Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.
The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.
Den kolon epitelbeklädnaden är en mycket regenerativ vävnad, med inhemska stamceller påfyllning vävnaden med några dagars mellanrum 1. Denna process av förnyelse kräver upprätthållandet av en proliferativ stamcellsmaterialet. Med tiden de nyproducerade dotterceller förlorar sin proliferativ potential och migrera mot den luminala ytan i tarmen. I samband med migration, progenitorceller differentierar till mogna barriärbildande enterocyter eller slem producerande bägarceller. Fel på denna differentiering programmet är tänkt att bidra till att äventyras epitelbarriär såsom observeras vid inflammatorisk tarmsjukdom och tjocktarmscancer 2,3.
Detaljerad studie av ovanstående processer kommer att kräva metoder för att isolera crypt-bas och ytan cellpopulationer. Flera metoder finns, var och en med unika fördelar och nackdelar. Nuvarande metoder för isolering av intestinala epiteliala celler innefattar lmelating medel och mekanisk disassociation, vilket resulterar i isolering av hela kryptor, epiteliala ark eller enstaka celler, beroende på experimentella betingelser 4,5. Dessa är höga metoder avkastning, men förändringar i inter signalering har rapporterats under dessa betingelser som inte kan representera den ursprungliga miljö 6,7. Laser fånga microdissection möjliggör insamling av rumsliga distinkta material, men ger låg molekyl utbyte 8,9. I human kolonvävnad, har serie horisontella cryosectioning metoder utvecklats 10. Emellertid murina slemhinnevävnader är oöverkomligt små för direkt anslag på denna teknik. Hos människor, tarm crypt längder (den avlägsna mellan kryptan-bas och hudceller) i tjocktarmen varierar mellan ~ 100-1000 pm 11. Hos möss, krypta längder mellan ~ 50-300 m (se figur 1A). Den lilla storleken av murina kryptor utgör en utmaning för isolation av dessa två cellpopulationer med hjälp av befintliga protokoll.
Vi beskriver nu en låg kostnad, hög avkastning metod för isolering av kryptan-bas och yta epitelceller befolkning i murin kolonvävnad. Tissue skördats på detta sätt kan sedan analyseras av ett antal applikationer standard nedströms, inklusive immunofluorescensfärgning, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) eller western blotting.
De molekylära mekanismer som är involverade i kolon epitelial cellproliferation och differentiering är dåligt kända. Detta inkluderar brister i vår förståelse av cellulära signalerings miljö stamcells på basen av kolon epitelceller kryptor. Det finns också ett ökat intresse för de processer som ligger bakom enterocyten differentiering. Till exempel, ökad förståelse för in vivo differentiering krävs som ett riktmärke för studier som syftar till att producera in vitro primära tarmsystem 16.
Ovanstående procedur innehåller flera steg som kräver extra uppmärksamhet. För det första, att ta bort kanterna runt frusna vävnadssegment (vilket diskuteras i avsnitt 3.2) krävs som vävnadskanterna curl under dissekering och frysning. Underlåtenhet att flytta dessa kanter resultat är en blandad population av yt- och krypta basceller. Montering av vävnad på en pre-kyld, planat oktober blocket är också viktigt. Thans protokoll kan anpassas till andra områden i den distala kolon genom att ändra antalet sektioner i varje pool. Till exempel, som visas i figur 1B, varierar mucosal crypt längd mellan 150-300 nm. Därför, när man studerar området mellan 4 cm 6 cm från anus, bör ökas antalet sektioner från 15 till 30. Det är viktigt att detta protokoll inte föreslagits för proximala kolon (7 cm 9 cm) på grund av veck ( plicae obliquae) som sträcker sig in i lumen gör det omöjligt att separata yt- och krypta-basceller från seriesnittning.
Seriella sektione tekniker har använts för att studera crypt-bas och ytan epiteliala cellpopulationer hos människor. Men våra protokoll lägger till ytterligare åtgärder som krävs på grund av den begränsade storleken på murin vävnad. Vi föreslår att ovanstående protokoll gör det möjligt för utredning av kryptan-bas och ytan epitelceller befolkningen i genetiskt överskådliga mussystem. I själva verket, poolade sektioner Yield högkvalitativt protein och RNA lämplig nedströms analys. Framtida tillämpningar kan omfatta studier av cellsignaleringsvägar eller kromatin immunoprecipitation. Emellertid bör det noteras att, liksom flera av de alternativa metoder som beskrivits ovan, de resulterande sektionerna innehåller en blandning av epitel- och interstitiella lamina propria-celler. Sammanfattningsvis, det protokoll som beskrivs här ger en snabb, hög metod utbyte för analys av molekylära processer i rums distinkta regioner av mus kolonslemhinnan.
The authors have nothing to disclose.
Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn’s and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.
Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
Materials | |||
OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
Rneasy | Qiagen | 74104 | |
DNAse | Qiagen | 79254 | |
Reagents | |||
Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
PCR Primers | |||
primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |