Abstract
Mange gram-negative bakterier, inkludert patogene Yersinia spp. Anvende type III sekresjons-systemer for å translocate effektor proteiner i eukaryote målceller. Inne i vertscellen effektorcellene proteinene manipulere cellefunksjoner til fordel for bakterier. For bedre å forstå kontroll av type III sekresjon i løpet av vertscelleinteraksjon, følsomme og nøyaktige analyser for å måle trans er nødvendig. Vi her beskriver anvendelsen av en analyse basert på fusjon av et Yersinia enterocolitica effektor proteinfragment (Yersinia ytre protein, YopE). Med TEM-1 beta-laktamase for kvantitativ analyse av trans Analysen baserer seg på spaltning av en celle permeant FRET fargestoff (CCF4 / AM) ved translokert beta-laktamase fusjon. Etter spalting av cefalosporin-kjernen CCF4 av beta-laktamase, FRET fra coumarin til fluorescein er forstyrret, og magnetisering av kumarin-delen fører til blå fluorescens emisjon.Ulike anvendelser av denne fremgangsmåte er blitt beskrevet i litteraturen fremheve dens allsidighet. Fremgangsmåten gjør det mulig for analyse av trans in vitro og også in in vivo, for eksempel i en musemodell. Påvisning av fluorescens-signaler kan utføres ved hjelp av platelesere, FACS-analyse eller fluorescens mikroskopi. I oppsettet er beskrevet her, in vitro translokasjon av effektor fusjoner i HeLa celler ved ulike Yersinia mutanter overvåkes av laser scanning mikroskopi. Opptak av intracellulær omdanning av FRET reporter av beta-laktamase effektor fusjon i sanntid gir robuste kvantitative resultater. Vi her viser eksemplarisk data, som viser økt translokasjon av en Y. enterocolitica YopE mutant, sammenlignet med villtypestammen.
Introduction
Type III sekresjons-systemer er spesialiserte protein-eksport maskiner benyttes av forskjellige slekter av gram-negative bakterier for direkte å levere bakterielt kodet effektor proteiner i eukaryote målceller. Mens utskillelsen maskiner selv er svært konservert, har spesialiserte sett av effektor proteiner utviklet seg mellom de ulike bakteriearter å manipulere cellulære signalveier og tilrettelegge spesifikke bakterie virulens strategier 1. Ved Yersinia, opp til syv effektor proteiner, såkalte Yops (Yersinia ytre proteiner), blir translokert over vertscellekontakt og virker sammen for å styrte immun celle responser som fagocytose og cytokin produksjon, dvs. å tillate ekstracellulære overlevelse av bakterier 2-4. Prosessen med å trans blir kontrollert på forskjellige stadier 5. Det er fastslått at primære aktivering av T3SS utløses ved sin kontakt til målet cell 6. Imidlertid er den nøyaktige mekanismen for denne initiering som ennå ikke er klarlagt. I Yersinia et annet nivå av såkalte finjustering av trans oppnås ved opp- eller ned-regulere aktiviteten av mobiltelefon Rho GTP-bindende proteiner Rac1 eller RhoA. Aktivering av Rac1 eksempel ved invasin eller cytotoksisk nekrotiserende faktor Y (CNF-Y) fører til økt trans 7-9, mens GAP (GTPase-aktiverende protein) funksjon translokert YopE nedregulerer Rac1 aktivitet og følgelig reduserer translokasjon av en negativ feedback-typen mekanisme 10,11.
Gyldige og presise metoder er en forutsetning for å undersøke hvordan translokasjon er regulert under Yersinia vertscelleinteraksjon. Mange forskjellige systemer har vært brukt for dette formål, hver med spesielle fordeler og ulemper. Noen metoder er avhengige av lysering av infiserte celler, men ikke bakterier av forskjellige vaskemidler, etterfulgt av western blot analyse. The felles ulempe ved disse metodene er at små, men uunngåelige bakteriell lysis potensielt forurenser cellelysatet med bakterie tilhørende effektor-proteiner. Imidlertid behandling av cellene med proteinase K for å degradere ekstracellulære effektor proteiner og påfølgende bruk av digitonin for selektiv lysis av cellen som ble foreslått for å redusere dette problemet 12. Viktigere, disse analysene avgjørende avhenge av høy kvalitet anti-effektor antistoffer, som stort sett ikke er kommersielt tilgjengelig. Forsøk på å bruke translasjonelle fusjoner av effektor-proteiner og fluorescerende proteiner som GFP å overvåke trans var ikke vellykket, sannsynligvis på grunn av det kuleformede tertiære strukturen til de fluorescerende proteiner og manglende evne til sekresjon apparat for å brette dem før sekresjon 13. Men flere forskjellige reporter tags som cya (kalmodulin avhengig adenylatsyklase) domenet av Bordetella pertussis toksin cyclolysin 14 eller Flashtag ble med hell anvendt for å analysere translokasjon. I det førstnevnte assay den enzymatiske aktiviteten til cya blir brukt til å forsterke signalet fra den intracellulære fusjonsproteinet, mens Flash-koden, en meget kort tetracysteine (4Cys) motivet tag, gjør det mulig for merking med biarsenical fargestoff Flash uten å forstyrre prosessen med sekresjon 15.
Tilnærmingen anvendt her ble rapportert for første gang av Charpentier et al., Og er basert på den intracellulære omdannelsen av Förster resonans energioverføring (FRET) fargestoff CCF4 av translokerte effektor TEM-1 beta-laktamase-fusjoner 16 (figur 1A). CCF4 / AM er en celle-permeant forbindelse hvori en kumarin derivat (donor) og en fluorescein-del (akseptor) er forbundet med en cefalosporin-kjernen. Ved passiv inntreden i eukaryote cellen, er den ikke-fluorescerende forestret CCF4 / AM forbindelse behandles av cellulære esteraser til ladet og fluorescerende CCF4 og dermed fangeti cellen. Eksitasjon av kumarin-delen ved 405 nm resulterer i FRET til fluorescein del, som avgir et signal grønn fluorescens ved 530 nm. Etter spaltning av cefalosporin-kjernen ved hjelp av beta-laktamase FRET er forstyrret, og magnetisering av kumarin-delen fører til blå fluorescens emisjon at460 nm. Ulike anvendelser av denne fremgangsmåte er blitt beskrevet i litteraturen fremheve dens allsidighet. Fremgangsmåten gjør det mulig for analyse av trans in vitro og også in in vivo, for eksempel, ble den teknikk som brukes i et museinfeksjonsmodell for å identifisere de leukocyttpopulasjoner målrettet for trans in vivo 17-19. Utlesning av signaler kan utføres ved å bruke platelesere, FACS-analyse eller fluorescens mikroskopi. Av notatet, gir metoden også muligheten til å overvåke translokasjon i sanntid av levende celle mikros under infeksjonen prosessen 20,21. Her laser scanning fluorescens mikroskopi ble søkt om readout av fluorescens-signaler som det gir høy følsomhet og nøyaktighet. Spesielt, evnen til å justere utslipps vindu med nanometerpresisjon i kombinasjon med høy følsomme detektorer muliggjør optimalisert fluorescensdeteksjon og minimeres krysstale. I tillegg denne mikros oppsettet kan tilpasses for sanntids overvåking av translokasjon og potensielt tillater for simultan analyse av vert-patogen interaksjoner på cellenivå.
I denne studien trans priser av en Y. enterocolitica vill type belastning og en YopE sletting mutant stille en hypertranslocator fenotype 10,11 ble exemplarily analysert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peak Emission og Cross-talk Bestemmelse (se også figur 2)
- For å bestemme utslipps topper og mengde av krysstale mellom donor (kumarin derivat V450) og akseptor (fluorescein) fargestoffer, spektrale utføre skanninger av celler merket med både enkelt fluoroforer ved 405 nm eksitasjon.
- Bestemme en 10 nm båndbredde innenfor toppen av hver farge som skal brukes til donor og akseptor-kanaler (her 455-465 nm og 525-535 nm). Plott den normaliserte intensiteten over bølgelengde og beregne den gjennomsnittlige prosentandelen av krysstale i donor fargestoff i akseptor-kanalen og vice versa (figur 2).
2. Fremstilling av Y. enterocolitica Stammer for Cell Culture Infeksjon
- Bruk følgende stammer: WA-314 PMK-ova (WA-314 transformert med plasmidene PMK-BLÅ 17 og PMK-ova 17, henholdsvis) og WA-314ΔYopE PMK-bla (van-314ΔYopE transformert med plasmidet PMK-bla 17)
- Minst to dager før infeksjon strek Y. enterocolitica stammer WA-314 PMK-egg, WA-314 PMK-bla og WA-314ΔE PMK-bla fra Cryo aksjer på LB-agar plater som inneholder de nødvendige antibiotika (kanamycin for WA-314 PMK-bla og WA-314 PMK-egg ; kanamycin og tetracyklin for WA-314ΔE PMK-bla) og vokse O / N ved 27 ° C. Etterpå holde platene i opptil én uke ved 4 ° C.
- En dag før infeksjon inokulere 3 ml LB-medium inneholdende de ønskede antibiotika med en koloni av de respektive stammer og inkuberes O / N ved 27 ° C i en rister ved 180 rpm.
- På dagen for infeksjonen inokulere 2 ml av O / N kultur i 40 ml frisk LB-medium uten antibiotika og inkuberes i 90 min ved 37 ° C i en rystemaskin ved 180 opm for å indusere ekspresjon av type III sekresjon system.
- Overfør kulturene i en passende rør og holde kulturen på is eller ved 4 ° Cfra nå av. Sentrifuger kulturer i 10 minutter ved 5000 xg og 4 ° C.
- Resuspender bakteriepelleten i 2-3 ml iskald PBS. Fortynn bakteriesuspensjonen til en konsentrasjon på 8 x 8 10 cfu / ml ved å bruke et spektrofotometer. Bestem tilsvarende optisk tetthet individuelt. Hold denne suspensjonen på is inntil infiserer de HeLa celler.
3. Plating HeLa celler
- En dag før infeksjon frø 1,5 x 10 4 celler HeLa-celler i 200 ul DMEM inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS) i brønner i en 96-brønners plate og dyrke i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Seed tre brønner for hver stamme (tre forskjellige inkubasjonstider).
4. Infeksjon i HeLa celler og Loading med CCF4
- Infisere HeLa-celler ved tilsetning av 3,5 pl av bakteriesuspensjonen til mediet og bland ved forsiktig pipettering medium to ganger. Tillate bakterier å sedimentere påtil cellene ved en MOI (gruppe for infeksjon) på ca 100 bakterier pr celle. For et tidsforløp starter infeksjoner ved -90 min, -60 og -30 min min og inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator før 0 min for å oppnå en felles endepunkt.
- Når inkuberingen er fullført, forsiktig suge mediet uten å fjerne HeLa-celler og tilsett 50 ul PBS inneholdende 20 ug / ml kloramfenikol til å stoppe ekspresjon av effektorer og 2,5 mM probenecid for å redusere eksport av CCF4.
- På dette punktet overføre 96-brønns plate i objektbordet og definere egnede plasser for senere analyse i hver brønn. Fullfør dette trinnet innen 10 min (for detaljer om oppkjøpet se punkt 5.1).
- Per godt, tilsett 70 mL av CCF4 / AM lasteløsning (0,24 mL løsning A, 1,2 mL løsning B, 18,56 mL løsning C (løsning A, B og C gis innenfor CCF4 / AM lasting kit) og 50 ul PBS (som inneholder 20 ug / ml kloramfenikol og 2,5 mM probenecid) ved hjelp av en multi pipette og inkuberes i 5 minutter ved RT. Fra nå av arbeid uten avbrudd.
- Aspirer lasting løsningen og tilsett 100 ul PBS inneholdende 20 ug / ml kloramfenikol og 2,5 mM probenecid ved hjelp av en multi pipette. Deretter hurtig overføre 96-brønners plate i objektbordet og begynne anskaffelse innen 10 min fra aspirasjon av laste løsningen.
5. Laser Scanning mikroskopi og analyse av data
- Image oppkjøpet
- Angi bildeforhold på en måte å maksimere den totale fotontelling og minimere fototoksisitet, fotobleking og cross-eksitasjon.
- I et moderne konfokal laser scanning mikroskop, bruk en 20X høy numerisk apertur nedsenking objektiv, åpne detektoren pinhole til 2,5 Airy enheter (dvs. optisk vidvinkelsnitt), velger høy følsomhet Gaasp Søkere med samtidig aktive donor og akseptor kanaler, 8 bitdybde , ~ 750 nm pikselstørrelse, 3-fold rammen midling og Excite med 10% av en 405 nm laser diode.
- For å sikre korrekt kvantifisering sette detektoren gevinst på begge kanaler til samme verdi og for å unngå eventuelle mettede piksler.
Merk: Her gevinster ble satt til 150%.
- Sørge for kontinuerlig nedsenking ved å spre nedsenking medium til bunnen av brønnene, for eksempel med en 1 ml sprøyte, og unngå oppfanging av eventuelle luftbobler.
- Aktiver overført lys og finne en representant synsfelt i hvert godt. Bruk en korrekt kalibrert automatisk scenen og merk posisjonen i programvaren.
- Etter fjerning av platen for farging (se avsnitt 4.3), sett inn plate og legge til en vekt på toppen for å unngå fokus drift. Gjennomgå de lagrede stillinger med laser scanning modus og justere fokus og sideleie riktig.
- Still tid forfalle til 2 min, varigheten til 2 timer og begynne oppkjøpet.
- Angi bildeforhold på en måte å maksimere den totale fotontelling og minimere fototoksisitet, fotobleking og cross-eksitasjon.
- Bilde kvantifisering (eksempler vil bli gitt for bitplan Programva reinstallaer slik som Imaris)
- Importere datasett inn i programvare som lar aritmetiske beregninger av piksel matriser. Gjør dette ved å dra og slippe kildefilen inneholder både donor og akseptor kanal på programvareikonet.
- Trekk fra bakgrunnen i begge kanaler ved hjelp av samme offset. For å gjøre dette, klikker du på Meny og deretter klikker du Bilde> Processing> Baseline subtraksjon. Velg hver kanal og angi basisverdien.
- Korriger blø gjennomgang av donor kanal (Ch1) i akseptor kanal (CH2) med forhåndsbestemt korreksjonsfaktor f (se 1.1), og skaper en ny kanal:
CH2 '= CH2 - Ch1 * f
MERK: En lufte gjennomgang av akseptor inn i kanalen donor var ikke detekterbart i løpet av nivået av støy.- Klikk på Meny> Bildebehandling> Kanal aritmetikk og skriv abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Etterpå slette Channel 2 ved å klikke på Meny> Rediger> Slett kanaler. Forsikre deg om atblø gjennom korrigert akseptor kanalen forblir som den nye Kanal 2. Valgfritt: Endre kanal farge fra grå til den opprinnelige fargen ved å gå til Meny> Rediger> Bildeegenskaper. Velg Channel 4> Kartlagt Color> Base Farge og endre det til f.eks, grønn.
- Opprett en ny kanal med følgende operasjon for å bestemme den relative FRET koeffisient:
Ch3 = CH 2 '/ (Ch1 + CH2')- Gå til Meny> Bildebehandling> Kanal aritmetikk og skriv CH2 ./ (ch1 + CH2)
- For riktig visualisering av FRET kanal i en 8 bits bilde, lage en fjerde kanal:
CH4 = 255 * Ch3- Gå til Meny> Bildebehandling> Kanal aritmetikk og skriv 255 * ch3. Skift kanal farge ved å gå til Meny> Rediger> Bildeegenskaper. Velg Channel 4> Kartlagt Farge> Fargetabell Fil> Jet.
- Påfør en 3x3 median filter til kanaler Ch3 og CH4 that vil redusere støy i bildene. For å gjøre dette, klikk på Meny> Bildebehandling> Utjevning> Median Filter. Velg begge kanaler og bruke et filter size "3x3x1".
- For kvantifisering av cellulære signaler, oppdage cellene i Ch4 ved riktig innstilling av offset og filtrere strukturer etter størrelse å utelukke altfor små strukturer.
- Velg overgå visning, og klikk på ikonet "Legg til nye overflater". Definere algoritme parametre i Surface vinduet. For raskere behandling, aktivere to boksene "Segment bare et område av interesse" og "Prosess hele bildet til slutt". Definere regionen av interesse ved å endre dens dimensjoner.
- Velg Channel 4 som kilde kanal og sette terskelen ved Terskelverdier> Bakgrunn subtraksjon (Local Contrast) og sette diameter på 10 mikrometer. Angi minimumsintensitetsterskel manuelt til 0 og den maksimale terskelen til det maksimale intensity. Filtrere strukturer etter område og sette minimumsverdien til f.eks 187 μm². Fullfør deteksjon overflaten.
- Pakk gjennomsnittsverdiene for donor fluorescens intensitet (Ch1) og relativ FRET koeffisient (CH3) og deres standardavvik i den cellulære enhet. For å gjøre dette, gå til overflaten egenskaper. Endre utseendet på de strukturene ved å velge Overflater Style / Kvalitet> Surface. Velg alle strukturer ved å klikke på fanen filtre. Forene de oppdagede strukturene ved å gå til prosess Utvalg> Foren. Eksportere overflate statistikk til MS Excel ved å klikke på fanen statistikk> Export all statistikk til fil.
- Plotte disse verdiene over tid. Identifiser 10 min intervall på maksimalt fall på donor kanalfluorescens økning for hver tilstand som en rimelig parameter for å representere mengden av translocated effektor. Beregn skråningen som m = Δ donor fluorescens intensitet / Δ (min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere evnen til den beskrevne fremgangsmåten for å kvantitativt analysere effektor translokasjon inn i målceller, ble to Yersinia-stammer med forskjellig kinetikk trans studert: Y. enterocolitica villtypestammen WA-314 (serogruppe O8, husing virulensplasmid pYVO8 22) og dens deriverte WA-314ΔYopE (WA-314 husing pYVO8ΔYopE 23). Tidligere arbeidet viste at Y. enterocolitica mutanter mangler funksjonell YopE utstillings en betydelig høyere Yop trans hastighet 10. Begge stammer ble transformert med vektorer som koder for fusjoner av den N-terminale sekresjonssignal av YopE og TEM-1-beta-laktamase (PMK-bla) 17. WA-314 ble også transformert med en vektor som koder for en respektiv YopE ovalbumin fusion (PMK-ova 17) for å tjene som en negativ kontroll. Inkubasjonstider på 30, 60 og 90 min ble anvendt for å vurdere den method`s effektive område en ytterligerend egnethet for kvantifisering. To forskjellige avlesninger ble anvendt for dataanalyser: donor fluorescens (Ch1) og relative FRET koeffisienter (CH3 = CH 2 '/ (Ch1 + CH2')) (figur 1B og 1C).
For den negative kontrollstammen WA-314-PMK-ova plotting av donor kanal intensiteter (Ch1) over tid viser ingen økning i fluorescensemisjon uavhengig av inkubasjonstiden (figur 1B). I motsetning til dette, i WA-314-PMK-bla-infiserte celler er en økning av fluorescens intensitet over tid ble påvist som indikerer tilstedeværelse av YopE beta-laktamase-fusjons i målcellen cytoplasma. Som forventet maksimal helling av fluorescensintensitet er positivt korrelert med lengden av infeksjon (30 min infeksjon: 0,10 / min, 60 min infeksjon: 0,33 / min, 90 min infeksjon: 0,76 / min) som indikerer at forskjellige konsentrasjoner av translokert beta- laktamase kan skilles. I samsvar med tidligere undersøkelser WA-314ΔYopE-PMK bla-infiserte celler oppviser raskere økning av fluorescens intensitet sammenlignet med villtypestammen (30 min infeksjon: 1,28 / min, 60 min infeksjon: 1,53 / min, 90 min infeksjon: 1,41 / min). Interessant, utvide smitte til 90 min ikke ytterligere akselerere økningen av donor fluorescens i forhold til 60 min for infeksjon (figur 1B). Dette funn kan antagelig forklares ved den progressive cytotoksisk effekt som utøves av WA-314ΔYopE-PMK-bla, som kan enten hemme effektiv translokasjon utover 60 min for infeksjon eller føre til tap av fluorescens fargestoffer på grunn av forstyrrelser av plasmamembranintegritet. Resultatene gitt ved hjelp av den relative FRET koeffisient (CH 3) for analyse er i god overensstemmelse med de resultater som oppnås ved den donor-kanalen alene. Men i enkelte forhold (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 og 90 min infeksjon) som representerer svært store mengder translokert beta-laktamase fusion, åpenbart CCF4 underlaget var istadighet behandlet før bildebehandling kan startes. Disse betingelser ville ikke tillate beregning av en rimelig maksimal negativ helling fordi den relevante del av kurven er savnet i denne datarepresentasjon (figur 1C). Bilder av den relative FRET koeffisienten kanal gir mulighet for å sammenligne forskjeller mellom individuelle celler (Figur 1D).
Figur 1. Kvantitativ analyse av effektoren translokasjon av TEM-1 YopE fusjoner i Y. enterocolitica. (A) Hydrolyse av CCF4 substrat ved translokert TEM-1 beta-laktamase ble overvåket ved laser scanning mikroskop. Eksitasjon ved 405 nm resulterte i grønn fluorescens emisjon (530 nm) av det intakte substrat og blå fluorescens-emisjon (460 nm) av det spaltede hydrolyse product (kumarin). (B, C) Mikros data ble analysert kvantitativt ved å plotte donor kanal intensitet (Ch1) eller beregning og plotting av de relative FRET koeffisientene (CH3 = CH 2 '/ (Ch1 + CH2')). Data er representative for tre uavhengige eksperimenter. (D) avbildet mikrografer (FRET kanal) ble tatt fra representative filmer på angitte tidspunkter. WA-314ΔE-PMK-bla infiserte celler vise mer rask reduksjon av de relative FRET koeffisientene sammenlignet med villtype WA-314-PMK-bla (60 min infeksjon). Scale bar, 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Cross-talk fastsettelse av fluorophores V450 og FITC.Spektrene til både individuelle fluoroforer ble målt med konfokalt mikroskop. Blø gjennomgang av donor V450 inn akseptor kanalen innenfor 525-535 nm detektoren utvalg ble beregnet ut fra en lineær regresjon (innsats). Midlere andel av crosstalk beregnet ut fra to målingene tilsvarer 0,33. Blø gjennomgang av akseptor FITC inn i donor-kanal (455-465 nm) var ikke påviselig over støynivået. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi her vellykket anvendt et TEM-1 beta-laktamase reporter basert assay for kvantitativ analyse av effektoren translokasjon av Y. enterocolitica. Mange forskjellige varianter av denne sensitive, spesifikke og relativt enkel teknikk som er blitt beskrevet i litteraturen. I denne studien laser scanning mikroskopi ble utført for mest følsom og nøyaktig påvisning av fluorescens-signaler. Spesielt korreksjon for krysstale mellom donor og akseptor fargestoffer og de individuelt justerbare deteksjonsbåndbredder tillate overlegen målenøyaktigheten i forhold til andre varianter av fremgangsmåten. Resultatene viser klart at fremgangsmåten er i stand til kvantitativt å analysere translokasjon. Forskjellige inkubasjonstider som representerer forskjellige konsentrasjoner av intracellulær beta-laktamase ble positivt korrelert med helningen av donor fluorescensintensitet. Også en betydelig høyere trans rate av WA-314ΔYopE forholdtil villtypestammen WA-314 kunne bli demonstrert.
To alternative muligheter for dataanalyse ble benyttet: Donor kanal intensiteter og relative FRET koeffisienter. Fordelen med å bruke donor kanalen er at det representerer oppbygging av et CCF-4 hydrolyseprodukt (kumarin) direkte. Denne tilnærmingen er mulig i en mikroskopisk oppsett, fordi annet enn i et plateleser korreksjon for forskjeller i celletetthet ved å bruke et forhold mellom donor / akseptor er ikke nødvendig. Imidlertid er eksport av CCF4 fargestoff eller dets hydrolyseprodukter fortsatt mulige feilkilden i denne tilnærmingen. Denne ulempen kan overvinnes ved å beregne den relative FRET koeffisient.
I de beskrevne installasjons eksperimenter ble utført i 96-brønners plater. Dette formatet tillater testing av flere forhold i et enkelt eksperiment og bidrar til å spare dyre kjemikalier (spesielt CCF4 / AM lasting kit). I den beskrevne arbeidsflyten er det avgjørende å starte imalder anskaffelse på et definert tidspunkt kort tid etter tilsetning av CCF4 / AM lasting løsning, fordi hydrolyse av CCF4 ved translokert beta-laktamase starter umiddelbart. Ved behandling av mange forhold på en gang, kan justering av fokus og lateral stillinger (trinn 5.1.4) tar for lang tid og hemme en betimelig start av bildet oppkjøpet. Derfor må det maksimale antall parallelle prøver som skal bestemmes individuelt.
En av de viktigste problemer som oppstår ved bruk av denne metoden var betydelig eksport av CCF4 substrat av HeLa-celler ved 37 ° C. Dette fenomenet kan ikke i tilstrekkelig grad kan motvirkes ved å behandle cellene med probenecid. Vi har derfor bestemt, i stedet for overvåkning translokasjon i løpet av den pågående infeksjon slik som beskrevet tidligere, for å først fullføre infeksjonen og etterpå laste cellene med CCF4 / AM fargestoff. Med denne fremgangsmåten var det mulig å overvåke behandlingen av CCF4 substratet ved RT. Under disse forholdene reduced eksport av CCF4 ble observert. Mengden av eksport av CCF4 substratet synes å være spesifikk cellelinje; oppsettet som er beskrevet her gjør det mulig for pålitelig analyse av trans også i cellelinjer, som sterkt eksporterer CCF4 ved 37 ° C.
Eksport av CCF4 er ikke et problem i enkelte andre cellelinjer tillater å vedta mikros oppsett for å overvåke prosessene for infeksjon og trans samtidig i sanntid. Dette gir mulighet til å analysere translokasjon inn i individuelle celler, og kan brukes til å korrelere translokasjon til bestemte hendelser fra vertscelleinteraksjon som bakteriell adhesjon eller dannelse av mikrokolonier 20. Derfor er denne analysen et verdifullt verktøy for ytterligere å belyse de mekanismene for hvordan trans reguleres ved samspillet mellom bakterier og vertsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
