Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
결장 상피 라이닝 상주 줄기 세포가 수일마다 한 조직 보급과 고도로 재생 조직이다. 이러한 재생 처리는 증식 성 줄기 세포 구획의 유지 보수를 필요로한다. 시간이 지남에 따라 새로 생성 된 딸 세포는 증식 잠재력을 잃고 장의 내강면을 향해 이동한다. 마이그레이션과 일치는 전구 세포는 성숙한 배리어 형성 장 세포 또는 점액 생산 배 세포로 분화. 이 분화 프로그램의 실패는 염증성 장 질환 및 결장암 2,3-에서 관찰 된 바와 같이 상피 장벽을 저하에 기여하는 것으로 생각된다.
위의 과정의 자세한 연구는 토굴베이스 및 표면 세포 인구를 분리하는 방법이 필요합니다. 여러 방법이 고유 한 장점과 단점이 각각 존재한다. 장 상피 세포의 분리를위한 현재의 방법은 채널을 포함실험 조건에 의존하는 전체 4,5- 지하실, 상피 시트, 또는 단일 세포의 분리 결과 elating 에이전트 및 기계적 해리. 이러한 높은 수율의 방법이 있습니다, 아직 세포 간 신호의 변화는 네이티브 환경 6,7를 대표하지 않을 수 있습니다 이러한 조건에서보고되었다. 레이저 캡처 미세 절제는 공간 별개의 자료의 수집을 허용하지만, 저 분자량 수익률 8,9을 달성한다. 인간 결장 조직, 일련의 수평 저온 절편 방법 10이 개발되었다. 그러나 쥐의 점막 조직이 기술의 직접 처분에 대한 엄청나게 작다. 사람에서 대장 (지하실베이스 및 표면 세포 사이의 먼) 장 토굴 길이는 μm의 100-1,000 ~ 11 사이의 다릅니다. 마우스에서, 지하실 길이는 μm의 50-300 ~ 사이 (그림 1A 참조)이다. 쥐 지하실의 작은 크기는 솔라에 도전을 선물한다기존의 프로토콜을 사용하여 두 세포 집단의 기.
우리는 이제 저렴한 비용으로, 토굴베이스의 분리를위한 높은 수율 방법을 설명하고 쥐의 대장 조직에서 상피 세포 인구 표면. 이러한 방식으로 수확 된 조직을 면역 염색 한 다음, RT-PCR (실시간 중합 효소 연쇄 반응) 또는 웨스턴 블 롯팅을 포함하여 표준 하류 애플리케이션들에 의해 분석 될 수있다.
대장 상피 세포 증식 및 분화에 관여하는 분자 메커니즘이 제대로 이해된다. 이 대장 상피 지하실의 기지에서 줄기 세포 구획의 세포 신호 환경에 대한 우리의 이해의 간격을 포함한다. enterocyte 분화의 기초 처리에 대한 관심의 증가가있다. 예를 들어, 생체 내 분화의 이해 체외 차 장 시스템 (16)을 생산하기위한 연구에 대한 벤치 마크 필요 증가했다.
위의 절차를 추가 작업이 필요한 여러 단계가 포함되어 있습니다. 첫째, 냉동 조직 세그먼트 주위의 가장자리를 (3.2 절에서 논의 된 바와 같이)를 제거하는 해부 및 동결시 컬 조직의 가장자리로 필요합니다. 이 가장자리 결과를 이동하지 않으면 표면과 토굴 기본 세포의 혼합 인구입니다. 미리 냉장, 수평 10월 블록에 조직을 설치하는 것은 필수적이다. 티그 프로토콜은 각 풀 섹션 번호를 변경하여 원위 결장의 다른 영역에 적용 할 수있다. 도 1b에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 점막 토굴 길이는 150-300 μm의 사이에서 변화한다. 항문에서 4cm-6cm 사이의 영역을 공부할 때 따라서, 섹션의 수가 중요한 것은 30 15 증가한다,이 프로토콜은 근위 대장에 대한 제안되지 않는다 (7 CM-9cm)에 의한 주름에 ( 시리얼 절편에 의한 별도의 표면과 토굴 기반 세포를 할 수 없도록 루멘으로 확장 plicae obliquae).
직렬 단면 기법 토굴 계를 연구 및 인간 상피 세포 집단을 표면에 사용되어왔다. 그러나, 우리의 프로토콜에 의한 쥐의 조직의 작은 크기에 필요한 추가 단계를 추가합니다. 우리는 상기 프로토콜 유전자 취급 용이 마우스 시스템에 토굴 계 및 표면 상피 세포 집단의 조사를 허용 것이라고 제안한다. 실제로, 풀 섹션 yieLD 고품질 단백질 및 RNA 적합한 하류 분석. 미래의 응용 프로그램은 세포 신호 전달 경로 또는 크로 마틴 면역의 연구를 포함 할 수있다. 그러나, 전술 한 다른 방법의 여러 원한다면, 결과 섹션 상피와 점막 고유 간질 세포의 혼합물을 포함하고 있음을 주목해야한다. 결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 뮤린 대장 점막의 공간적으로 별개의 영역에서 분자 수준의 분석을위한 신속하고 높은 수율의 방법을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |