Abstract
חיידקי גרם שלילי רבים, כולל spp Yersinia פתוגניים. להעסיק סוג שלישי מערכות הפרשה לtranslocate חלבוני מפעיל לתאי יעד האיקריוטים. בתוך התא המארח חלבוני מפעיל לתפעל פונקציות סלולריות לטובת החיידקים. כדי להבין את השליטה של הפרשת III הסוג במהלך אינטראקציה תא מארח, רגישה ומבחנים מדויקים יותר למדידת טרנסלוקציה נדרשים. אנחנו כאן לתאר את היישום של assay המבוסס על השילוב של שבר חלבון מפעיל Yersinia enterocolitica (חלבון החיצוני Yersinia; YopE). עם TEM-1 בטא לקטמאז לניתוח כמותי של טרנסלוקציה assay מסתמך על מחשוף של תא permeant סריג צבע (CCF4 / AM) על ידי היתוך בטא לקטמאז translocated. לאחר המחשוף של ליבת צפלוספורין של CCF4 ידי בטא לקטמאז, סריג מcoumarin להעמסה מופרת והעירור של מחצית coumarin מוביל לפליטת הקרינה כחולה.יישומים שונים של שיטה זו תוארו בספרות הדגשה צדדיות שלה. השיטה מאפשרת ניתוח של טרנסלוקציה במבחנה וגם בin vivo, למשל, במודל של עכברים. זיהוי של אותות הקרינה יכול להתבצע באמצעות קוראי צלחת, ניתוח FACS או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהתקנה המתוארת כאן, בטרנסלוקציה מבחנה של שילובי מפעיל לתאי הלה על ידי מוטציות Yersinia שונות מנוטר על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר. הקלטת המרה תאית של כתב סריג על ידי היתוך מפעיל בטא לקטמאז בזמן אמת מספקת תוצאות כמותיות חזקות. אנחנו כאן להראות נתונים למופת, מדגימים טרנסלוקציה המוגברת על ידי י ' המוטציה enterocolitica YopE בהשוואה לזן מהסוג בר.
Introduction
III מערכות הפרשת סוג מכונות חלבון-יצוא מיוחד מנוצל על ידי genera של חיידקי גרם שלילי לספק ישירות חלבוני מפעיל מקודדים bacterially לתאי יעד האיקריוטים שונה. בעוד מכונות ההפרשה עצמו שמור ביותר, סטים מיוחדים של חלבוני מפעיל התפתחו בין מיני חיידקים השונים כדי לתפעל מסלולי איתות תאיים ולהקל אסטרטגיות אלימות חיידקים ספציפיות 1. במקרה של Yersinia, עד שבעה חלבוני מפעיל, (חלבונים חיצוניים Yersinia) Yops שנקרא, הם translocated במגע תא מארח ולפעול יחד כדי לחתור תחת תגובות תא חיסון כגון ייצור phagocytosis וציטוקינים, כלומר, כדי לאפשר הישרדות תאית של החיידקים 2-4. התהליך של טרנסלוקציה נשלט בחוזקה בשלבים שונים 5. הוא קבע כי הפעלה ראשונית של T3SS מופעלת על ידי המגע שלה ליעד לספירהLL 6. עם זאת, המנגנון המדויק של חניכה זו הוא עדיין לא הובהר. בYersinia רמה שנייה של מה שנקרא כוונון עדין של טרנסלוקציה מושגת על ידי למעלה או פעילות של חלבוני Rho GTP מחייב Rac1 הסלולריים או RhoA ויסות כלפי מטה. הפעלה של Rac1 למשל על ידי גורם necrotizing invasin או ציטוטוקסיות Y (CNF-Y) מובילה לטרנסלוקציה עלתה 7-9, ואילו הפער (GTPase הפעלת חלבון) פונקציה של YopE translocated מסדירה את הפעילות-Rac1 ובהתאם יורד טרנסלוקציה ידי סוג משוב שלילי של מנגנון 10,11.
שיטות תקפות ומדויקות הן התנאי ההכרחי כדי לחקור כיצד טרנסלוקציה מוסדרת במהלך האינטראקציה תא המארח Yersinia. מערכות רבות ושונות המשמשות למטרה זו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות מסוימים. גישות יש להסתמך על תמוגה של תאים נגועים אך לא חיידקים על ידי חומרי ניקוי שונים ואחריו ניתוח כתם מערבי. החסרון משותף דואר של שיטות אלה הוא שתמוגה חיידקי קטין אך בלתי נמנעת שעלולה מזהמת את lysate התא עם הקשורים חיידקי חלבוני מפעיל. עם זאת, טיפול בתאים עם K proteinase להשפיל חלבוני מפעיל תאיים והשימוש הבא של digitonin לתמוגה סלקטיבית של התאים האיקריוטים הוצעו כדי למזער בעיה זו 12. חשוב לציין, מבחני אלה תלויים באופן מכריע על נוגדנים נגד מפעיל באיכות גבוהה, שהם בעיקר לא זמינים באופן מסחרי. ניסיונות להשתמש שילובי translational של חלבוני מפעיל וחלבוני ניאון כמו GFP לעקוב אחר טרנסלוקציה לא היו מוצלחים ככל הנראה בשל המבנה הכדורי שיישונים של חלבוני הניאון וחוסר היכולת של מנגנון ההפרשה להתפתח לפני ההפרשה 13. עם זאת תחום, כמה תגי כתב שונים כמו cya (cyclase adenylate calmodulin תלוי) של רעלן שעלת Bordetella cyclolysin 14 או פלאשתג שימש בהצלחה לניתוח טרנסלוקציה. בassay לשעבר הפעילות האנזימטית של cya משמשת כדי להגביר את האות של חלבון ההיתוך תאיים, ואילו תג פלאש, תג מוטיב tetracysteine קצר מאוד (4Cys), מאפשר לתיוג עם פלאש הצבע biarsenical מבלי להפריע לתהליך של הפרשה 15.
הגישה מיושמת כאן דווחה לראשונה על ידי שרפנטייה et al., והוא מבוסס על ההמרה תאית של CCF4 צבע תהודת העברת אנרגיית פורסטר (סריג) על ידי שילובי translocated מפעיל TEM-1 בטא לקטמאז 16 (איור 1 א). CCF4 / AM הוא תרכובת תא-permeant בי נגזר coumarin (תורם) ומחצית העמסה (acceptor) צמודות על ידי ליבת צפלוספורין. עם הכניסה פסיבית לתוך התא אוקריוטים, לא פלורסנט אסטרי מתחם CCF4 / AM מעובד על ידי esterases הסלולרי לCCF4 הטעון וניאון ולכודים ובכךבתוך התא. עירור של מחצית coumarin ב 405 ננומטר תוצאות בסריג למחצית והעמסת, אשר פולטת אותות הקרינה ירוקים ב530 ננומטר. לאחר המחשוף של ליבת צפלוספורין ידי סריג בטא לקטמאז מופר ועירור של מחצית coumarin מוביל לפליטת הקרינה הכחולה at460 ננומטר. יישומים שונים של שיטה זו תוארו בספרות הדגשה צדדיות שלה. השיטה מאפשרת ניתוח של טרנסלוקציה במבחנה וגם בin vivo, למשל, את הטכניקה הייתה בשימוש במודל זיהום עכבר כדי לזהות את אוכלוסיות יקוציט ממוקדות עבור טרנסלוקציה in vivo 17-19. קריאת נתונים של אותות ניתן לבצע באמצעות קוראי צלחת, ניתוח FACS או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראוי לציין, השיטה מספקת גם את האפשרות לעקוב אחר טרנסלוקציה בזמן אמת על ידי מיקרוסקופ לחיות התאים במהלך 20,21 תהליך ההדבקה. כאן מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת הלייזר יושם לreadouלא של אותות הקרינה כפי שהוא מספק רגישות ודיוק הגבוהות ביותר. בפרט, את היכולת להתאים את חלון הפליטה עם דיוק ננומטר בשילוב עם גלאים גבוהים רגישים מקל מותאמת גילוי הקרינה ולמזער הצטלבות. בנוסף התקנת מיקרוסקופיה זה יכולה להיות מותאם לניטור של טרנסלוקציה בזמן אמת ובאופן פוטנציאלי מאפשרת לניתוח בו זמני של אינטראקציה מארח הפתוגן ברמה התאית.
בשיעורי טרנסלוקציה מחקר זה של י ' זן enterocolitica פראי סוג ומוטצית מחיקת YopE מציגה פנוטיפ hypertranslocator 10,11 נותחו exemplarily.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיא פליטה וקביעת הצלב-שיחה (ראה גם איור 2)
- על מנת לקבוע את פסגות הפליטה וסכום של שיחה בין-בין התורם (V450 נגזר coumarin) וצבעים acceptor (העמסה), לבצע סריקות רפאים של תאים שכותרתו עם שני fluorophores הפרט ב 405 ננומטר עירור.
- לקבוע את רוחב פס של 10 ננומטר בשיא של כל צבע שישמש עבור ערוצי תורם acceptor (כאן 455-465 ננומטר ו525-535 ננומטר). העלילה העצמה המנורמלת על הגל ולחשב את האחוז הממוצע של הצטלבות של צבע התורם בערוץ acceptor ולהיפך (איור 2).
2. הכנה של י ' enterocolitica זנים לזיהום תרבית תאים
- השתמש בזנים הבאים: WA-314 PMK-ביציות (WA-314 הפכו עם פלסמידים PMK-בלה 17 וPMK-ביציות 17, בהתאמה) וWA-314ΔYopE PMK-בלה (שר-המים314ΔYopE הפך עם פלסמיד PMK-בלה 17)
- לפחות יומיים לפני י 'פס ההדבקה enterocolitica זני WA-314 PMK-ביציות, WA-314 PMK-בלה וWA-314ΔE PMK-בלה מקריו מניות על צלחות LB-אגר המכילות אנטיביוטיקה הנדרשת (kanamycin לWA-314 PMK-בלה וWA-314 PMK-ביציות ; Kanamycin וטטרציקלין לWA-314ΔE PMK-בלה) ולגדול O / N ב 27 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשמור את הצלחות לעד שבוע ב 4 ° C.
- יום אחד לפני ההדבקה לחסן 3 מיליליטר של LB-בינוני המכיל אנטיביוטיקה הנדרשת עם מושבה אחת של הזנים המתאימים ודגירת O / N ב 27 ° C שייקר ב 180 סל"ד.
- ביום של זיהום לחסן 2 מיליליטר של O / תרבות N ל40 מיליליטר של LB-בינוני טרי ללא אנטיביוטיקה ודגירה של 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס שייקר ב 180 סל"ד לגרום לביטוי של מערכת הפרשת הסוג השלישית.
- העבר את התרבויות לתוך צינור מתאים ולשמור על התרבויות על קרח או על 4 מעלות צלזיוסמעכשיו. צנטריפוגה התרבויות במשך 10 דקות בXG 5000 ו- 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend גלולה חיידקים ב2-3 מיליליטר של קרח הקר PBS. לדלל את ההשעיה החיידקים בריכוז של 8 x 10 8 CFU / ml באמצעות ספקטרופוטומטר. לקבוע את הצפיפות האופטית המקבילה בנפרד. שמור השעיה זו על קרח עד הדבקת תאי הלה.
3. תאי ציפוי הלה
- לפני זרע זיהום 1.5 x 10 4 תאי תאי הלה יום אחד בDMEM 200 μl סרום המכיל 10% חום מומת עגל עוברי (FCS) בבארות של צלחת גם 96 ולטפח ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. זרעי שלוש בארות עבור כל זן (שלוש פעמים דגירה שונות).
4. זיהום של תאי הלה וטעינה עם CCF4
- להדביק תאי הלה על ידי הוספת 3.5 μl של ההשעיה החיידקים לטווח הבינוני ולערבב בעדינות על ידי pipetting בינוני פעמיים. לאפשר לחיידקים למשקעים בלתאים במשרד פנים (מחצית מזיהום) של כ -100 חיידקים לכל תא. לקורס זמן להתחיל זיהומים ב-90 דקות, ודקות -60 דקות -30 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 עד 0 דקות כדי להשיג נקודת סיום משותפת.
- כאשר הדגירה תושלם, לשאוב בזהירות הבינוני מבלי להסיר תאי הלה ולהוסיף 50 μl של PBS המכיל 20 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol להפסיק ביטוי של effectors וprobenecid 2.5 מ"מ להפחתת יצוא של CCF4.
- בשלב זה להעביר את צלחת 96-היטב לבמת מיקרוסקופ ולהגדיר כתמים מתאימים לניתוח מאוחר יותר בכל טוב. לסיים שלב זה תוך 10 דקות (לפירוט ראה סעיף 5.1 רכישה).
- בכל טוב, להוסיף 70 μl של פתרון CCF4 / טעינה בבוקר (פתרון 0.24 μl, פתרון B 1.2 μl, 18.56 μl C פתרון (פתרון, B, ו- C הניתן בערכה / טעינה בבוקר CCF4) ו -50 μl PBS (המכיל 20 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol ו -2.5 probenecid מ"מ) באמצעות p רבipette דגירה במשך 5 דקות ב RT. מעתה והלאה עבודה ללא הפרעות.
- לשאוב את פתרון הטעינה ולהוסיף 100 של PBS μl המכיל 20 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol וprobenecid 2.5 מ"מ באמצעות פיפטה רבת. לאחר מכן במהירות להעביר את צלחת 96 גם לבמת מיקרוסקופ ולהתחיל רכישה בתוך 10 דקות משאיפה של פתרון הטעינה.
5. סריקת הלייזר מיקרוסקופית וניתוח של נתונים
- רכישת תמונה
- הגדר את תנאי ההדמיה בדרך למקסם את סך ספירת הפוטון ולמזער phototoxicity, photobleaching והעירור צולב.
- במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal מודרני, להשתמש אובייקטיבי מספרית גבוהה 20X טבילת צמצם, לפתוח את חריר הגלאי 2.5 יחידות אווריריות (כלומר חתך אופטי רחב,), לבחור רגישות גבוהה Gaasp גלאי עם ערוצי תורם acceptor בו זמנית פעילים, עומק 8 סיביות , ~ 750 גודל פיקסל ננומטר, מיצוע המסגרת של פי 3 וExcitדואר עם 10% מדיודת לייזר 405 ננומטר.
- כדי להבטיח כימות נכון להגדיר את רווח הגלאי של שני הערוצים לאותו הערך ולהימנע מכל פיקסלים רוויים.
שים לב: כאן, הרווחים נקבעו ל -150%.
- ודא טבילה רציפה על ידי הפצה בינונית טבילה לתחתית הבארות, למשל עם מזרק 1 מיליליטר, ולהימנע מהשמנה של כל בועות אוויר.
- הפעל את האור המועבר ולמצוא שדה נציג של נוף בכל היטב. השתמש בשלב אוטומטי מכויל כראוי ולסמן את המיקום בתוכנה.
- לאחר הסרת הצלחת לצביעה (ראה סעיף 4.3), הכנס שוב את הצלחת ולהוסיף משקל על עליון כדי למנוע סחף מוקדי. סקור את העמדות נשמרו עם מצב סריקת הלייזר ולהתאים את המיקוד ומיקום לרוחב כמו שצריך.
- הגדר את הזמן לשגות 2 דקות, את משך הזמן עד שעה 2 ולהתחיל רכישה.
- הגדר את תנאי ההדמיה בדרך למקסם את סך ספירת הפוטון ולמזער phototoxicity, photobleaching והעירור צולב.
- כימות תמונה (דוגמאות תינתן לBitplane Softwהם כמו Imaris)
- לייבא את בסיס הנתונים לתוכנה המאפשרת חישובים אריתמטיים של מטריצות פיקסל. לעשות זאת על ידי גרירה ושחרור של קובץ המקור המכיל את שני התורם וערוץ acceptor על סמל התוכנה.
- הפחת את הרקע בשני הערוצים באמצעות אותו הקיזוז. כדי לעשות זאת, לחץ על תפריט ולאחר מכן לחץ על תמונה> עיבוד> Baseline חיסור. בחר כל ערוץ והזן את הערך הבסיסי.
- תקן את לדמם דרך ערוץ התורם (CH1) לערוץ acceptor (CH2) עם F נקבע מראש תיקון הגורם (ראה 1.1), יצירת ערוץ חדש:
CH2 '= CH2 - CH1 * F
הערה: לדמם דרכו של acceptor לערוץ התורם לא הייתה לזיהוי על רמת הרעש.- לחץ על תפריט> עיבוד תמונה> ערוץ האריתמטיקה ולהיכנס ABS (ch2- (CH1 * 0.33)). לאחר מכן למחוק ערוץ 2 על ידי לחיצה על תפריט> ערוך> מחק ערוצים. ודא שלדמם דרך ערוץ acceptor תיקן נשאר כערוץ החדש 2. אופציונליים: שנה את צבע ערוץ מאפור לצבע המקורי על ידי לחיצה על תפריט> מאפייני Edit> תמונה. בחר ערוץ 4> צבע> צבע בסיס ממופה ולשנות אותו לדוגמה, ירוק.
- יצירת ערוץ חדש עם הפעולה הבאה כדי לקבוע את מקדם סריג היחסי:
CH3 CH2 = "/ (CH1 CH2 + ')- עבור לתפריט> עיבוד תמונה> ערוץ האריתמטיקה ולהיכנס CH2 ./ (CH1 CH2 +)
- להדמיה תקינה של ערוץ סריג בתמונה 8 סיביות, ליצור ערוץ רביעי:
CH4 = 255 CH3 *- עבור לתפריט> עיבוד תמונה> ערוץ האריתמטיקה ולהיכנס 255 CH3 *. שינוי צבע הערוץ על ידי לחיצה על תפריט> מאפייני Edit> תמונה. בחר 4> קובץ ממופה ערוץ הצבע> צבע שולחן> Jet.
- החל מסנן חציון 3x3 לCH3 ערוצים וtha CH4לא יפחית את הרעש בתמונות. כדי לעשות זאת, לחץ על תפריט> עיבוד תמונה>> סינון חציון החלקה. בחר בשני הערוצים ולהחיל גודל מסנן "3x3x1".
- לכימות של אותות סלולריים, לזהות את התאים בCH4 ידי הגדרה כראוי קיזוז ולסנן את המבנים לפי גודל שלא לכלול מבנים קטנים מדי.
- בחר לעלות הצג ולחץ על הסמל "הוסף משטחים חדשים". הגדר את הפרמטרים אלגוריתם זיהוי בחלון Surface. לעיבוד מהיר יותר, להפעיל את שתי תיבות סימון "מגזר רק אזור של עניין" ו- "תמונה כל תהליך סוף סוף". הגדר את האזור של עניין על ידי עריכת ממדיו.
- בחר ערוץ 4 כערוץ המקור ולקבוע את הסף על ידי קביעת ערכי סף> רקע חיסור (ניגודיות המקומית) ולהגדיר קוטר 10 מיקרומטר. הגדר את סף מינימום העצמה ידני ל0 ואת הסף המרבי להתעצם המרביטאי. סנן את המבנים על ידי אזור ולהגדיר את הערך המינימאלי לדוגמה, μm² 187. לסיים את זיהוי פני השטח.
- לחלץ את הערכים הממוצעים לעוצמת הקרינה תורם (CH1) ומקדם סריג יחסי (CH3) וסטיות התקן שלהם בישות הסלולרית. כדי לעשות זאת, ללכת למאפייני פני השטח. לשנות את המראה של המבנים על ידי בחירה> משטח / איכות סגנון משטחים. בחר את כל המבנים על ידי לחיצה על כרטיסיית המסננים. לאחד את המבנים שזוהו על ידי הולך לתהליך בחירה> לאחד. לייצא את הנתונים הסטטיסטיים משטח ל- MS Excel על-ידי לחיצה על הכרטיסייה בסטטיסטיקה> סטטיסטיקה יצוא לקובץ.
- עלילה ערכים אלה לאורך זמן. זהה את מרווח 10 דקות של שיפוע המרבי של עליית הקרינה ערוץ תורם לכל מצב כפרמטר סביר לייצג את כמות מפעיל translocated. חשב את השיפוע כמטר = עוצמת הקרינה תורם Δ / שעת Δ (דקות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את היכולת של השיטה המתוארת לנתח טרנסלוקציה מפעיל לתאי יעד כמותית, שני זני Yersinia עם קינטיקה טרנסלוקציה שונה נחקרו: י ' זן enterocolitica סוג בר WA-314 (serogroup O8, מחסה פלסמיד הארסיות 22 pYVO8) וWA-314ΔYopE (WA-314 מחסה pYVO8ΔYopE 23) הנגזרים שלה. העבודה קודמת הראתה כי י ' מוטציות enterocolitica חסרות תערוכת YopE פונקציונלית טרנסלוקציה שיעור יופ גבוה באופן משמעותי 10. שני הזנים הפכו עם קידוד וקטורים לשילובים של אות הפרשת n-מסוף של YopE וTEM-1 בטא לקטמאז (PMK-בלה) 17. WA-314 הפכו גם עם קידוד וקטור להיתוך בהתאמה YopE ovalbumin (PMK-ביציות 17) לשמש כביקורת שלילית. פעמים דגירה של 30, 60 ו -90 דקות יושמו כדי להעריך את method`s טווח היעיל נוסףהתאמת ND לכימות. שתי קריאות שונות ששימשו לניתוח נתונים: הקרינה תורם (CH1) ומקדמי סריג יחסי (CH3 CH2 = "/ (CH1 CH2 +")) (איור 1 ו1C).
למתח השלילי שליטת מזימות WA-314-PMK-ביציות של עוצמות ערוץ תורם (CH1) לאורך זמן לא מראה עלייה של פליטת הקרינה ללא קשר לזמן הדגירה (איור 1). לעומת זאת, בתאי WA-314-PMK-בלה נגועים גידול של עוצמת הקרינה לאורך הזמן התגלה מעיד על הנוכחות של היתוך בטא לקטמאז YopE בציטופלסמה תא המטרה. כצפוי השיפוע המרבי של עוצמת הקרינה מתואם חיובי עם האורך של זיהום (30 דקות של זיהום: 0.10 / דקה, זיהום 60 דקות: 0.33 / דקה, זיהום 90 דקות: 0.76 / min) מצביע על כך שריכוזים שונים של בטא translocated lactamase יכול להיות מכובד. בהתאם למחקרים קודמים WA-31תאים נגועים 4ΔYopE-PMK-בלה להציג גידול מהיר יותר של עוצמת הקרינה בהשוואה לזן מהסוג בר (30 דקות של זיהום: 1.28 / דקה, 60 דקות זיהום: 1.53 / דקה, 90 דקות זיהום: 1.41 / min). מעניין, הרחבת זיהום עד 90 דקות לא להאיץ עוד יותר את העלייה של הקרינה תורם לעומת 60 דקות של זיהום (איור 1). ממצא זה כנראה יכול להיות מוסבר על ידי ההשפעה הרעילה לתאים המתקדמים המופעל על ידי WA-314ΔYopE-PMK-בלה, אשר גם יכול לעכב טרנסלוקציה היעילה מעבר 60 דקות של זיהום או להוביל לאובדן של צבעי הקרינה בשל שיבוש של שלמות קרום פלזמה. התוצאות הניתנות על ידי שימוש במקדם היחסי סריג (CH3) לניתוח הנן בהתאם טוב עם התוצאות שהושגו על ידי ערוץ התורם לבד. עם זאת, בכמה תנאים (WA-314ΔYopE-PMK-בלה, 60 ו -90 זיהום דקות) מייצגים כמויות גדולות מאוד של היתוך בטא לקטמאז translocated, כמובן מצע CCF4 היה בבהתמדה מעובד לפני יכולה להתחיל הדמיה. תנאים אלה לא יאפשר לחישוב שיפוע שלילי מקסימאלי סביר כי החלק הרלוונטי של העקומה הוא החמיץ בייצוג נתונים זה (איור 1 ג). תמונות של הערוץ מקדם סריג ביחס לספק את האפשרות להשוות הבדלים בין תאים הבודדים (1D איור).
איור 1. ניתוח כמותי של טרנסלוקציה מפעיל על ידי שילובי TEM-1 YopE בי ' enterocolitica. () הידרוליזה של CCF4 מצע על ידי בטא לקטמאז TEM-1 translocated הייתה פיקוח על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר. עירור ב 405 ננומטר הביא פליטת הקרינה ירוקה (530 ננומטר) של המצע שלם ובפליטת הקרינה הכחולה (460 ננומטר) של יחסי ציבור הידרוליזה ביקעoduct (coumarin). (B, C) נתונים מיקרוסקופית נותחו כמותית על ידי התוויית את עוצמת ערוץ תורם (CH1) או חישוב והתוויית של מקדמי סריג היחסי (CH3 CH2 = "/ (CH1 CH2 +")). הנתונים הם נציג של שלושה ניסויים בלתי תלויים. Micrographs (ד ') מתואר (סריג ערוץ) נלקחו מסרטי נציג בנקודות זמן המצוינות. WA-314ΔE-PMK-בלה תאים נגועים מראים ירידה מהירה יותר של מקדמי סריג היחסי בהשוואה לסוג הבר WA-314-PMK-בלה (60 זיהום דקות). בר סולם, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. קביעת צלב-דיבורים של V450 fluorophores וFITC.הספקטרום של שני fluorophores הפרט נמדד עם מיקרוסקופ confocal. לדמם דרכו של V450 התורם לערוץ acceptor בטווח הגלאי 525-535 ננומטר חושבה מרגרסיה ליניארית (הוספה). האחוז הממוצע של crosstalk מחושב משתי מדידות שווה 0.33. לדמם דרכו של FITC acceptor לערוץ התורם (455-465 ננומטר) לא היה לזיהוי על רמת הרעש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו כאן מיושמים בהצלחה מבוססת assay כתב בטא לקטמאז TEM-1 לניתוח כמותי של טרנסלוקציה מפעיל על ידי י ' enterocolitica. וריאציות שונות של טכניקה רגישה, ספציפית ופשוטה יחסית זו תוארו בספרות. במחקר זה מיקרוסקופ סריקת לייזר נערך לגילוי רגיש והמדויק ביותר של אותות הקרינה. באופן ספציפי את התיקון להצטלבות בין צבעי תורם acceptor ורוחביים פס גילוי בנפרד להתאמה מאפשר דיוק מעולה של מדידה בהשוואה לגרסות אחרות של השיטה. התוצאות מראות בבירור כי השיטה היא מסוגלת כמותית ניתוח טרנסלוקציה. פעמים דגירה שונות המייצגות ריכוזים שונים של בטא לקטמאז תאיים היו מתואמות חיובי עם השיפוע של עוצמת הקרינה תורם. גם שיעור גבוה משמעותי של טרנסלוקציה WA-314ΔYopE השוואהלזן מהסוג בר WA-314 יכולים להיות הפגינו.
שתי אפשרויות חלופיות לניתוח נתונים יושמו: עוצמות ערוץ התורם ומקדמי סריג יחסי. היתרון של שימוש בערוץ התורם הוא שזה ישירות מייצג את ההצטברות של מוצר CCF-4 הידרוליזה (coumarin). גישה זו היא אפשרית בהתקנה מיקרוסקופית, כי אחר מאשר בתיקון קורא צלחת להבדלים בצפיפות תא באמצעות יחס של תורם / acceptor אינו הכרחי. עם זאת, יצוא של צבע CCF4 או מוצרי הידרוליזה שלה הוא עדיין confounder אפשרי בגישה זו. חסרון זה ניתן להתגבר על ידי חישוב מקדם סריג היחסי.
בניסויים ההתקנה המתוארות נערכו ב 96 צלחות גם. פורמט זה מאפשר לבדיקה של מספר תנאים בניסוי אחד ועוזר לחסוך בכימיקלים יקרים (במיוחד ערכת טעינת CCF4 / AM). בעבודה תיארה אותו הוא קריטית כדי להתחיל imרכישת גיל בנקודת זמן מוגדרת, זמן קצר לאחר תוספת של פתרון טעינת CCF4 / AM כי הידרוליזה של CCF4 ידי בטא לקטמאז translocated מתחילה מייד. במקרה של עיבוד למצבים רבים בו-זמנית, התאמה של מוקד ועמדות לרוחב (צעד 5.1.4) עלולה לקחת זמן רב מדי ופוגעת בזמן תחילת רכישת תמונה. לכן, המספר המרבי של דגימות מקבילות צריך להיקבע בנפרד.
אחת הבעיות העיקריות נתקלו בשיטה זו היה היצוא הניכר של מצע CCF4 ידי תאי הלה על 37 מעלות צלזיוס. תופעה זו לא יכולה להיות מספיק נוטרלה על ידי טיפול בתאים עם probenecid. לכן החלטנו, במקום טרנסלוקציה הניטור במהלך הזיהום המתמשך כפי שתואר לעיל, לזיהום הראשון מלא ולאחר מכן לטעון את התאים עם צבע CCF4 / AM. עם גישה זו ניתן היה לפקח על העיבוד של מצע CCF4 ב RT. תחת תנאים אלו reduיצוא CED של CCF4 נצפה. נראית את כמות היצוא של מצע CCF4 להיות קו תא ספציפי; ההתקנה המתוארת כאן מאפשרת ניתוח אמין של טרנסלוקציה גם בשורות תאים, שמאוד לייצא CCF4 על 37 מעלות צלזיוס.
יצוא של CCF4 הוא לא בעיה בכמה שורות תאים אחרות המאפשרות לאמץ את הגדרת מיקרוסקופיה לניטור תהליכי הזיהום וטרנסלוקציה בו זמנית בזמן אמת. זה מספק את האפשרות לנתח טרנסלוקציה לתאים בודדים ויכול לשמש כדי לתאם טרנסלוקציה עם אירועים ספציפיים של אינטראקציה תא מארח כמו הדבקה או היווצרות של מיקרו-מושבות 20 חיידקים. לכן, assay זה הוא כלי רב ערך כדי להבהיר עוד יותר את המנגנונים של איך טרנסלוקציה מוסדרת בגומלין של חיידקים ותאי מארח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
