Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
L'épithélium colique est un tissu très régénérative, avec des cellules souches résidentes reconstitution du tissu tous les quelques jours 1. Ce processus de régénération nécessite le maintien d'un compartiment de cellules souches proliférative. Avec le temps, les cellules filles nouvellement produits perdent leur potentiel de prolifération et de la migration vers la surface luminale de l'intestin. Coïncidant avec la migration, les cellules progénitrices se différencient en entérocytes de barrière formant matures ou cellules muqueuses caliciformes productrices. Le défaut de ce programme de différenciation est considérée comme compromise contribuer à barrière epitheliale comme cela est observé dans la maladie inflammatoire de l'intestin et du côlon 2,3.
Une étude détaillée des processus ci-dessus, il faudra des méthodes pour isoler les populations crypte-base et cellulaires de surface. Plusieurs méthodes existent, chacune avec des avantages uniques et des inconvénients. Les méthodes actuelles pour l'isolement de cellules épithéliales intestinales comprennent chagents exaltants et dissociation mécanique, ce qui entraîne l'isolement des cryptes entiers, des feuilles epitheliales ou des cellules individuelles en fonction des conditions expérimentales 4,5. Ce sont des méthodes à haut rendement, mais les changements dans la signalisation intracellulaire ont été rapportés dans ces conditions, qui peuvent ne pas représenter l'environnement natif 6,7. microdissection laser permet la collecte de matériau distinct spatiale, mais réalise moléculaire faible rendement 8,9. Dans les tissus du côlon humain, les méthodes de cryosectioning horizontaux de série ont été mis au point 10. Cependant, tissus murins muqueuses sont prohibitifs petit pour l'appropriation directe de cette technique. Chez les humains, les longueurs de la crypte intestinale (la distance entre la crypte-base et cellules de surface) dans le côlon varient entre ~ 100-1000 um 11. Chez les souris, les longueurs sont comprises entre crypte ~ 50 à 300 pm (voir la figure 1A). La petite taille des cryptes murins représente un défi pour l'isolation de ces deux populations de cellules en utilisant des protocoles existants.
Nous décrivons maintenant un faible coût, la méthode à haut rendement pour l'isolement de crypte-base et la surface population de cellules épithéliales dans les tissus du côlon murin. Tissus récoltés de cette manière peut ensuite être analysé par un certain nombre d'applications en aval, y compris les types immunofluorescence, une RT-PCR en temps réel (-Polymerase Chain Reaction) ou transfert de Western.
Les mécanismes moléculaires impliqués dans le côlon prolifération des cellules épithéliales et la différenciation sont mal comprises. Cela comprend lacunes dans notre compréhension de l'environnement de la signalisation cellulaire du compartiment des cellules souches à la base des cryptes épithéliales du côlon. Il ya également un intérêt croissant dans les processus qui sous-tendent la différenciation des entérocytes. Par exemple, une meilleure compréhension de la différenciation in vivo est requise comme une référence pour les études visant à produire in vitro des systèmes intestinaux primaires 16.
La procédure ci-dessus contient plusieurs mesures qui nécessitent une attention particulière. Tout d'abord, enlever les bords autour du segment de tissu congelé (tel que discuté à la section 3.2) est nécessaire que les bords de tissus papillotes pendant la dissection et la congélation. Si vous ne déplacez ces arêtes résultats est une population mixte de cellules de surface et de base crypte. Montage du tissu sur un pré-réfrigérés, EAO bloc nivelé est également essentiel. Tson protocole peut être adapté à d'autres régions du côlon distal en modifiant le nombre de sections dans chaque pool. Par exemple, comme représenté sur la figure 1B, la longueur de la muqueuse crypte varie entre 150 à 300 um. Par conséquent, lorsque l'on étudie la zone comprise entre 4 cm-6 cm de l'anus, le nombre de sections doit être augmentée de 15 à 30. Il est important, ce protocole est pas suggéré pour le côlon proximal (7 cm 9 cm) en raison des plis ( plicae obliquae) qui étendent dans la lumière qui rend impossible de surface et de la crypte à base de cellules séparées par sectionnement série.
Techniques de coupes sériées ont été utilisés pour étudier la crypte-base et la surface populations de cellules épithéliales chez l'homme. Cependant, notre protocole ajoute des étapes supplémentaires qui sont nécessaires en raison de la petite taille du tissu murin. Nous proposons que le protocole ci-dessus permettra de l'enquête de base et crypte-population de cellules épithéliales de surface dans les systèmes de souris génétiquement traitables. En effet, les sections regroupées Yield protéines de haute qualité et d'analyse en aval appropriée de l'ARN. Les applications futures pourraient inclure l'étude des voies de signalisation cellulaire ou immunoprécipitation de la chromatine. Toutefois, il convient de noter que, comme plusieurs des méthodes décrites ci-dessus, les sections résultantes contiennent un mélange de cellules épithéliales lamina propria et interstitielles. En conclusion, le protocole décrit ici fournit un procédé de production rapide, haut pour l'analyse de processus moléculaires dans des régions spatialement distinctes de la muqueuse du côlon murin.
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |