Introduction
結腸の上皮層は、常駐幹細胞は数日ごとに1組織の補充を有する高度に再生組織です。再生のこのプロセスは、増殖性の幹細胞区画の維持を必要とします。時間が経つにつれて、新たに生成娘細胞はその増殖能を失い、腸の管腔表面に向かって移動します。移行と一致し、前駆細胞は、成熟した障壁形成腸細胞や粘液産生杯細胞に分化します。この分化プログラムの障害は、炎症性腸疾患および大腸癌2,3に見られるような上皮バリアを妥協に寄与すると考えられています。
上記のプロセスの詳細な研究は、陰窩ベースと表面の細胞集団を単離するための方法論が必要になります。複数の方法は、独自の利点と欠点を有するそれぞれ、存在します。腸上皮細胞の単離のための現在の方法は、CHを含みます実験条件4,5に応じて全体の陰窩、上皮シート、または単一細胞の単離、その結果、薬剤および機械的解離をelating。これらは、高収量法である、まだ間シグナル伝達の変化は、ネイティブ環境6,7を表していない可能性がこれらの条件の下で報告されています。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、空間的に異なる材料の収集を可能にしますが、低分子降伏8,9を実現しています。ヒト結腸組織では、連続水平凍結切片法10を開発してきました。しかし、マウスの粘膜組織は、この技術の直接処分のために法外小さいです。ヒトでは、腸の陰窩の長さ（陰窩ベースと表面の細胞間の距離）結腸では、〜100〜1000μmの11との間で変化します。マウスでは、陰窩の長さは、50〜300ミクロン〜の間（ 図1Aを参照）です。マウス陰窩のサイズが小さいイゾラへの挑戦を提示します既存のプロトコルを使用して、これら2つの細胞集団の化。
現在、陰窩ベースの単離のための低コスト、高歩留まり方法を説明し、マウスの結腸組織における上皮細胞集団を表面。このようにして採取した組織は、その後、免疫蛍光染色、RT-PCR（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）、またはウェスタンブロッティングなどの標準的な下流のアプリケーションの数によって分析することができます。
Protocol
実験は、年齢の10と12週間の間に、C57BL / 6マウスを使用していました。動物を用いたすべての手順を見直し、エモリー大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、衛生基準の国立研究所に従って行ったしました。
1。実験のセットアップ
- クライオスタットの設定
- ミクロトームの刃とチャックを含む、-20℃にクライオスタットを平衡化（ブレード周り細心の注意を払って！）。
- 10月と空のcryomold（最適切断温度化合物）を記入し、-20℃（〜30分）に平衡化。金型から冷凍10月を外し、液体OCTでチャックに固定します。ミクロトーム腕でブロック/チャックを置き、10月は10分間に設定することができます。
- セクションごとに10μmのクライオスタットを設定し、それがフラットになるまで、10月ブロックを剃ります。数センチ離れブレードからミクロトーム腕をバックアップします。この時点で、EXPERの残りのブレードやチャックを調整していません形態。
- かみそりの刃を準備します。サンプルあたり2かみそりの刃を準備します。金属ファイルを使用して、ブレードの尖鋭端鈍いです。次に、鉗子でアルミフランジを削除します。
- ドライアイス上でパイレックス皿などの平らな面を事前に冷やし。
- 10-15解剖ピンと解剖皿を準備します。シリコンが充填された10cmの組織培養皿50％は十分です。 RTでハンクス緩衝液5mlを追加します。
遠位結腸組織の2解剖
- 密閉されたチャンバー内にマウスを置き、腹部と胸部12上に70％エタノールを噴霧し、その後、イソフルラン吸入と頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
- はさみで腹部の皮膚の小さな切開を行い、その後、腹腔を露出させるために切開を行います。同様の手順は、12ここで説明されています。
- 肛門縁で大腸を切り取り、コロンがフリーになるまで、腸間膜を離れていじめます。
- 遠位結腸を切除肛門から0と6センチメートル間のセグメント。ここでは、陰窩の深さは〜150μmである（ 図1B参照 ）です。縦方向にはさみを使用して、コロンを開き、糞便内容を削除カット。
- 粘膜表面を上に向けて解剖皿に組織をピン。ハンクス緩衝液中のシリコン皿上の組織使用して、解剖ピンを伸ばし、RT（ 図1C）で10分間休憩しましょう。これは、組織からひだを除去し、筋肉層がリラックスすることができます。
セクショニング用クライオスタット3.マウント組織
- 組織の目的のセクションの下にカミソリの刃をスライドさせ、その後、ハンクス緩衝液を捨てます。サンドイッチを作り、トップに別のカミソリの刃を追加します。組織セグメントを切断し、ピンを取り外します。ドライアイスにカミソリの刃/組織サンドイッチを転送します。 （5〜10分間、 図1D）組織が 凍結することができます。
- カミソリ/組織サンドイッチをピックアップし、それがトップBLに指を置くことで少し温めますADE（粘膜側を上に。基底筋層が最初に区分されるように、これは、組織を配向します。）。サンドイッチを分離し、組織セグメントのエッジの周りカット。組織セグメント約0.5センチ×1センチカット。エッジ領域は連続切片は、多くの組織層を含有させ、カールする傾向を有します。オーバーカットアンダーカットよりも良好であることに注意してくださいので、十分過ぎるくらいの注意が必要。
- 組織の上に氷が溶け始めるまで組織が加温することができます。この時点で、迅速かつ慎重にクライオスタット内のOCTブロックに組織を押してください。
- サンプルの上に指を置くことによって、ブレードを取り外します。熱伝達には、組織を破壊することなく、ブレードを削除することができます。
- コート10月で組織し、5分間平衡化。 10ミクロン（ 図1E、F）のセクションをカット。陰窩が見られるまで、視覚的にセクションを検査します。 1.5ミリリットルチューブ内またはスライド上のセクションを配置します。
- mRNAまたはタンパク質の分析のために、Tを配置5陰窩ベース、5移行、および管当たり5面部分とチューブで、彼のサンプル。 RNA回収のために1ミリリットルを商業分離試薬を追加し、室温で10分間インキュベートします。製造業者の説明書に従ってRNA精製を実行します。 cDNAの生成のための全RNAの5〜10μgのを使用してください。
- タンパク質精製のために、5つのセクションごとに寒RIPA溶解バッファー（プラスプロテアーゼ阻害剤）の0.5ミリリットルを追加します。氷上で、70％のサイクルで3回超音波処理。
- SDS PAGEローディング緩衝液（Laemmli緩衝液）に試料を添加し、10分間100℃でインキュベートします。 SDS-PAGEの転送の対象サンプルは、その後、2時間の5％ミルク/ PBSでブロックします。 （1：500）、4℃でO / N KLF4抗体とのインキュベーション、続いてウエスタンブロット分析を実行します。
Representative Results
結腸組織切片を組織学的評価およびH＆E染色のために処理した13。粘膜の伝統的な断面図を図2Aに見られます。基礎分野は、主に円形の筋層から成る外筋層が含まれています。内腔に向かって進むと、粘膜筋板は、陰窩 - ベースの上皮細胞に隣接して明らかである、移行細胞は、組織の真ん中にあり、最終的に、表面細胞集団は、腸管内腔に面し。ここで説明した連続切片法は粘膜筋板（ 図2C）、続いて縦方向および円形の筋層が最初に遭遇するような姿勢（ 図2B）を 、保持しています。画像の左上にある非筋間質細胞の出現に注意してください。以下に説明する下流の分析のため、筋切片は廃棄されます。以降のセクションでは、上皮細胞と間質組織（固有層を含んでいます）、陰窩ベース細胞（ 図2D）で始まります。による密に充填された核に暗く見える陰窩のほとんどにおいて中央管腔が存在しないことに注意してください。これらの層は、増殖コンパートメントが含まれています。移行細胞は顕著な中央ルーメン（ 図2E）と密に詰まった腺として表示されます。最後に、表面の細胞集団は、 顔 （ 図2F）JP見上皮単層の領域と、不規則な構造を有しています。
（ここでは14のように）上記のように連続切片はまた、免疫蛍光標識および共焦点顕微鏡法のために処理することができる。 図2Gは 、核（青）および細胞-細胞接合タンパク質閉鎖帯について染色し、続いて固定し、100％メタノールで透過処理し、単離された陰窩を示しOccludens 1（ZO-1、緑）。伝統的な切片の向きでは、cryptと表面の細胞を同時に表示することができます（ 図2G 図2G）の中央に、移行細胞集団の連続切片試料に見られます。拡張ZO-1染色は表面細胞集団（ 図2IおよびJ）に見られます。
いくつかの分化因子は、陰窩ツー面軸に沿って時空間的様式で発現されることが知られています。これは、表面の細胞集団が富化されることが知られている転写因子クルッペル様因子4（KLF4）を含みます。従来の切片法を用いて、KLF4、表面細胞集団（ 図2K）に対向管腔の核内に見出されます。そこで、KLF4 mRNAは主に表面細胞集団内で発現されるであろうと推測しました。これをテストするには、連続切片を採取し、表面、移行、および陰窩ベースサンプルに分類しました。 Subsequently、RNAは、RNeasyカラムとDNase処理により、さらに精製して、標準のTrizol抽出を用いて回収しました。 RNAは、サンプル当たりの総RNAの5-10μgの間に得られたプールされた5個の連続切片から回収しました。これらのサンプルは、その後、KLF4および参照遺伝子、TATAボックス結合タンパク質1（TBP-1）（ 図2L）14の両方に、半定量的リアルタイムPCRを行いました。 図2Lに示すように、TBP-1に正規化した後に、表面細胞は陰窩細胞中で発現される8回KLF4 mRNAにまで発現することが見出されました。同様に、KLF4タンパク質レベルは、陰窩面軸に沿って空間的調節を示すことが見出されました。上述した後、4℃で20分間、溶解緩衝液中でインキュベートしたように連続切片をプールしました。これは、サンプルあたりのタンパク質の200〜250μgの間に生じました。次に、試料をSDS-PAGE（ 図2M）15による分析を行いました。 図2Mに示すように、KLF4のProteinレベルは劇的に表面細胞集団において高いです。上記の知見は、マウス結腸粘膜から表面及び陰窩の上皮細胞を大量に単離するためのこのプロトコルの能力を実証します。
図1：マウス結腸粘膜および外部筋肉層を示す（A）の回路図。我々の方法は、シリアル凍結切片（10μmの各）により離散表面細胞および陰窩ベースの細胞集団を収集することを目的とします。外部筋肉層は破棄されます。 （B）墓所の高さは、コロン（陰窩ベースと表面層との間の距離）の長さに沿って変化します。データポイントは、個々の陰窩測定および記号は生物学的複製を示す指示（N = 4）。 （C）結腸セグメントは、収集二分、およびシリコン解剖皿に固定します。 SE（D）組織肛門からgment約3cmはカミソリの刃の間でプレスし、ドライアイスで凍結されています。 （E）組織は、その後、平坦化前のOCTブロックに取り付けられています。 （F）凍結切片を取り出し、目視で検査します。
図2：代表的なデータの円形筋（CM）を示す断面図でヘマトキシリン-エオシンで染色した（A）結腸組織、粘膜筋板（mm）で、陰窩-基本セル、移行細胞、および表面の細胞。 （B - C）結腸筋層。 （D）クリプト系細胞。中央管腔が存在しないことに注意してください。 （E）移行細胞。 （F）表面細胞。単離された結腸陰窩の（G）免疫蛍光染色。 ZO-1（緑）および核（青）は、断面で観察されます。 （HI）ZO-1と移行し、表面の細胞で核染色。 （J）ZO-1染色の拡大図。 （K）、KLF4（緑）は、表面の細胞集団において濃縮されます。 （L）3つの区画の間にKLF4 mRNAレベルのリアルタイムPCR評価。 （M）は、これらの細胞集団におけるKLF4タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。
Discussion
結腸上皮細胞の増殖および分化に関与する分子メカニズムはほとんどわかっていません。これは、結腸上皮陰窩の基部に幹細胞区画の細胞シグナル環境の理解のギャップを含んでいます。腸細胞の分化の根底にあるプロセスが注目もあります。例えば、in vivoでの分化の理解がin vitroでの主な腸システム16を製造することを目的とした研究のためのベンチマークとして必要とされる増加しました。
上記の手順は、特別な注意を必要とするいくつかのステップが含まれています。まず、（セクション3.2で説明したように）凍結組織セグメントの周りのエッジを削除は解剖や凍結時のカール組織端として必要とされます。これらのエッジ結果を移動しないと、表面及び陰窩ベース細胞の混合集団です。予め冷却し、水平に10月ブロックの組織をマウントすることも不可欠です。 Tそのプロトコルは、各プール内のセクションの数を変更することによって遠位結腸の他の領域に適用することができます。 図1Bに示すように、例えば、粘膜陰窩の長さは150〜ミクロンの間で変化します。肛門4からCM-6センチメートルとの間の領域を研究する際に、セクションの数が重要な30に15から増加する必要があるため、このプロトコルは、（原因折り目に近接結腸（7センチメートル-9 cm）のために提案されていません襞obliquae）それは不可能連続切片によって表面及び陰窩ベース細胞を分離することルーメン内に延びています。
連続切片技術は陰窩ベースを研究し、ヒトにおける上皮細胞集団を表面に使用されてきました。しかし、我々のプロトコルが原因で、マウス組織のサイズが小さいために必要な追加のステップを追加します。我々は、上記のプロトコルは、遺伝的に扱いやすいマウスシステムにおける陰窩塩基および表面上皮細胞集団の調査を可能にすることを提案します。確かに、プールされたセクションでは、yieLD、高品質のタンパク質やRNAの適当な下流分析。将来のアプリケーションは、細胞シグナル伝達経路の研究やクロマチン免疫沈降を含むことができます。しかし、前述の代替の方法のいくつかのように、得られた切片は、上皮および間質固有層細胞の混合物を含むことに留意すべきです。結論として、ここで説明するプロトコルは、マウス結腸粘膜の空間的に異なる領域での分子プロセスの分析のための迅速で、高収率の方法を提供します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
| MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
| LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
| cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
| High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
| GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
| Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
| 27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
| TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Rneasy | Qiagen | 74104 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | |
| Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
| Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
| Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
| Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
| Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
| Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
| HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
| RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
| primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
| primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
| primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
| primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F.
- Humphries, A., Wright, N. A. Colonic crypt organization and tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).
- Weber, C. R., Turner, J. R. Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall. Gut. 56, 6-8 (2007).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Rand, M. D., et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors. Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).
- Lechner, S., et al. Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia. Gut. 52, 1148-1153 (2003).
- Reizel, Y., et al. Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction. PLoS Genet. 7, e1002192 (2011).
- Kosinski, C., et al. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).
- Tamura, S., et al. Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm. J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine. Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040 (2012).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
- Neumann, P. A., et al. Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon. Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).
- Capaldo, C. T., et al. Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins. Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).
- Wells, J. M., Spence, J. R. How to make an intestine. Development. 141, 752-760 (2014).
