml의 5 섹션 당 버퍼 (플러스 단백질 분해 효소 억제제)를 용해 추가합니다. 얼음에서 70 % 주기로 3 회 초음파 처리.
- SDS 페이지 로딩 버퍼 (램 믈리 버퍼)에 샘플을 추가하고 10 분 동안 100 ° C에서 품어. SDS 페이지 및 전송에 따라 샘플은 다음 2 시간 동안 5 % 우유 / PBS에 차단합니다. (500 1) 4 ℃에서 O / N KLF4 항체와 인큐베이션 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.
Representative Results
대장 조직 섹션은 조직 학적 평가와 H & E (13)를 염색 처리했다. 점막 전통적인 단면도는도 2a에서 볼 수있다. 기저 영역은 주로 원형 근층 구성 근층의 실외가 포함되어 있습니다. 루멘을 향해 진행되어, 근층 점막이 토굴 계 상피 세포에 인접 명백, 전이 세포는 조직의 중간에 있고, 마지막으로 표면 세포 집단은 장내 루멘에 직면한다. 여기에 설명 된 일련 절편 방법은 점막 근육 판 (도 2C)이어서 종 및 원형 근층 처음 (도 2B)에 발생되도록 배향을 유지한다. 화상의 상부 좌측 비 - 근육 간질 세포의 모양을 참고. 다운 스트림 분석 아래에 설명을 위해, 근육 부분은 삭제됩니다. 다음 섹션은 상피 세포 및 간질 조직을 포함 (고유 층), 토굴 기반 세포 (그림 2D)로 시작. 인해 치밀한 핵으로 어둡게 나타나는 지하실, 대부분의 중앙 루멘의 부재를 참고. 이 층은 증식 성 구획을 포함합니다. 전환 세포는 단단히 눈에 띄는 중앙 루멘 (그림 2E)과 땀샘을 포장 나타납니다. 마지막으로, 표면의 세포 집단은 얼굴 (그림 2 층) KO 볼 상피 단층 지역으로, 불규칙적 인 구조를 가지고있다.
(여기에서 (14)의 설명 참조) 전술 한 바와 같이 직렬 섹션은 또한 면역 표지 및 공 초점 현미경에 대해 처리 될 수있다.도 2G는 핵 (청색) 및 세포 - 세포 접합 단백질 Zonula 스테인드이어서 고정 및 100 % 메탄올 투과성이 고립 된 소낭을 보여 Occludens 1 (ZO-1, 녹색). 기존의 단면 방향에서, 지하실 및 표면 세포 (그림 2G를 동시에 볼 수 있습니다 (도 2G)의 중심에, 이행 세포 개체군의 직렬 단면 시료에서 볼 수있다. 향상된 ZO-1 얼룩 표면 세포 집단 (그림 2I 및 J)에서 볼 수있다.
몇몇 분화 인자 토굴 투면 축을 따라 시공간 방식으로 발현되는 것으로 알려져있다. 이것은 표면의 세포 집단이 풍부한 것으로 알려진 전사 인자 크 룹펠 같은 인자 4 (KLF4)를 포함한다. 전통적인 단면 처리 방법을 사용하여, KLF4 표면 세포 집단 (도 2K)를 대향 루멘의 핵에서 발견된다. 따라서 우리는 KLF4 mRNA를 주로 표면의 세포 집단으로 표현 될 것이라고 추측했다. 이를 테스트하려면, 직렬 섹션 수집 및 표면, 전이, 그리고 토굴베이스 샘플로 분류 하였다. Subsequently, RNA를 분리하고, RNeasy 열 및 DNase의 처리에 의해 추가로 정제하여, 표준 트리 졸 추출을 사용하여 수확했다. RNA를 샘플 당 총 RNA의 μg의 5 ~ 10 사이에 굴복 5 풀링 연속 섹션에서 수집되었다. 이 샘플은 다음과 KLF4 기준 유전자, TATA 박스 결합 단백질 1 (TBP-1) (도 2L) (14) 모두에 대해 반 정량적 실시간 PCR을 실시 하였다. 도 2L에 나타내는 바와 같이, TBP-1로 정규화 한 후, 세포 표면 토굴 세포에서 발현되는 8 배까지 KLF4 mRNA를 발현하는 것으로 확인되었다. 마찬가지로 KLF4 단백질 수준 토굴면 축을 따라 공간적 조절을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 4 ° C에서 20 분 동안 용해 완충액에서 상술하고 인큐베이션 시리얼 섹션 모았다. 이 샘플 당 단백질의 200-250 μg의 사이에 굴복. 샘플은 SDS-PAGE (도 2M) (15)에 의해 분석을 실시 하였다. 도 2M에 도시 된 바와 같이, 피 KLF4rotein 레벨은 극적 표면 세포 집단에서 더 높다. 상기 결과는 뮤린 결장 점막 표면과 토굴 상피 세포 대량 분리하는이 프로토콜의 능력을 입증한다.
그림 1 : (A) 도식 보여주는 쥐의 대장 점막 및 외부 근육 층. 우리의 방법은 시리얼 냉동 절편 (10 μm의 각)에 의해 분리 된 표면 셀과 토굴 기반 세포 인구를 수집하는 것을 목표로하고있다. 외부 근육 층은 삭제됩니다. (B) 크립트 높이가 콜론 (토굴베이스 및 표면 층 사이의 거리)의 길이를 따라 달라집니다. 데이터 포인트는 개별 토굴 측정 및 심볼 생물학적 복제를 나타내는 표시 (N = 4). (C) 결장 세그먼트 수집 타개 및 실리콘 해부 접시 상에 고정. SE (D) 조직항문에서 약 3cm가 면도날에 사이에 누를 드라이 아이스에 냉동되어 gment. (E) 조직은 사전 평탄화 OCT 블록에 장착된다. (F) 저온부 제거하고 시각적으로 검사한다.
그림 2. 대표 데이터 원형 근층 (cm)를 보여주는 단면도 헤 마톡 실린 - 에오신 염색 (A) 결장 조직 근층 점막 (mm), 토굴 계 세포 전이 세포 및 표면 세포. (B - C) 대장 근육 층. (D) 크립트 기반 세포. 중앙 루멘의 부재를 참고. (E) 과도 세포. (F) 표면 세포. 격리 된 대장 지하실의 (G) 면역 형광 염색법. ZO-1 (녹색) 및 핵 (청색)의 단면이 관찰된다. (안녕) ZO-1과 이행 및 표면 세포에서 핵 염색. (J) ZO-1 염색의 확대도. (K) KLF4 (녹색)는 표면의 세포 집단에 충실. (L) 세 구획 사이의 KLF4 mRNA 수준의 실시간 PCR 평가. (M)이 세포 집단에서 KLF4 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석.
Discussion
대장 상피 세포 증식 및 분화에 관여하는 분자 메커니즘이 제대로 이해된다. 이 대장 상피 지하실의 기지에서 줄기 세포 구획의 세포 신호 환경에 대한 우리의 이해의 간격을 포함한다. enterocyte 분화의 기초 처리에 대한 관심의 증가가있다. 예를 들어, 생체 내 분화의 이해 체외 차 장 시스템 (16)을 생산하기위한 연구에 대한 벤치 마크 필요 증가했다.
위의 절차를 추가 작업이 필요한 여러 단계가 포함되어 있습니다. 첫째, 냉동 조직 세그먼트 주위의 가장자리를 (3.2 절에서 논의 된 바와 같이)를 제거하는 해부 및 동결시 컬 조직의 가장자리로 필요합니다. 이 가장자리 결과를 이동하지 않으면 표면과 토굴 기본 세포의 혼합 인구입니다. 미리 냉장, 수평 10월 블록에 조직을 설치하는 것은 필수적이다. 티그 프로토콜은 각 풀 섹션 번호를 변경하여 원위 결장의 다른 영역에 적용 할 수있다. 도 1b에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 점막 토굴 길이는 150-300 μm의 사이에서 변화한다. 항문에서 4cm-6cm 사이의 영역을 공부할 때 따라서, 섹션의 수가 중요한 것은 30 15 증가한다,이 프로토콜은 근위 대장에 대한 제안되지 않는다 (7 CM-9cm)에 의한 주름에 ( 시리얼 절편에 의한 별도의 표면과 토굴 기반 세포를 할 수 없도록 루멘으로 확장 plicae obliquae).
직렬 단면 기법 토굴 계를 연구 및 인간 상피 세포 집단을 표면에 사용되어왔다. 그러나, 우리의 프로토콜에 의한 쥐의 조직의 작은 크기에 필요한 추가 단계를 추가합니다. 우리는 상기 프로토콜 유전자 취급 용이 마우스 시스템에 토굴 계 및 표면 상피 세포 집단의 조사를 허용 것이라고 제안한다. 실제로, 풀 섹션 yieLD 고품질 단백질 및 RNA 적합한 하류 분석. 미래의 응용 프로그램은 세포 신호 전달 경로 또는 크로 마틴 면역의 연구를 포함 할 수있다. 그러나, 전술 한 다른 방법의 여러 원한다면, 결과 섹션 상피와 점막 고유 간질 세포의 혼합물을 포함하고 있음을 주목해야한다. 결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 뮤린 대장 점막의 공간적으로 별개의 영역에서 분자 수준의 분석을위한 신속하고 높은 수율의 방법을 제공한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
| MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
| LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
| cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
| High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
| GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
| Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
| 27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
| TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Rneasy | Qiagen | 74104 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | |
| Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
| Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
| Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
| Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
| Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
| Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
| HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
| RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
| primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
| primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
| primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
| primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |
References
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