Abstract
Многие грамотрицательные бактерии, включая патогенную Yersinia SPP. Использовать тип III секреции систем транслоцироваться эффекторные белки в эукариотических клетках-мишенях. Внутри клетки-хозяина эффекторных белков в клеточных функций манипулирования в интересах бактерий. Чтобы лучше понять, контроль типа секреции III во время взаимодействия клетки-хозяина, чувствительный и точный анализов для измерения транслокации требуется. Мы здесь описывать применение в анализе на основе слияния фрагмента эффектор белка Yersinia энтероколитные (Yersinia белка наружной; YopE). ПЭМ-1 бета-лактамазы для количественного анализа транслокации Анализ опирается на расщеплении клетки проникающего FRET краситель (CCF4 / AM) по транслоцируется бета-лактамаз слияния. После расщепления ядра цефалоспоринов CCF4 по бета-лактамазы, FRET из кумарина с флуоресцеином нарушается и возбуждение кумарина фрагмента приводит к синей флуоресценции.Различные приложения этого метода были описаны в литературе подсветки его универсальность. Способ позволяет проводить анализ транслокации в пробирке, а также в в естественных условиях, например, в мышиной модели. Обнаружение сигналов флуоресценции можно проводить с использованием пластин читателей, анализ FACS или флуоресцентной микроскопии. В установке, описанной здесь, в пробирке транслокации эффекторных слитых клеток HeLa в различных мутантов по Yersinia контролируется лазерной сканирующей микроскопии. Запись внутриклеточного преобразования лада репортера по бета-лактамаз эффекторной слияния в режиме реального времени обеспечивает надежную количественные результаты. Мы здесь, показывают примерные данные, демонстрируя повышенную перемещение по Y. энтероколитные YopE мутант по сравнению с штаммом дикого типа.
Introduction
Типа III секреции системы специализированные белок-экспорт машины, используемые различным родам грамотрицательных бактерий непосредственно доставить бактериально закодированные эффекторные белки в эукариотические клетки-мишени. Хотя сам секреции техника высоко консервативен, специализированные наборы эффекторных белков развивались среди различных видов бактерий, чтобы манипулировать клеточные сигнальные пути и облегчают определенные бактериальные стратегии вирулентности 1. В случае Yersinia, до семи эффекторных белков, так называемых Yops (Yersinia внешние белки), которые перемещаются по клетки-хозяина контакта и действовать вместе, чтобы разрушить ответов иммунных клеток, таких как фагоцитоз и продукции цитокинов, т.е. разрешить внеклеточный выживаемость бактерий 2-4. Процесс транслокации строго контролируется на разных этапах 5. Установлено, что основным активации T3SS инициируется ее контакта с целевой CELL 6. Однако точный механизм этого возбуждения еще не выяснены. В Yersinia второй уровень так называемого тонкой настройки транслокации достигается вверх или вниз регулирующие деятельность клеточных Ро ГТФ-связывающих белков Rac1 или RHOA. Активация Rac1 например invasin или цитотоксический некротизирующий фактор (CNF Y-Y) приводит к увеличению транслокации 7-9, в то время GAP (ГТФ активации белка) функцию транслоцируется YopE вниз регулирует Rac1 деятельность и, соответственно, уменьшается перемещение отрицательной обратной связи типа механизма 10,11.
Допустимые и точные методы являются необходимым условием для расследования, как перемещение регулируется во Yersinia взаимодействия клетки-хозяина. Много различных систем были использованы для этой цели, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Некоторые подходы опираются на лизис инфицированных клеток, но не бактерий различными детергентами с последующим вестерн-блоттинга. Чте Общим недостатком этих методов является то, что незначительные, но неизбежно лизису бактерий потенциально загрязняет клеточного лизата с бактериями-связанные эффекторных белков. Однако обработка клеток протеиназой К деградировать внеклеточных белков эффекторные и последующего использования дигитонина селективного лизиса эукариотических клеток были предложены для минимизации этой проблемы 12. Важно отметить, что эти анализы в решающей зависит от высокого качества анти-эффекторных антител, которые в основном не в продаже. Попытки использовать поступательные слитые белки эффекторных и флуоресцентные белки, как GFP контролировать перемещение не увенчались успехом вероятно, связано с шаровидным третичной структуры флуоресцентных белков и неспособности секреции аппарата разворачиваться их перед секрецией 13. Тем не менее, несколько различных репортер теги, как СуА (кальмодулинзависимой аденилатциклазу) домен токсина Bordetella коклюша cyclolysin 14 или флэшТег были успешно использованы для анализа транслокации. В первом тесте ферментативная активность СуА используется для усиления сигнала внутриклеточного слитого белка, в то время как флэш-тега, очень короткий tetracysteine (4Cys) мотив тег, позволяет маркировки со вспышкой biarsenical красителя, не нарушая процесс секреции 15.
Подход применяется здесь сообщалось, впервые с Charpentier др., И основана на внутриклеточного превращения красителя CCF4 Фёрстера резонансной энергии передачи (FRET) по перемещаются эффектор ТЕМ-1 бета-лактамазы слитых 16 (фиг.1А). CCF4 / АМ представляет собой клетку проникающий соединение, в котором производное кумарина (донор) и флуоресцеин фрагмент (акцептор) связаны сердечника цефалоспоринов. При пассивном вступления в эукариотической клетке, не-флуоресцентного этерифицированный CCF4 / АМ соединение обрабатывается сотовой эстераз в заряженном и флуоресцентного CCF4 и тем самым в ловушкев клетке. Возбуждение кумаринового фрагмента при 405 нм приводит к FRET флуоресцеина фрагмента, который испускает зеленую сигнала флуоресценции при 530 нм. После расщепления ядра цефалоспоринов по бета-лактамаз FRET нарушается и возбуждение кумарина фрагмента приводит к синей флуоресценции at460 нм. Различные приложения этого метода были описаны в литературе подсветки его универсальность. Способ позволяет проводить анализ транслокации в пробирке, а также в в естественных условиях, например, метод был использован в качестве модели инфекции мыши, чтобы определить популяции лейкоцитов, предназначенные для транслокации в естественных 17-19. Считывание сигналов может быть проведено с использованием пластин читателей, анализ FACS или флуоресцентной микроскопии. Следует отметить, что метод также дает возможность контролировать перемещение в в режиме реального времени по живых клеток микроскопии в течение инфекционного процесса 20,21. Вот флуоресценции лазерной сканирующей микроскопии был применен для readouт флуоресцентных сигналов, поскольку она обеспечивает высокую чувствительность и точность. В частности, способность регулировать окно излучения с нанометровым точностью в сочетании с высокой чувствительных детекторов облегчает оптимизированный обнаружение флуоресценции и свернутое перекрестных помех. Кроме того, это настройка микроскопии могут быть адаптированы для мониторинга в режиме реального времени транслокации и потенциально позволяет для одновременного анализа хозяин-патоген взаимодействия на клеточном уровне.
В этом исследовании ставок транслокации У. энтероколитные штамм дикого типа и мутанта YopE удаление демонстрируя hypertranslocator фенотип 10,11 были образцово проанализированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Пик выбросов и определение кросс-разговоры (смотри также рисунок 2)
- Для того чтобы определить пики выбросов и количество перекрестных помех между донором (кумарин производное V450) и акцептор (флуоресцеин) красителей, выполнять спектральные сканы клеток, меченных как отдельных флуорофоров при возбуждении 405 нм.
- Определить пропускную способность 10 нм в пределах пика каждого красителя, который будет использоваться для донорных и акцепторных каналов (здесь 455-465 нм и 525-535 нм). Участок нормированной интенсивности на длине волны и вычислить средний процент перекрестного разговора доноров красителя в канал акцепторной и наоборот (рис 2).
2. Подготовка Y. энтероколитные Штаммы для клеточных культур инфекции
- Используйте следующие штаммы: WA-314 ПМК-ова (WA-314 трансформировали плазмидами ПМК-бла 17 и ПМК-OVA 17, соответственно) и WA-314ΔYopE ПМК-бла (wa-314ΔYopE трансформировали плазмидой ПМК-бла 17)
- По крайней мере, за два дня до инфекции полоса Y. энтероколитные штаммы WA-314 ПМК-ова, WA-314 ПМК-бла и WA-314ΔE ПМК-бла от крио акции на LB-агаром, содержащих необходимые антибиотики (канамицин для WA-314 ПМК-бла и WA-314 ПМК-ова ; канамицина и тетрациклина для WA-314ΔE ПМК-бла) и расти O / N на 27 ° C. Впоследствии держать пластины до одной недели при 4 ° С.
- За один день до инокуляции инфекции 3 мл LB-среды, содержащей необходимые антибиотики с одной колонии соответствующих штаммов и инкубируют O / N при 27 ° С в шейкере при 180 оборотах в минуту.
- В день инфицирования прививку 2 мл o / n культуры в 40 мл свежей LB-среде без антибиотиков и инкубируют в течение 90 мин при 37 ° С в шейкере при 180 оборотах в минуту для индукции экспрессии секреции системы типа III.
- Передача культуры в подходящую пробирку и хранить культур на льду или при 4 ° Свпредь. Центрифуга культур в течение 10 мин при 5000 х г и 4 ° С.
- Ресуспендируют бактериальных гранул в 2-3 мл охлажденной льдом PBS. Развести бактериальной суспензии до концентрации 8 х 10 8 КОЕ / мл при использовании спектрофотометра. Определите соответствующий оптической плотности индивидуально. Держите эту подвеску на льду до заражения клеток HeLa в.
3. Покрытие HeLa Клетки
- За один день до инфицирования семян 1,5 х 10 4 клеток HeLa клетки в 200 мкл DMEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS) в лунки 96-луночного планшета и культивировать в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С. Семенной три скважины для каждого штамма (три разных времени инкубации).
4. Заражение клеток HeLa и загрузка с CCF4
- Infect клетки HeLa путем добавления 3,5 мкл бактериальной суспензии на носителе и соединение, осторожно пипеткой среду дважды. Разрешить бактерии оседают наК клеткам в множественности заражения (фрагмента) инфекции около 100 бактерий на клетку. В течение некоторого времени, конечно начать инфекции при -90 мин, -60 мин и -30 мин и не инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе до 0 мин для достижения общей конечной точки.
- При инкубации завершена, тщательно аспирации среды без удаления клеток HeLa и добавить 50 мкл PBS, содержащей 20 мкг / мл хлорамфеникола, чтобы остановить экспрессию эффекторов и 2,5 мМ пробенецида, чтобы уменьшить экспорт CCF4.
- В этот момент передача 96-луночный планшет в столике микроскопа и определяют соответствующие места для последующего анализа в каждую лунку. Закончите этот шаг в 10 мин (подробности приобретения раздел 5.1).
- На лунку, добавить 70 мкл CCF4 / АМ загрузки раствора (0,24 мкл раствора А, 1,2 мкл раствора Б, 18.56 мкл раствора С (раствор А, В и С при условии, внутри CCF4 / АМ загрузки набора) и 50 мкл PBS (содержащий от 20 мкг / мл хлорамфеникола, и 2,5 мМ пробенецида) с использованием мульти рipette и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Отныне работы без перерывов.
- Аспирируйте загрузки раствора и добавить 100 мкл PBS, содержащего 20 мкг / мл хлорамфеникола и 2,5 мм с использованием пробенецид мульти пипетки. Затем быстро передавать пластину 96 также в стадии микроскопа и начать приобретение течение 10 мин аспирации загрузочного раствора.
5. лазерной сканирующей микроскопии и анализа данных
- Получение изображений
- Установите условия визуализации таким образом, чтобы максимизировать общее количество фотонов и минимизации фототоксичность, фотообесцвечивания и кросс-возбуждение.
- В современном конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, используйте 20X высокой числовой апертурой погружения цели, откройте детектор крошечное отверстие 2,5 Эйри единиц (т.е., широкоугольный оптический секционирования), выбрать высокую чувствительность GaAsP-детекторы с одновременно активных доноров и акцепторов каналов, 8 бит глубины ~ 750 нм Размер пикселя, 3-кратный кадров усреднения и excitе с 10% диодного лазера в 405 нм.
- Чтобы обеспечить правильное количественное установки усиления детектора обоих каналов в то же значение, и, чтобы избежать каких-либо насыщенные пиксели.
Примечание: В данном случае рост был установлен на 150%.
- Обеспечить постоянный погружение, распространяя иммерсионной среды на дне лунок, например, с 1 мл шприца, и избежать захват пузырьков воздуха.
- Активируйте проходящий свет и найти репрезентативную поле зрения в каждую лунку. Используйте правильно калиброванного автоматический этап и отметьте положение в программном обеспечении.
- После удаления пластины для окрашивания (см раздел 4.3), вставьте пластину и добавить вес на вершине, чтобы избежать дрейф фокусное. Просмотрите сохраненные позиции в режиме лазерного сканирования и настроить фокус и боковое положение должным образом.
- Установите промежуток времени до 2 мин, продолжительность 2 ч и начать приобретение.
- Установите условия визуализации таким образом, чтобы максимизировать общее количество фотонов и минимизации фототоксичность, фотообесцвечивания и кросс-возбуждение.
- Изображение количественное (примеры будут приведены для битовой плоскости метакие, как Imaris)
- Импорт набора данных в программное обеспечение, что позволяет арифметические расчеты пиксельных матриц. Сделайте это с помощью перетаскивания исходный файл, содержащий как донора и акцептора канал на иконку программного обеспечения.
- Вычтите фон в обоих каналах, используя то же смещение. Чтобы сделать это, нажмите Меню, а затем нажмите изображение> Обработка> Вычитание. Выберите каждый канал и введите базовое значение.
- Исправьте проступание донора канала (CH1) в акцепторной канала (CH2) с заранее определенной коррекции коэффициента F (см 1.1), создавая новый канал:
Ch2 = CH2 - канал 1 * е
Примечание: стравливающего через акцептора в донорской канала обнаружен не был на уровне шума.- Нажмите Меню> Обработка изображения> Channel арифметики и введите абс (CH 2 (CH1 * 0,33)). После удаления канала 2, нажав Меню> Изменить> Удалить каналы. Убедитесь, чтопроступание скорректированной акцепторной канала остается как новый канал 2. Необязательно: Измените цвет канала от серого до первоначального цвета, перейдя в Меню> Изменить свойства> Image. Выберите канал 4> Mapped Цвет> основного цвета и изменить ее, например,, зеленый.
- Создать новый канал с помощью следующей операции, чтобы определить относительный коэффициент FRET:
Ch3 = CH2 "/ (CH1 + Ch2 ')- Перейти к Меню> обработка изображений> Channel арифметики и введите ch2 ./ (CH1 + CH2)
- Для правильной визуализации канала FRET в 8-битное изображение, создайте четвертый канал:
Ch4 = 255 * Ch3- Перейти к Меню> обработка изображений> Channel арифметики и введите 255 * ch3. Измените цвет канала, выбрав Меню> Изменить свойства> Image. Выберите канал 4> Mapped Цвет> Color Table File> джет.
- Нанесите медианный фильтр 3x3 для каналов CH3 и CH4 тхат снизит шум на изображениях. Чтобы сделать это, нажмите Меню> обработка изображений>> Сглаживание медианный фильтр. Выберите оба канала и применять размер фильтра "3x3x1".
- Для количественного определения сигналов сотовой, обнаружить клетки в СН4, должным образом установка смещения и фильтр структуры по размеру, чтобы исключить слишком малые структуры.
- Выберите Surpass Фото и нажмите на иконку "Добавить новые поверхности". Определить параметры алгоритма обнаружения в окне Surface. Для более быстрой обработки, активировать две галочки "сегмент только область интереса» и «весь процесс изображение окончательно". Определите область интереса путем редактирования ее размеров.
- Выберите канал 4 в качестве исходного канала и установить порог по Thresholding> вычитание фона (локальный контраст) и установить диаметр до 10 мкм. Установите минимальный порог интенсивности вручную на 0 и максимальный порог максимальной IntensiТай. Фильтр структуры по площади и установить минимальное значение, например, 187 μm². Закончить обнаружения поверхности.
- Выписка средние значения для интенсивности флуоресценции донора (Ch1) и коэффициента относительной FRET (CH 3) и их стандартных отклонений в клеточном лица. Чтобы сделать это, перейдите к свойствам покрытий. Изменение внешнего вида структур, выбрав поверхностей стиль / качество> Surface. Выберите все структуры, нажав на вкладке фильтров. Объединение обнаруженные структуры, перейдя на процесс отбора> Unify. Экспорт статистики в поверхностные MS Excel, нажав на вкладке Статистика> Экспорт всю статистику в файл.
- Участок эти значения с течением времени. Определить 10 мин интервал максимального наклона увеличения флуоресценции донора канала для каждого состояния в разумные параметра представлять количество транслоцируется эффектора. Рассчитайте наклон, т = Δ интенсивности флуоресценции донора / Δ времени (мин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать способность описанного метода количественного анализа эффекторной транслокацию в клетки-мишени, два штамма Yersinia с различной кинетикой транслокации изучали: Y. энтероколитные штамм дикого типа WA-314 (серогруппы O8, укрывательство плазмиды вирулентности pYVO8 22) и ее производной WA-314ΔYopE (WA-314 укрывательство pYVO8ΔYopE 23). Ранее работа показала, что Ю. энтероколитные мутанты, лишенные функциональных YopE демонстрируют значительно более высокую скорость Yop транслокации 10. Оба штамма были преобразованы с кодировкой векторов для слияний п-терминал сигналом секреции YopE и ПЭМ-1 бета-лактамазы (ПМК-бла) 17. WA-314 дополнительно трансформируют вектором, кодирующим для соответствующего YopE овальбумина синтеза (ПМК-ова 17) в качестве отрицательного контроля. Инкубационный раз на 30, 60 и 90 мин были применены в целях дальнейшего оценки method`s эффективный диапазон Aй пригодность для количественного определения. Два различных режима отображения используются для анализа данных: донор флуоресценции (CH1) и относительные коэффициенты FRET (СН3 = СН2 '/ (CH1 + CH2 ")) (рис 1B и 1C).
Для отрицательного контрольного штамма WA-314-ПМК-ова Нанесение интенсивностей донорно канала (CH1) с течением времени не показывает рост флуоресценции независимо от времени инкубации (Фиг.1В). В противоположность этому, в WA-314-ПМК-бла инфицированных клеток увеличение интенсивности флуоресценции в течение долгого времени было обнаружено, указывающий на наличие YopE бета-лактамаз синтеза в клетке-мишени цитоплазме. Как и ожидалось, Максимальный наклон интенсивности флуоресценции положительно коррелирует с длиной инфекции (30 мин инфекции: 0,10 / мин, 60 мин инфекция: 0,33 / мин, 90 мин инфекции: 0,76 / мин), что указывает различные концентрации транслокации бета- лактамазы можно выделить. В соответствии с предыдущими исследованиями WA-314ΔYopE-ПМК-BLA инфицированные клетки обладают более быстрое увеличение интенсивности флуоресценции по сравнению с штамма дикого типа (30 мин инфекции: 1.28 / мин, 60 мин инфекция: 1,53 / мин, 90 мин инфекция: 1,41 / мин). Интересно, что расширение инфекции 90 мин не приводит к дальнейшему ускорению роста флуоресценции донора по сравнению с 60 мин инфекции (Фиг.1В). Эта находка может, вероятно, объясняется постепенной цитотоксического эффекта, оказываемого WA-314ΔYopE-ПМК-бла, который может либо препятствовать эффективной транслокации за 60 мин инфекции или привести к потере флуоресценции красителей из-за нарушения целостности плазменной мембраны. Результаты, представленные с помощью относительного коэффициента FRET (CH3) для анализа находятся в хорошем соответствии с результатами, полученными с помощью донора каналу в одиночку. Тем не менее, в некоторых условиях (WA-314ΔYopE-ПМК-бла, 60 и 90 мин инфекция), представляющих очень большое количество транслокации бета-лактамаз синтеза, очевидно, CCF4 субстрат былянно обрабатывается до визуализации может быть запущен. Эти условия не позволит расчете разумной максимальной отрицательный наклон, поскольку соответствующая часть кривой пропустил в этом представлении данных (рис 1в). Изображения относительного коэффициента канала FRET обеспечивают возможность сравнить различия между отдельными клетками (рис 1D).
Рисунок 1. Количественный анализ эффектора транслокации по ТЭМ-1 YopE слияния в Y. энтероколитные. (А) Гидролиз субстрата CCF4 транслокации ТЕМ-1 бета-лактамазы контролировали с помощью лазерной сканирующей микроскопии. Возбуждение при 405 нм в результате зеленый флуоресценции (530 нм) интактном субстрате и в синей флуоресценции (460 нм) скола пр гидролизаoduct (кумарин). (B, C) данные микроскопии количественно анализировали путем нанесения интенсивность донорно канала (CH1) или расчет и построение относительных коэффициентов FRET (СН3 = СН2 '/ (CH1 + Ch2')). Данные представляют три независимых экспериментов. (D) изображены микрофотографии (FRET канал) были взяты из представительных фильмов в указанные моменты времени. WA-314ΔE-ПМК-бла инфицированные клетки показывают более быстрое уменьшение относительных коэффициентов FRET по сравнению с диким типом WA-314-бла ПМК-(60 мин инфекция). Масштаб бар, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Перекрестные помехи определение V450 флуорофоров и FITC.Спектры обоих отдельных флуорофоров измеряли с конфокальной микроскопии. Проступание донора V450 в акцепторной канала в диапазоне 525-535 нм детектором рассчитывали из линейной регрессии (вставки). Средний процент перекрестных помех вычисляется из двух измерений равна 0,33. Проступание акцепторной FITC в донорской канала (455-465 нм) не был обнаружен на уровне шума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы здесь успешно применяется на основе анализа ПЭМ-1 бета-лактамаз репортер для количественного анализа эффекторных транслокации по Y. энтероколитные. Много различных вариантов этой чувствительной, конкретной и относительно простой методики были описаны в литературе. В этом исследовании лазерной сканирующей микроскопии проводили в течение наиболее чувствительный и точного обнаружения сигналов флуоресценции. В частности, поправка на перекрестных помех между донорными и акцепторными красителей и индивидуально регулируемыми полосой пропускания обнаружения позволяют превосходной точности измерения по сравнению с другими вариантов метода. Результаты ясно показывают, что способ может количественного анализа транслокации. Различные периоды инкубации, представляющие различные концентрации внутриклеточного бета-лактамазы были положительно коррелирует с наклоном интенсивности флуоресценции донора. Также значительно выше скорости транслокация WA-314ΔYopE сравнениюв штамме дикого типа WA-314 может быть продемонстрировано.
Были применены два альтернативных варианта анализа данных: интенсивность каналов донора и относительные коэффициенты ладу. Преимущество использования донорской канал является то, что она непосредственно представляет накопление CCF-4 продукта гидролиза (кумарина). Этот подход можно в микроскопической установки, так как кроме случаев пластины коррекции считывания для различий в плотности клеток с использованием соотношения донора / акцептора не является необходимым. Тем не менее, экспорт в CCF4 красителя или его продуктов гидролиза все еще можно confounder в этом подходе. Этот недостаток может быть преодолен путем расчета относительного коэффициента FRET.
В описываемых экспериментах установки были проведены в 96-луночных планшетах. Этот формат позволяет для тестирования нескольких условий в одном эксперименте и помогает экономить дорогие химические вещества (в частности, CCF4 / АМ загрузки набор). В описанном процесса важно, чтобы начать чатПриобретение возраст при определенной временной точке вскоре после добавления CCF4 / AM загрузки решение, потому что гидролиза CCF4 по транслокации бета-лактамазы начинается немедленно. В случае обработки в различных условиях на один раз, регулировка фокуса и боковые позиции (шаг 5.1.4) может занять слишком много времени и затруднить своевременную начало получения изображения. Таким образом, максимальное число параллельных проб должны быть определены индивидуально.
Одной из основных проблем, возникающих с помощью этого метода было значительное экспорт CCF4 подложки клетками HeLa при 37 ° С. Это явление не может быть в достаточной степени противодействует обработки клеток пробенецид. Поэтому мы решили, вместо того, чтобы мониторинга транслокации в течение текущего инфекции, как описано выше, чтобы первый полный инфекции, а затем загрузить клеток с красителем CCF4 / AM. При таком подходе можно было контролировать обработку CCF4 подложки при комнатной температуре. В этих условиях Редунаблюдалось CED экспорт CCF4. Сумма экспорта CCF4 подложки, кажется, линия клеток конкретных; на установке, описанной здесь, обеспечивает безопасность анализа транслокации также в клеточных линиях, которые сильно экспорта CCF4 при 37 ° С.
Экспорт CCF4 не является проблемой в некоторых других клеточных линий, позволяющих принять настройки микроскопии для мониторинга процессов инфекции и транслокации одновременно в режиме реального времени. Это дает возможность проанализировать транслокации в отдельных клетках и могут быть использованы для корреляции с транслокацию определенных событий взаимодействия клетки-хозяина, как бактериальной адгезии или образование колоний микроорганизмов 20. Таким образом, этот анализ является ценным инструментом для дальнейшего выяснения механизмов, как перемещение регулируется во взаимодействии бактерий и клеток-хозяев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
