Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
结肠上皮衬里是一种高度再生的组织,与驻地干细胞补充组织每隔几天1。再生的这个过程需要增殖干细胞区室的维护。随着时间的推移,新产生的子细胞失去增殖潜能和迁移朝小肠的腔表面。暗合了迁移,祖细胞分化为成熟的阻隔形成肠或粘膜产生杯状细胞。这种分化方案的失败被认为有助于受损上皮屏障诸如炎症性肠病和结肠癌2,3是观察。
上述过程的详细研究,需要方法用于分离的隐窝基和表面的细胞群。多种方法都存在,各有独特的优点和缺点。目前的方法为肠上皮细胞的分离包括沟道elating剂和机械解离,导致整个隐窝,上皮片,或单细胞的,依赖于实验条件4,5的分离。这些都是高产的方法,但在变化间信号已经在这些条件,可能无法代表本土环境下6,7报道。激光捕获显微切割允许空间不同材料的集合,但实现了低分子量收率8,9。在人结肠组织,序列水平cryosectioning方法已经发展10。然而,小鼠的粘膜组织有小望而却步这种技术的直接拨款。在人类中,肠隐窝长度在结肠(隐窝基和表面细胞之间的遥远)之间变化100-1,000〜11微米。在小鼠中,隐窝长度之间〜50-300微米( 见图1A)。鼠隐窝的小尺寸提出了挑战伊索拉化利用现有的协议这两种细胞群。
现在我们描述一种低成本,高产量的方法的隐窝基底的分离和在小鼠结肠组织表面的上皮细胞群。组织收获以这种方式然后可通过许多标准的下游应用,包括免疫荧光染色,RT-PCR(实时聚合酶链式反应)或蛋白质印迹进行分析。
涉及在结肠上皮细胞增殖和分化的分子机制知之甚少。这包括在我们的干细胞区室中在结肠上皮隐窝的底部的细胞信号环境的了解差距。也有在背后肠分化过程的兴趣日益增加。例如, 增加体内分化的认识,需要为基准,进行研究,以在体外生产初级肠道系统16。
上述过程包含了需要特别注意几个步骤。首先,去除冷冻组织段周围的边缘(如3.2节中讨论)是必需的组织边缘解剖和冷冻过程中卷曲。未按动这些边缘的结果是表面和隐窝基底细胞的混合群。安装预冷,分级华侨城块的组织也是必不可少的。 Ť他的协议可以通过改变在每个池的部分的数量适应于远端结肠的其他区域。例如, 如图1B所示 ,150-300微米之间的粘膜隐窝长度变化。因此,从肛门学习4厘米-6厘米之间的区域时,这些区段的数目应从15增加到30。重要的是,该协议不建议用于近端结肠(7厘米9cm)中,由于褶皱(皱襞obliquae),其延伸进入所述内腔因此当单独表面和隐窝基底细胞通过连续切片是不可能的。
连续切片技术已被用于研究隐窝基和在人体内的表面上皮细胞群。然而,我们的协议增加了需要由于鼠组织的小尺寸的附加步骤。我们建议,上述协议将允许隐窝基和表面的上皮细胞群体在遗传听话鼠标系统的调查。事实上,汇集部分一愕LD优质蛋白质和RNA适合下游分析。未来的应用可能包括细胞信号传导途径或染色质免疫沉淀的研究。但是,应该指出的是,像几个上述的替代方法中,将所得切片包含上皮细胞和间质固有层细胞的混合物。总之,这里描述的方案提供了一种快速,高产率方法对分子过程的在小鼠结肠黏膜的空间上不同的区域进行分析。
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |