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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

का विश्लेषण Published: October 13, 2015 doi: 10.3791/53115
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Abstract

रोगजनक यर्सीनिया एसपीपी सहित कई ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया। यूकेरियोटिक लक्ष्य कोशिकाओं में प्रेरक प्रोटीन सरकाना करने प्रकार III स्राव सिस्टम को रोजगार। मेजबान कोशिका के अंदर प्रेरक प्रोटीन बैक्टीरिया के लाभ के लिए सेलुलर कार्यों में हेरफेर। बेहतर translocation को मापने के लिए मेजबान सेल बातचीत, संवेदनशील और सटीक assays के दौरान प्रकार III स्राव के नियंत्रण को समझने के लिए आवश्यक हैं। हम यहाँ एक यर्सीनिया enterocolitica प्रेरक प्रोटीन टुकड़ा के विलय पर आधारित एक परख (यर्सीनिया बाहरी प्रोटीन; YopE) के आवेदन का वर्णन है। स्थानान्तरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ साथ परख के लिए एक सेल की दरार पर निर्भर करता है permeant झल्लाहट डाई translocated बीटा-लैक्टामेज़ संलयन द्वारा (CCF4 / बजे)। Fluorescein बाधित और कूमेरिन आधा भाग की उत्तेजना नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की ओर जाता है के लिए बीटा-लैक्टामेज़ द्वारा CCF4 के Cephalosporin कोर की दरार के बाद, कूमेरिन से झल्लाहट।इस विधि के विभिन्न अनुप्रयोगों अपनी बहुमुखी प्रतिभा पर प्रकाश डाला साहित्य में वर्णित किया गया है। विधि एक माउस मॉडल में, इन विट्रो में स्थानान्तरण के विश्लेषण के लिए और भी इन विवो, जैसे की अनुमति देता है। प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने प्लेट पाठकों, FACS विश्लेषण या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है। अलग यर्सीनिया म्यूटेंट द्वारा हेला कोशिकाओं में प्रेरक Fusions की इन विट्रो translocation में, यहाँ वर्णित सेटअप में लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी है। वास्तविक समय में बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक संलयन द्वारा झल्लाहट रिपोर्टर के intracellular रूपांतरण रिकॉर्डिंग मजबूत मात्रात्मक परिणाम प्रदान करता है। हम यहाँ एक वाई की वृद्धि हुई translocation का प्रदर्शन, अनुकरणीय डेटा दिखाने जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में enterocolitica YopE उत्परिवर्ती।

Introduction

प्रकार III स्राव सिस्टम सीधे यूकेरियोटिक लक्ष्य कोशिकाओं में bacterially इनकोडिंग प्रेरक प्रोटीन देने के लिए ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के विभिन्न पीढ़ी द्वारा उपयोग विशेष प्रोटीन निर्यात मशीनें हैं। स्राव मशीनरी में ही अत्यधिक संरक्षित है, वहीं प्रेरक प्रोटीन का विशेष सेट सेलुलर संकेत दे रास्ते में हेरफेर और विशिष्ट बैक्टीरियल विषैलापन रणनीतियों 1 की सुविधा के लिए विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु के बीच विकसित किया है। यर्सीनिया के मामले में, सात प्रेरक प्रोटीन, तथाकथित Yops (यर्सीनिया बाहरी प्रोटीन) के लिए, मेजबान सेल संपर्क पर translocated और ऐसे यानी phagocytosis और साइटोकाइन उत्पादन, के रूप में प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया नाश करने के लिए एक साथ काम कर रहे हैं, बैक्टीरिया के बाह्य अस्तित्व की अनुमति के लिए 2-4। translocation की प्रक्रिया कसकर विभिन्न चरणों 5 पर नियंत्रित किया जाता है। यह T3SS के प्राथमिक सक्रियण लक्ष्य सीई को अपने संपर्क में आने से शुरू हो रहा है कि स्थापित हैकरूँगा 6। हालांकि, इस दीक्षा की सटीक व्यवस्था अभी तक स्पष्ट की जानी है। यर्सीनिया में स्थानान्तरण के तथाकथित ठीक ट्यूनिंग के एक दूसरे स्तर ऊपर से या नीचे विनियमन सेलुलर रो जीटीपी बंधनकारी प्रोटीन Rac1 या RhoA की गतिविधि हासिल की है। Invasin या साइटोटोक्सिक नेक्रोटाइज़िंग कारक वाई (CNF-वाई) द्वारा जैसे Rac1 के एक्टिवेशन गैप translocated YopE के समारोह (GTPase प्रोटीन सक्रिय) जबकि Rac1 गतिविधि नीचे-नियंत्रित करता है और तदनुसार एक नकारात्मक प्रतिक्रिया प्रकार से translocation कम हो जाती है, बढ़ translocation 7-9 की ओर जाता है तंत्र 10,11 की।

वैध और सटीक तरीके translocation यर्सीनिया मेजबान सेल बातचीत के दौरान नियंत्रित किया जाता है कैसे जांच करने के लिए शर्त है। कई अलग अलग प्रणालियों विशिष्ट लाभ और कमियों के साथ प्रत्येक, इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है। कुछ दृष्टिकोण पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद अलग डिटर्जेंट से संक्रमित कोशिकाओं की सेल नहीं बल्कि बैक्टीरिया पर भरोसा करते हैं। गुइन तरीकों में से ई आम दोष नाबालिग लेकिन अपरिहार्य बैक्टीरियल सेल संभावित बैक्टीरिया से जुड़े प्रेरक प्रोटीन के साथ सेल lysate contaminates है। हालांकि, बाह्य प्रेरक प्रोटीन और कोशिकाओं के चुनिंदा सेल के लिए digitonin के बाद के उपयोग नीचा करने के लिए proteinase कश्मीर के साथ कोशिकाओं के इलाज से इस समस्या को 12 कम करने के लिए प्रस्तावित किया गया। महत्वपूर्ण बात है, इन assays महत्वपूर्ण ज्यादातर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, जो उच्च गुणवत्ता विरोधी प्रेरक एंटीबॉडी, पर निर्भर करते हैं। प्रयास फ्लोरोसेंट प्रोटीन का गोलाकार तृतीयक संरचना और स्राव 13 से पहले उन्हें प्रकाशित करना स्राव तंत्र की अक्षमता को शायद सफल कारण नहीं थे translocation नजर रखने के लिए GFP जैसे प्रेरक प्रोटीन के translational fusions और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करने के लिए। 14 या फ़्लैश cyclolysin Bordetella काली खांसी विष का हालांकि, CYA तरह कई अलग अलग संवाददाता टैग (calmodulin निर्भर adenylate साइक्लेज) डोमेनटैग सफलतापूर्वक translocation का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। फ़्लैश टैग, एक बहुत ही कम tetracysteine ​​(4Cys) मूल भाव टैग, स्राव की प्रक्रिया के बिना परेशान biarsenical डाई फ्लैश के साथ लेबलिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि पूर्व परख में CYA के enzymatic गतिविधि इंट्रासेल्युलर संलयन प्रोटीन का संकेत बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है 15।

यहाँ लागू दृष्टिकोण से Charpentier एट अल। पहली बार के लिए सूचित किया गया था और translocated प्रेरक मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ fusions 16 (चित्रा 1 ए) द्वारा Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) डाई CCF4 के intracellular रूपांतरण पर आधारित है। CCF4 / पूर्वाह्न एक कूमेरिन के derivate (दाता) और एक fluorescein आधा भाग (स्वीकर्ता) एक cephalosporin कोर से जुड़े हुए हैं, जिसमें एक सेल permeant यौगिक है। यूकेरियोटिक सेल में निष्क्रिय प्रवेश करने पर, CCF4 / AM यौगिक एस्टरीकृत गैर फ्लोरोसेंट का आरोप लगाया और फ्लोरोसेंट CCF4 के लिए सेलुलर esterases द्वारा कार्रवाई की और इस तरह फंस गया हैकोशिका के भीतर। 530 एनएम पर एक हरे रंग की प्रतिदीप्ति संकेत उत्सर्जन करता है जो fluorescein आधा भाग, को झल्लाहट में 405 एनएम परिणामों पर कूमेरिन आधा भाग की उत्तेजना। बीटा-लैक्टामेज़ झल्लाहट द्वारा सेफैलोस्पोरिन कोर की दरार के बाद बाधित है और कूमेरिन आधा भाग की उत्तेजना एनएम at460 नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन होता है। इस विधि के विभिन्न अनुप्रयोगों अपनी बहुमुखी प्रतिभा पर प्रकाश डाला साहित्य में वर्णित किया गया है। विधि इन विट्रो में स्थानान्तरण के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और यह भी इन विवो, जैसे, तकनीक विवो 17-19 में translocation के लिए लक्षित ल्युकोसैट आबादी की पहचान करने के लिए एक माउस संक्रमण मॉडल में इस्तेमाल किया गया था। संकेतों के readout प्लेट पाठकों, FACS विश्लेषण या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है। ध्यान से, विधि भी संक्रमण की प्रक्रिया 20,21 के दौरान रहते सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा वास्तविक समय में translocation नजर रखने के लिए संभावना प्रदान करता है। यहां लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी readou के लिए लागू किया गया थाप्रतिदीप्ति संकेतों के टी यह उच्चतम संवेदनशीलता और सटीकता प्रदान करता है। विशेष रूप से, क्षमता उच्च संवेदनशील डिटेक्टरों के साथ संयोजन में नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ उत्सर्जन खिड़की प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए अनुकूलित और पार बात कम से कम की सुविधा को समायोजित करने के लिए। इसके अलावा इस माइक्रोस्कोपी सेटअप स्थानान्तरण के वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और संभवतः सेलुलर स्तर पर मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

एक वाई के इस अध्ययन translocation दरों में enterocolitica जंगली प्रकार के तनाव और एक hypertranslocator फेनोटाइप 10,11 का प्रदर्शन एक YopE विलोपन उत्परिवर्ती exemplarily विश्लेषण किया गया।

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Protocol

1. चोटी उत्सर्जन और क्रॉस-टॉक निर्धारण (इसके अलावा 2 आंकड़ा देखें)

  1. , उत्सर्जन चोटियों और दाता के बीच परस्पर बात (कूमेरिन के derivate V450) और स्वीकर्ता (fluorescein) रंगों की राशि का निर्धारण 405 एनएम उत्तेजना पर व्यक्तिगत fluorophores दोनों के साथ लेबल की कोशिकाओं के वर्णक्रम स्कैन प्रदर्शन करने के लिए।
  2. दाता और स्वीकर्ता चैनल (यहां 455-465 एनएम और 525-535 एनएम) के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि हर रंग के शिखर के भीतर एक 10 एनएम बैंडविड्थ का निर्धारण करें। तरंगदैर्ध्य से अधिक सामान्यीकृत तीव्रता साजिश है और स्वीकर्ता चैनल और इसके विपरीत (चित्रा 2) में दाता डाई के पार बात का औसत प्रतिशत की गणना।

वाई के 2. तैयारी सेल संस्कृति संक्रमण के लिए enterocolitica खींच

  1. निम्नलिखित उपभेदों का उपयोग करें: वाशिंगटन 314 पीएमके अंडाणु और (वाशिंगटन 314 17 पीएमके bla और पीएमके अंडाणु 17, क्रमशः प्लास्मिडों के साथ बदल) वा-314ΔYopE पीएमके bla (Wa-) 17 314ΔYopE प्लाज्मिड के साथ बदल पीएमके bla
  2. संक्रमण लकीर वाई पहले कम से कम दो दिन enterocolitica उपभेदों वाशिंगटन 314 पीएमके अंडाणु, वाशिंगटन-314 पीएमके bla और वाशिंगटन 314ΔE वाशिंगटन 314 पीएमके bla और वाशिंगटन 314 पीएमके अंडाणु के लिए (केनामाइसिन आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं युक्त लेग अगर प्लेटों पर शेयरों क्रायो से पीएमके बीएलए ; केनामाइसिन और वाशिंगटन 314ΔE पीएमके bla के लिए टेट्रासाइक्लिन) और 27 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन बढ़ता है। बाद में एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस के लिए प्लेटें रहते हैं।
  3. संक्रमण से पहले एक दिन संबंधित उपभेदों में से एक कॉलोनी के साथ आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं युक्त लेग मध्यम के 3 मिलीलीटर टीका लगाना और 180 rpm पर एक प्रकार के बरतन में 27 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  4. संक्रमण के दिन पर एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ताजा लेग माध्यम के 40 एमएल में हे / एन संस्कृति के 2 मिलीलीटर टीका लगाना और प्रकार III स्राव प्रणाली की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए 180 rpm पर एक प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. एक उपयुक्त ट्यूब में संस्कृतियों स्थानांतरण और सी बर्फ पर या 4 डिग्री पर संस्कृतियों रखनाअब से। 5000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए संस्कृतियों अपकेंद्रित्र।
  6. बर्फ के 2-3 मिलीलीटर ठंड पीबीएस में बैक्टीरिया गोली Resuspend। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 8 x 10 8 CFU / एमएल की एकाग्रता के लिए जीवाणु निलंबन पतला। व्यक्तिगत रूप से इसी ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण करते हैं। हेला कोशिकाओं को संक्रमित तक बर्फ पर इस निलंबन रखें।

3. चढ़ाना हेला प्रकोष्ठों

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में खेती 200 μl DMEM में एक दिन संक्रमण बीज से पहले 1.5 x 10 4 कोशिकाओं हेला कोशिकाओं। प्रत्येक तनाव (तीन अलग ऊष्मायन बार) के लिए तीन कुओं बीज।

4. हेला कोशिकाओं के संक्रमण और CCF4 के साथ लोड हो रहा है

  1. मध्यम करने के लिए जीवाणु निलंबन की 3.5 μl जोड़कर हेला कोशिकाओं को संक्रमित और धीरे मध्यम दो बार pipetting द्वारा मिश्रण। बैक्टीरिया पर तलछट करने की अनुमति देंसेल के बारे में प्रति 100 बैक्टीरिया की एक MOI (संक्रमण का आधा भाग) पर कोशिकाओं के लिए। एक समय के पाठ्यक्रम के लिए -90 मिनट, -60 मिनट और -30 मिनट पर संक्रमण के शुरू और एक आम अंत बिंदु को प्राप्त करने के लिए 0 मिनट तक एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. ऊष्मायन पूरा हो गया है, ध्यान से हेला कोशिकाओं को हटाने के बिना मध्यम महाप्राण और CCF4 के निर्यात को कम करने के लिए प्रभावोत्पादक और 2.5 मिमी प्रोबेनेसिड की अभिव्यक्ति को रोकने के लिए 20 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol युक्त पीबीएस के 50 μl जोड़ें।
  3. इस बिंदु पर माइक्रोस्कोप चरण में 96 अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण और अच्छी तरह से प्रत्येक में बाद में विश्लेषण के लिए उपयुक्त स्पॉट परिभाषित करते हैं। 10 मिनट के भीतर इस कदम समाप्त (अधिग्रहण की जानकारी के लिए खंड 5.1 देखें)।
  4. प्रति अच्छी तरह से, 20 से युक्त CCF4 / AM लोड हो रहा समाधान (0.24 μl समाधान ए, 1.2 μl समाधान बी के 70 μl, 18.56 μl समाधान सी (समाधान ए, बी, और सी CCF4 / AM लोड हो रहा किट के भीतर प्रदान की) और 50 μl पीबीएस (जोड़ना एक बहु पी का प्रयोग माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol और 2.5 मिमी प्रोबेनेसिड)ipette आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और। अब काम पर रुकावट के बिना से।
  5. लोड हो रहा है समाधान Aspirate और एक बहु पिपेट का उपयोग कर 20 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol और 2.5 मिमी प्रोबेनेसिड युक्त पीबीएस के 100 μl जोड़ें। फिर तेजी से माइक्रोस्कोप चरण में 96 अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण और लदान समाधान की आकांक्षा से 10 मिनट के भीतर अधिग्रहण शुरू।

5. लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और डेटा का विश्लेषण

  1. चित्र अधिग्रहण
    1. Phototoxicity, photobleaching और पार उत्तेजना कुल फोटोन गिनती को अधिकतम करने और कम करने के लिए एक तरह से इमेजिंग की स्थिति निर्धारित करें।
      1. एक आधुनिक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग में, एक साथ सक्रिय दाता और स्वीकर्ता चैनलों, 8 बिट गहराई के साथ उच्च संवेदनशीलता GaAsP-डिटेक्टरों चुनें, 2.5 हवादार इकाइयों (यानी, विस्तृत ऑप्टिकल सेक्शनिंग) को डिटेक्टर पिनहोल खोलने, एक 20X उच्च संख्यात्मक एपर्चर विसर्जन उद्देश्य का उपयोग ~ 750 एनएम पिक्सेल आकार, 3 गुना फ्रेम औसत और Excitएक 405 एनएम डायोड लेजर का 10% के साथ ई।
      2. सही मात्रा का ठहराव एक ही मूल्य के लिए दोनों चैनलों की डिटेक्टर लाभ सेट सुनिश्चित करने के लिए और किसी भी संतृप्त पिक्सल से बचने के लिए।
        नोट: यहाँ, लाभ 150% करने के लिए निर्धारित किया गया।
    2. 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ उदाहरण के लिए, कुओं की तह तक विसर्जन मध्यम प्रसार के द्वारा निरंतर विसर्जन सुनिश्चित करने, और किसी भी हवा के बुलबुले के फँसाने से बचें।
    3. प्रेषित प्रकाश को सक्रिय करने और हर अच्छी तरह से देखने के एक प्रतिनिधि के क्षेत्र लगता है। एक सही ढंग से calibrated स्वत: मंच का उपयोग करें और सॉफ्टवेयर में स्थिति निशान।
    4. धुंधला के लिए थाली को हटाने के बाद, (धारा 4.3 देखें) थाली डालें और फोकल बहाव से बचने के लिए शीर्ष पर एक वजन जोड़ें। लेजर स्कैनिंग मोड के साथ बचाया पदों की समीक्षा करें और ठीक से ध्यान केंद्रित करने और पार्श्व स्थिति को समायोजित।
    5. 2 घंटा, 2 मिनट की अवधि का समय व्यतीत हो जाने के सेट और अधिग्रहण शुरू।
  2. छवि मात्रा का ठहराव (उदाहरण Bitplane softw के लिए दिया जाएगा) ऐसे Imaris के रूप में कर रहे हैं
    1. पिक्सेल matrices के अंकगणितीय गणना की अनुमति देता है कि सॉफ्टवेयर में डाटासेट आयात करें। खींचने और दाता और सॉफ्टवेयर आइकन पर स्वीकर्ता चैनल दोनों युक्त स्रोत फ़ाइल को छोड़ने के द्वारा यह मत करो।
    2. एक ही ऑफसेट का उपयोग करते हुए दोनों चैनलों में पृष्ठभूमि घटाना। ऐसा करने के लिए, मेनू क्लिक करें और फिर छवि क्लिक करें> प्रसंस्करण> आधारभूत घटाव। हर चैनल का चयन करें और आधारभूत मूल्य दर्ज करें।
    3. एक नया चैनल बनाने, पूर्व निर्धारित सुधार कारक एफ (1.1 देखें) के साथ स्वीकर्ता चैनल (CH2) में दाता चैनल (Ch1) के खून के माध्यम से सही:
      Ch2 '= Ch2 - Ch1 * च
      नोट: दाता चैनल में स्वीकर्ता के खून के माध्यम से शोर के स्तर पर पता लगाने योग्य नहीं था।
      1. मेनू> इमेज प्रोसेसिंग> चैनल arithmetics क्लिक करें और प्रवेश ABS (ch2- (Ch1 * 0.33))। बाद में मेनू> संपादित करें> चैनलों को नष्ट क्लिक करके चैनल 2 को हटा दें। सुनिश्चित करें किखून के माध्यम से सुधारा स्वीकर्ता चैनल के रूप में बनी हुई है नया चैनल 2. वैकल्पिक: मेनू> संपादित करें> छवि गुण के लिए जा रहा द्वारा मूल रंग ग्रे से चैनल रंग बदलें। चैनल 4> मैप रंग> आधार रंग का चयन करें और हरे रंग की है, उदाहरण के लिए इसे बदल।
    4. रिश्तेदार झल्लाहट गुणांक निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित आपरेशन के साथ एक नया चैनल बनाने:
      CH3 = Ch2 '/ (Ch1 + Ch2')
      1. मेनू> इमेज प्रोसेसिंग> चैनल arithmetics के पास जाओ और ./ (Ch1 + CH2) CH2 दर्ज
    5. एक 8 बिट छवि में झल्लाहट चैनल का उचित दृश्य के लिए, एक चौथा चैनल बनाने के लिए:
      Ch4 = 255 * CH3
      1. मेनू> इमेज प्रोसेसिंग> चैनल arithmetics के पास जाओ और 255 * CH3 दर्ज करें। मेनू> संपादित करें> छवि गुण के लिए जा रहा द्वारा चैनल रंग बदलें। चैनल 4> मैप रंग> रंग तालिका फ़ाइल> जेट का चयन करें।
    6. चैनलों CH3 और CH4 था के लिए एक 3x3 मंझला फिल्टर लागू करेंटी छवियों में शोर कम हो जाएगा। ऐसा करने के लिए, मेनू> इमेज प्रोसेसिंग> चौरसाई> मंझला फिल्टर करने के लिए क्लिक करें। दोनों चैनलों का चयन करें और एक फिल्टर का आकार "3x3x1" लागू होते हैं।
    7. सेलुलर संकेतों की मात्रा का ठहराव के लिए, ठीक से ऑफसेट की स्थापना करके Ch4 में कोशिकाओं का पता लगाने और भी छोटे संरचनाओं को बाहर करने के आकार से संरचनाओं फिल्टर।
      1. चयन देखें पार और आइकन "नए सतहों जोड़ें" पर क्लिक करें। भूतल विंडो में पता लगाने एल्गोरिथ्म मानकों को परिभाषित करें। तेजी से प्रसंस्करण के लिए, दो चेक बॉक्स "सेगमेंट केवल ब्याज की एक क्षेत्र" और "अंत में प्रक्रिया पूरी छवि" को सक्रिय करें। उसके आयामों का संपादन करके हित के क्षेत्र को परिभाषित करें।
      2. स्रोत चैनल के रूप में चैनल 4 का चयन करें और थ्रेशोल्डिंग> पृष्ठभूमि घटाव (स्थानीय कंट्रास्ट) द्वारा सीमा निर्धारित और 10 माइक्रोन व्यास की स्थापना की। अधिकतम intensi करने के लिए मैन्युअल 0 करने के लिए कम से कम तीव्रता दहलीज और अधिकतम सीमा निर्धारितTy। क्षेत्र द्वारा संरचनाओं फ़िल्टर और जैसे, 187 μm² के लिए न्यूनतम मूल्य निर्धारित किया है। सतह का पता लगाने खत्म करो।
    8. दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता (Ch1) और रिश्तेदार झल्लाहट गुणांक (CH3) और सेलुलर इकाई में उनके मानक विचलन के लिए मतलब मूल्यों निकालें। ऐसा करने के लिए, सतह गुण के लिए जाना। सतहों शैली / गुणवत्ता> सतह का चयन करके संरचनाओं की उपस्थिति बदलें। फिल्टर टैब पर क्लिक करके सभी संरचनाओं का चयन करें। चयन> एकजुट प्रक्रिया करने के लिए जा रहा द्वारा पता लगाया संरचनाओं को एकजुट। आँकड़े टैब में क्लिक करके एमएस एक्सेल में सतह के आँकड़े निर्यात> निर्यात सभी सांख्यिकी फाइल करने के लिए।
    9. समय के साथ इन मूल्यों प्लॉट। Translocated प्रेरक की राशि का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक उचित पैरामीटर के रूप में हर हालत के लिए दाता चैनल प्रतिदीप्ति वृद्धि की अधिकतम ढलान के 10 मिनट के अंतराल को पहचानें। मीटर = Δ दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता / Δ समय (न्यूनतम) के रूप में ढाल की गणना।

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Representative Results

मात्रात्मक लक्ष्य कोशिकाओं में प्रेरक translocation का विश्लेषण करने के लिए वर्णित विधि की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, विभिन्न translocation कैनेटीक्स के साथ दो यर्सीनिया उपभेदों का अध्ययन किया गया: वाई और उसके व्युत्पन्न वाशिंगटन 314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 को शरण देने वाशिंगटन-314) (डाह प्लाज्मिड pYVO8 22 को शरण देने serogroup O8,) enterocolitica जंगली प्रकार के तनाव वाशिंगटन 314। इससे पहले काम से पता चला कि वाई कार्यात्मक YopE प्रदर्शनी में काफी अधिक Yop translocation दर 10 की कमी enterocolitica म्यूटेंट। दोनों उपभेदों YopE और मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ (पीएमके बीएलए) 17 के एन टर्मिनल स्राव संकेत के मिश्रण के लिए वैक्टर एन्कोडिंग के साथ तब्दील हो गया। वाशिंगटन 314 अतिरिक्त एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए एक संबंधित YopE ovalbumin संलयन (पीएमके अंडाणु 17) के लिए एक वेक्टर एन्कोडिंग के साथ तब्दील हो गया था। 30, 60 और 90 मिनट के ऊष्मायन बार आगे method`s प्रभावी सीमा एक आकलन करने के लिए लागू किया गया हैमात्रा का ठहराव के लिए एन डी उपयुक्तता। दो अलग अलग readouts डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया: दाता प्रतिदीप्ति (Ch1) और रिश्तेदार झल्लाहट गुणांक (चित्रा 1 बी और 1 सी) (CH3 Ch2 '/ (Ch1 + Ch2') =)।

समय के साथ नकारात्मक नियंत्रण तनाव (Ch1) दाता चैनल तीव्रता के वाशिंगटन-314-पीएमके अंडाणु साजिश रचने के लिए भले की ऊष्मायन समय (चित्रा 1 बी) के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का कोई वृद्धि दर्शाता है। इसके विपरीत, वाशिंगटन-314-पीएमके bla संक्रमित कोशिकाओं में समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि के लक्ष्य सेल कोशिका द्रव्य में YopE बीटा-लैक्टामेज़ संलयन की उपस्थिति का संकेत का पता चला था। जैसी कि उम्मीद थी प्रतिदीप्ति तीव्रता का अधिकतम ढलान सकारात्मक संक्रमण (: 0.10 / मिनट, 60 मिनट के संक्रमण: 0.33 / मिनट, 90 मिनट संक्रमण: संक्रमण के 30 मिनट 0.76 / मिनट) की लंबाई के साथ जोड़ा जाता है यह दर्शाता है कि translocated बीटा के विभिन्न सांद्रता लैक्टामेज़ प्रतिष्ठित किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों वाशिंगटन-31 के अनुसार(: 1.28 / मिनट, 60 मिनट के संक्रमण: 1.53 / मिनट, 90 मिनट संक्रमण: 1.41 / मिनट के संक्रमण के 30 मिनट) 4ΔYopE-पीएमके bla संक्रमित कोशिकाओं को और अधिक तेजी से जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि दिखा रहे हैं। दिलचस्प है, 90 मिनट के लिए संक्रमण का विस्तार आगे के संक्रमण के 60 मिनट (चित्रा 1 बी) की तुलना में दाता प्रतिदीप्ति की वृद्धि में तेजी लाने नहीं था। यह निष्कर्ष संभवतः कारण प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का विघटन करने के लिए संक्रमण के 60 मिनट से परे कुशल translocation रोकना या प्रतिदीप्ति रंगों का नुकसान हो सकता है, जो या तो वाशिंगटन 314ΔYopE-पीएमके bla द्वारा लगाए गए प्रगतिशील साइटोटोक्सिक प्रभाव से समझाया जा सकता है। विश्लेषण के लिए रिश्तेदार झल्लाहट गुणांक (CH3) का उपयोग द्वारा प्रदान परिणाम अकेले दाता चैनल द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ अच्छे अनुसार कर रहे हैं। हालांकि, translocated बीटा-लैक्टामेज़ संलयन की बहुत बड़ी मात्रा का प्रतिनिधित्व करने के लिए कुछ शर्तों (वाशिंगटन 314ΔYopE-पीएमके bla, 60 और 90 मिनट के संक्रमण) में, जाहिर है CCF4 सब्सट्रेट में थाइमेजिंग शुरू किया जा सकता से पहले stantly संसाधित। इन शर्तों की अवस्था के प्रासंगिक भाग इस डेटा प्रतिनिधित्व (चित्रा 1 सी) में याद किया जाता है क्योंकि एक उचित अधिकतम नकारात्मक ढलान की गणना के लिए अनुमति नहीं होगी। रिश्तेदार झल्लाहट गुणांक चैनल की छवियाँ व्यक्तिगत कोशिकाओं (चित्रा -1) के बीच मतभेदों की तुलना करने की संभावना प्रदान करते हैं।

चित्र 1
वाई में मंदिर-1 YopE fusions के द्वारा प्रेरक स्थानान्तरण के चित्रा 1. मात्रात्मक विश्लेषण enterocolitica। Translocated मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ द्वारा CCF4 सब्सट्रेट (ए) हाइड्रोलिसिस लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी थी। बरकरार सब्सट्रेट की हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (530 एनएम) में और cleaved हाइड्रोलिसिस जनसंपर्क के नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (460 एनएम) में हुई एनएम 405 पर उत्तेजनाoduct (कूमेरिन)। (बी, सी) माइक्रोस्कोपी डेटा मात्रात्मक रिश्तेदार झल्लाहट गुणांकों के दाता चैनल तीव्रता (Ch1) या गणना और साजिश रचने (CH3 Ch2 '/ (Ch1 + Ch2' =)) साजिश रचने के द्वारा विश्लेषण किया गया। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। (डी) चित्रित micrographs (चैनल झल्लाहट) संकेत समय बिंदुओं पर प्रतिनिधि फिल्मों से ले जाया गया। वाशिंगटन 314ΔE-पीएमके bla संक्रमित कोशिकाओं जंगली प्रकार वाशिंगटन-314-पीएमके bla (60 मिनट संक्रमण) की तुलना में रिश्तेदार झल्लाहट गुणांकों के और अधिक तेजी से घट रहे हैं। स्केल बार, 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Fluorophores V450 और FITC चित्रा 2. पार बात दृढ़ संकल्प।दोनों अलग-अलग fluorophores के स्पेक्ट्रा confocal खुर्दबीन के साथ मापा गया। खून के माध्यम से दाता V450 के 525-535 एनएम डिटेक्टर सीमा के भीतर स्वीकर्ता चैनल में एक रेखीय प्रतिगमन (डालने) से गणना की गई। दो माप से गणना crosstalk का मतलब प्रतिशत 0.33 के बराबर होती है। खून के माध्यम से स्वीकर्ता FITC के दाता चैनल (455-465 एनएम) में शोर के स्तर पर पता लगाने योग्य नहीं था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम यहाँ सफलतापूर्वक वाई द्वारा प्रेरक स्थानान्तरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मंदिर -1 बीटा-लैक्टामेज़ संवाददाता आधारित परख लागू किया enterocolitica। इस संवेदनशील, विशिष्ट और अपेक्षाकृत सरल तकनीक के कई अलग अलग रूपों साहित्य में वर्णित किया गया है। इस अध्ययन में लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति संकेतों के सबसे संवेदनशील और सटीक पता लगाने के लिए आयोजित किया गया। विशेष रूप से दाता और स्वीकर्ता रंगों और व्यक्तिगत समायोज्य पता लगाने बैंडविड्थ के बीच परस्पर बात के लिए सुधार विधि के अन्य रूपों की तुलना में माप की बेहतर सटीकता के लिए अनुमति देते हैं। परिणाम स्पष्ट रूप से विधि मात्रात्मक translocation विश्लेषण करने में सक्षम है कि दिखा। इंट्रासेल्युलर बीटा-लैक्टामेज़ के विभिन्न सांद्रता का प्रतिनिधित्व विभिन्न ऊष्मायन बार सकारात्मक दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता के ढलान के साथ सहसंबद्ध थे। इसके अलावा वाशिंगटन 314ΔYopE का एक महत्वपूर्ण उच्च translocation दर की तुलनाजंगली प्रकार के तनाव के लिए वाशिंगटन 314 का प्रदर्शन किया जा सकता है।

डेटा विश्लेषण के लिए दो वैकल्पिक विकल्प लागू किया गया: दाता चैनल तीव्रता और रिश्तेदार झल्लाहट गुणांकों। दाता चैनल का उपयोग करने का लाभ यह है कि सीधे एक सीसीएफ -4 हाइड्रोलिसिस उत्पाद (कूमेरिन) के संचय का प्रतिनिधित्व करता है। / स्वीकर्ता आवश्यक दाता के अनुपात का उपयोग करके सेल घनत्व में अंतर के लिए एक थाली पाठक सुधार में अन्य की तुलना में नहीं है क्योंकि यह दृष्टिकोण, एक सूक्ष्म सेटअप में संभव है। हालांकि, CCF4 डाई या उसके हाइड्रोलिसिस उत्पादों के निर्यात को अभी भी इस दृष्टिकोण में एक संभव confounder है। इस नुकसान रिश्तेदार झल्लाहट गुणांक की गणना के द्वारा दूर किया जा सकता है।

वर्णित सेटअप प्रयोगों में 96 अच्छी तरह से प्लेट में आयोजित की गई। इस प्रारूप में एक ही प्रयोग में कई शर्तों के परीक्षण के लिए अनुमति देता है और महंगा रसायन (विशेष रूप से CCF4 / AM लोड हो रहा किट) को बचाने के लिए मदद करता है। वर्णित कार्यप्रवाह में आईएम शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण हैशीघ्र ही translocated बीटा-लैक्टामेज़ द्वारा CCF4 की हाइड्रोलिसिस क्योंकि CCF4 / AM लोड हो रहा समाधान के अलावा के बाद एक निर्धारित समय बिंदु पर उम्र अधिग्रहण तुरंत शुरू होता है। एक बार में कई शर्तों के प्रसंस्करण के मामले में, ध्यान और पार्श्व पदों (कदम 5.1.4) का समायोजन भी लंबे समय लेने और छवि के अधिग्रहण के लिए एक समय पर शुरू होने में बाधा हो सकती है। इसलिए, समानांतर नमूने की अधिकतम संख्या अलग-अलग निर्धारित किया जाना चाहिए।

इस पद्धति का उपयोग सामना करना मुख्य समस्याओं में से एक 37 डिग्री सेल्सियस पर हेला कोशिकाओं द्वारा CCF4 सब्सट्रेट का काफी निर्यात किया गया था। इस घटना पर्याप्त प्रोबेनेसिड साथ कोशिकाओं के इलाज से counteracted नहीं किया जा सका। हम पहले से वर्णित के रूप में इसलिए पहले पूरा संक्रमण के लिए चल रहे संक्रमण के दौरान बजाय निगरानी स्थानान्तरण के फैसला किया, और बाद में CCF4 / AM डाई के साथ कोशिकाओं लोड। इस दृष्टिकोण के साथ यह आरटी पर CCF4 सब्सट्रेट के प्रसंस्करण की निगरानी के लिए संभव था। इन शर्तों के तहत ReduCCF4 की CED निर्यात मनाया गया। CCF4 सब्सट्रेट के निर्यात की मात्रा को सेल लाइन विशिष्ट हो रहा है; यहाँ वर्णित सेटअप दृढ़ता से 37 डिग्री सेल्सियस पर CCF4 जो निर्यात सेल लाइनों में भी स्थानान्तरण के विश्वसनीय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

CCF4 का निर्यात वास्तविक समय में एक साथ संक्रमण और स्थानान्तरण की प्रक्रिया की निगरानी के लिए माइक्रोस्कोपी सेटअप को अपनाने के लिए अनुमति देने के लिए कुछ अन्य सेल लाइनों में एक समस्या नहीं है। इस व्यक्ति की कोशिकाओं में translocation का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करता है और बैक्टीरियल आसंजन या सूक्ष्म कालोनियों 20 के गठन की तरह मेजबान सेल बातचीत के विशिष्ट घटनाओं के साथ translocation सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, इस परख आगे translocation बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं की परस्पर क्रिया के दौरान नियंत्रित किया जाता है कैसे की तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB-Agar Roth X969.2
LB-Medium Roth X968.2
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8662-500ML
96-well plate (black, clear bottom) Greiner Bio One 655087
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco/Life Technologies 31966-047
Probenecid Sigma-Aldrich P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM Life Technologies K1095
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate Sigma-Aldrich L4895 Used for peak emission and cross-talk determination
V450 Rat anti-Mouse CD8a BD Bioscience 560469 Used for peak emission and cross-talk determination
Immersol W immersion oil  Zeiss 444969-0000-000 Refractive index = 1.3339 @ 23 °C
TCS SP5 II confocal laser scanning microscope Leica microsystems 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW
Imaris 7.6 software Bitplane Plugins included ImarisXT and MeasurementPro
MatLab compiler runtime MathWorks
Prism 5 GraphPad software

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References

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संक्रमण अंक 104 प्रकार III स्राव सिस्टम translocation यर्सीनिया enterocolitica बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक प्रोटीन Yersinia बाहरी प्रोटीन Yop YopE झल्लाहट
का विश्लेषण<em&gt; यर्सीनिया enterocolitica</emमेजबान कोशिकाओं में&gt; प्रेरक translocation बीटा-लैक्टामेज़ प्रेरक Fusions का उपयोग
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Wolters, M., Zobiak, B., Nauth, T.,… More

Wolters, M., Zobiak, B., Nauth, T., Aepfelbacher, M. Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions. J. Vis. Exp. (104), e53115, doi:10.3791/53115 (2015).

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