Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
Colon epitelforingen er en meget regenerativ væv, med bopæl stamceller genopfyldning vævet hver par dage 1. Denne proces med regenerering kræver opretholdelse af en proliferativ knoglemarven. Over tid, de nyligt fremstillede datterceller mister deres proliferative potentiale og migrere mod den luminale overflade af tarmen. Sammenfaldende med migration, progenitor celler differentierer til modne barriere-dannende enterocyterne eller mukøse producerende slimceller. Svigt af denne differentiering program menes at bidrage til kompromitteret epitelbarriere såsom observeres ved inflammatorisk tarmsygdom og tyktarmskræft 2,3.
Detaljeret undersøgelse af de ovennævnte processer vil kræve metoder til isolering af krypt-base og overfladen cellepopulationer. Der findes flere metoder, hver med unikke fordele og ulemper. Nuværende fremgangsmåder til isolering af intestinale epitelceller omfatter lmelating agenter og mekanisk dissociation, hvilket resulterer i isoleringen af hele krypter, epitelbaner eller enkelte celler, afhængig af forsøgsbetingelser 4,5. Disse er højt udbytte metoder, men er blevet rapporteret ændringer i intercellulære signalering under disse betingelser, som ikke repræsenterer oprindelige miljø 6,7. Laser capture mikrodissektion muliggør indsamling af rumlige særskilt materiale, men opnår lav molekylær udbytte 8,9. I humant colonvæv, er blevet udviklet serielle horisontale cryosectioning metoder 10. Imidlertid murine mucosale væv er uoverkommeligt små til direkte bevilling af denne teknik. Hos mennesker, intestinal crypt længder (den fjernt mellem krypten-base og overflade celler) i tyktarmen varierer mellem ~ 100-1.000 um 11. Hos mus, crypt længder er mellem ~ 50-300 um (se Figur 1A). Den lille størrelse af murine krypter udgør en udfordring for isolaaf disse to cellepopulationer ved anvendelse af eksisterende protokoller.
Vi beskriver nu en lav pris, højt udbytte fremgangsmåde til isolering af krypten-base og overflade epithelial cellepopulation i murine colonvæv. Væv høstet på denne måde kan derefter analyseres ved en række standard efterfølgende anvendelser, herunder immunfluorescensfarvning, RT-PCR (Real Time-polymerasekædereaktion) eller Western blotting.
De molekylære mekanismer involveret i colon epitelcelleproliferation og differentiering er dårligt forstået. Dette omfatter huller i vores forståelse af den cellulære signalering miljø stamceller rum ved bunden af tyktarmen epitel krypter. Der er også en stigende interesse for de processer, der ligger til grund enterocytterne differentiering. For eksempel øget forståelse af in vivo-differentiering er nødvendig som benchmark for undersøgelser med henblik på at producere in vitro primære tarm systemer 16.
Den ovennævnte fremgangsmåde indeholder flere trin, der kræver ekstra opmærksomhed. For det første at fjerne kanter omkring det frosne væv segment (som omtalt i afsnit 3.2) er påkrævet, da væv kanter krøller under dissektion og frysning. Manglende flytte disse kanter resultater er en blandet population af overflade- og krypt base-celler. Montering af væv på en pre-kølet, nivelleret oktober blok er også vigtigt. Thans protokol kan tilpasses til andre områder af den distale colon ved at ændre antallet af sektioner i hver pulje. For eksempel som vist i figur 1B, mukosal krypt længde varierer mellem 150-300 um. Derfor, når man studerer området mellem 4 cm-6 cm fra anus, antallet af sektioner skal øges fra 15 til 30. Vigtigt er denne protokol ikke foreslået til den proximale colon (7 cm-9 cm) på grund af folderne ( plicae obliquae), der strækker sig ind i hulrummet, hvilket gør det umuligt at adskille overflade- og krypt-base-celler ved seriel sektionering.
Serielle sektionsopdelingen teknikker er blevet anvendt til at undersøge crypt-base og overflade epiteliale cellepopulationer i mennesker. Men vores protokol tilføjer yderligere trin, der kræves på grund af den lille størrelse af murine væv. Vi foreslår, at ovennævnte protokol vil give mulighed for undersøgelse af krypten-base og overflade epitelcelle befolkning genetisk medgørlige mus-systemer. Faktisk puljede sektioner Yield protein af høj kvalitet og RNA egnet nedstrøms analyse. Fremtidige applikationer kunne omfatte studiet af cellens signalveje eller kromatin immunofældning. Imidlertid bør det bemærkes, at, ligesom flere af de alternative metoder beskrevet ovenfor, de resulterende afsnit indeholder en blanding af epitel- og interstitielle lamina propria-celler. Det konkluderes, at protokollen beskrevet her tilvejebringer en hurtig, højt udbytte metode til analyse af molekylære processer i rumligt adskilte regioner af det murine colon mucosa.
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |