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Bioengineering

Una tecnica senza etichetta per l'Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

Published: November 23, 2015 doi: 10.3791/53120
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Materials Science and Technology, Naval Research Laboratory, 2Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

Summary

Comunicazione intercellulare è fondamentale per controllare varie attività fisiologiche all'interno e all'esterno della cellula. Questo documento descrive un protocollo per misurare la natura spazio-temporale delle secrezioni unicellulari. Per raggiungere questo obiettivo, è usato un approccio multidisciplinare che integra nanoplasmonic label-free sensing con imaging cellulare dal vivo.

Introduction

La comunicazione tra cellulare è fondamentale per la regolazione di molte attività fisiologiche sia all'interno che all'esterno della cellula. Una varietà di proteine ​​e vescicole può essere secreto che successivamente innescare processi cellulari complessi come la differenziazione, la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, la migrazione e la proliferazione. 1-5 Anomalie di vie di segnalazione inter-cellulari sono stati implicati in numerosi disturbi tra cui il cancro, l'aterosclerosi , e diabete, solo per citarne alcuni.

La cella ottimale dosaggio secrezione dovrebbe essere capace di spazialmente e temporalmente mappatura della proteina secreta di interesse senza interrompere le vie di segnalazione rilevanti. In questo modo relazioni causali tra i profili di concentrazione e la risposta delle cellule riceventi possono essere dedotti. Purtroppo, molte delle tecniche di fluorescenza a base più comunemente utilizzati non soddisfano questi criteri. Proteine ​​di fusione fluorescenti possono essere usati per codificare l'analita well'ambito cella ma può disturbare la via di secrezione, o se secreto, determina un bagliore diffuso fuori della cellula che è difficile da quantificare. Saggi basati immunosandwich-fluorescenti sono le tecniche più comunemente utilizzati per la rilevazione secrezioni cellulari ma tipicamente richiedono l'isolamento di singole cellule. 6-11 Inoltre, l'introduzione di anticorpi di rilevamento arresta o termina l'esperimento e le dimensioni delle etichette anticorpo tipicamente, 150 kDa per le IgG, è un impedimento alla segnalazione a valle.

A causa di questi blocchi stradali è preferibile che una tecnica libera-label essere utilizzata per le secrezioni di proteine ​​immagine e tra tecnologie senza etichette esistenti, risonanza plasmonica di superficie (SPR) e localizzato risonanza plasmonica di superficie (LSPR) sensori sono ottimi candidati. 12-17 Questi I sensori sono stati ampiamente utilizzati per analita studi di legame di proteine, esosomi e altri biomarcatori. 18-24 Nel caso della LSPR, il nanostr plasmonicheuctures può essere modellata litograficamente su vetrini ed eccitato utilizzando la luce visibile attraverso configurazioni standard a grande campo di microscopia. Grazie alla loro impronta nanoscala, la maggior parte del substrato di vetro è disponibile per tecniche di imaging comuni come campo chiaro e microscopia a fluorescenza rendendo così queste sonde adatte per l'integrazione con la microscopia live-cell. 25-28 Abbiamo dimostrato la misura in tempo reale di secrezioni anticorpi da cellule di ibridoma utilizzando nanostrutture plasmoniche oro funzionalizzato con risoluzioni spaziali e temporali di 225 msec e 10 micron, rispettivamente. La configurazione di base del circuito integrato è illustrato in Figura 1. 28 Il percorso ottico di uscita del microscopio è diviso tra una telecamera CCD utilizzato per immagini e uno spettrometro a fibre otticamente accoppiato per la determinazione quantitativa di occupazione frazionata di un dato array di nanostrutture (figura 2 ).

Il ProtoColo presentato in questo documento descrive il disegno sperimentale per la misura in tempo reale delle secrezioni singola cellula, mentre possono monitorare la risposta delle cellule usando microscopia in campo chiaro standard. L'approccio multidisciplinare comprende la fabbricazione di nanostrutture, funzionalizzazione delle nanostrutture per il legame di analiti alta affinità, ottimizzazione superficie sia per minimizzare legami non specifici e caratterizzare costanti di velocità cinetiche utilizzando una superficie commerciale Plasmon Resonance (SPR) strumento, l'integrazione di linee cellulari sul substrato, e l'analisi di immagini e dati spettrali. Prevediamo questa tecnica come una tecnologia abilitante per la mappatura spazio-temporale delle secrezioni cellulari e le loro relazioni causali con celle riceventi.

Protocol

1. nanostrutture

  1. Scegli 25 mm vetrini di diametro con spessore di 170 micron approssimativa (No. 1.5) come substrati per nanofabbricazione.
  2. Immergere i coprioggetti in soluzione Piranha (rapporto 3: 1 di acido solforico e perossido di idrogeno) per almeno 6 ore. Lavare il piranha vetrino bagnato con abbondante ultrapura 18,2 MW deionizzata acqua distillata (DDW).
    ATTENZIONE: L'acido Piranha reagisce violentemente con materiali organici e deve essere maneggiato con estrema cura.
  3. Acconto 10 nm cromo film sottile sui vetrini via e-beam evaporazione per evitare effetti di carica durante il patterning e l'imaging di nanostrutture.
  4. Spin il primo strato di resist doppio strato costituito da metil metacrilato di etile lattato (MMA_EL6) copolimero a 2.000 rpm per 45 sec e poi cuocere in forno a 150 ° C. Spin il secondo strato di poli-metil metacrilato (950PMMA_A2) a 3.000 rpm per 45 sec poi cuocere in forno a 180 ° C.
  5. Picchiettion bistrato resist mediante litografia a fascio elettronico (EBL) a 25 kV con una dose di 300 uC / cm 2 zona. Sviluppare in alcool isopropilico (IPA) / metilisobutilchetone (MIBK): 2/1 e sciacquare in IPA.
  6. Deposito Ti (5 nm) / Au (80 nm) pellicola sul substrato mediante un evaporatore e-beam.
  7. Dopo la deposizione dell'oro, sollevare il doppio strato copolimero resistere immergendo il substrato in acetone per 4 ore.
  8. Controllare il supporto con il microscopio elettronico a scansione (SEM) per confermare forma e dimensione nanostruttura, rimuovere il cromo residuo dal substrato mediante attacco umido utilizzando CR-7 mordenzante per 60 sec a temperatura ambiente e poi sciacquare a DDW.
  9. Progettare un array di spaziatura da centro a centro di 33 micron per lasciare spazio per l'imaging cellulare tra gli array. Motivo nanostrutture a 20 x 20 modello per ogni array con un passo di 300 nm utilizzando uno scrittore e-beam. Ogni chip contiene 300 array a dimensione nanostruttura tipico di altezza 80 ± 2.5 nm e 70 ± 2,5 nm Diameter.
  10. Controllare un sottoinsieme di array utilizzando il microscopio a forza atomica (AFM) per la verifica delle dimensioni e uniformità.
  11. Fissare un anello di supporto, tipicamente silicio, sul retro del vetrino utilizzando una resina epossidica polimerizzazione UV.

2. Chip Pulizia e applicazione di auto-assemblati monostrato

  1. Per la pulizia e rigenerazione dei chip, plasma incenerire a una potenza di 40 W in una miscela di 300 mTorr 5% di idrogeno, 95% argon 45 sec dopo la pulizia della camera per 5 minuti nelle stesse condizioni.
  2. Funzionalizzare nanostrutture oro immediatamente dopo incenerimento plasma immergendo il chip in una soluzione etanolica tiolo bicomponente costituito da un rapporto 3: 1 di SH-(CH 2) 8 -EG 3 -OH (SPO) e un componente o con un'ammina o carbossilico gruppo funzionale, cioè, SH-(CH 2) 11 -EG 3 -NH 2 (SPN) o SH-(CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC).
  3. Lasciare l'i chip din la soluzione tiolo O / N per formare un monostrato auto-assemblato (SAM).
  4. Risciacquare il chip con etanolo e asciugare con azoto gassoso.
  5. Se necessario, memorizzare il chip funzionalizzato per 2 settimane a 4 ° C.
  6. Quando pronto all'uso reagire il SPN o componente SPC con il ligando utilizzando una chimica a seconda del ligando di scelta (vedi sotto).
    Nota: I chip possono essere rigenerati e decine di ri-funzionalizzate di volte. Un determinato chip può essere utilizzato per periodi che vanno da 6 mesi a più di un anno. Gli spettri misurati su un dato array vengono riprodotti in modo affidabile dopo ripetuti rigenerazioni di incenerimento plasma, seguito da biofunzionalizzazione. 29

3. funzionalizzazione superficiale e Kinetic Caratterizzazione

Nota: utilizzare il chip funzionalizzati nello strumento SPR commerciale per caratterizzare le costanti di velocità cinetiche tra il ligando e l'analita, così come per studiare la resistenza di SAM non specifico binding. Esiste una vasta gamma di portate e disegni microfluidici che consentono un'efficiente funzionalizzazione superficiale. Dal momento che abbiamo un SPR disponibile in commercio abbiamo standardizzato intorno alle sue portate consigliate. Prendiamo atto che questi flussi sono tipici di tutti gli strumenti SPR e così non è restrittiva. Lo strumento SPR non è una necessità poiché tutto funzionalizzazione può avvenire direttamente sul chip LSPR, ma ha ridotto il nostro carico di lavoro perché è uno strumento multiplato mentre il nostro LSPR configurazione non è microfluidica.

  1. Funzionalizzare un chip commerciale d'oro nudo con il SAM come descritto nella Sezione 2.
  2. Se si utilizza un SAM basato SPC, attivare il gruppo carbossilico con una miscela 1: 1 di 133 mM di 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) e 33 mM di N -hydroxysuccinimide (NHS) in DDW per 10 min.
  3. Coniugare il gruppo carbossilico attivato con l'anticorpo / ligando di interesse per 300 sec utilizzando una portata di 30 microlitri / min. Preparare i ligandi inpH 6 tampone fosfato, tipicamente, ma questo può variare a seconda della molecola.
  4. Dopo la coniugazione ligando, flusso 0,1 M etanolamina in tampone fosfato salino (PBS) come un passo disattivatore per 300 sec ad una velocità di 30 ml / min. Ethanolamine aiuta a minimizzare il binding non specifico.
  5. Introdurre l'analita di interesse con una portata di 100 l / min usando una gamma di concentrazioni e calcolare le costanti di velocità cinetiche utilizzando un software di analisi cinetica.
  6. Se legame non specifico è problematica, aumentare il rapporto di SPO a SPC o SPN.

Impostazioni 4. LSPR generali

  1. Impostazioni Microscopio:
    1. Utilizzare una lampada alogena 100 W per Koehler illuminare il campione. Utilizzare un filtro passa lungo (tipicamente 593 nm cutoff) nel percorso ottico per eliminare le lunghezze d'onda che non contribuiscono allo spostamento di risonanza (Figura 2).
    2. Per la raccolta dei dati LSPRi, utilizzare un microscopio rovesciato con un immersio olio 40Xobiettivo n (1.4 NA) e una camera CCD raffreddati termoelettricamente 16 bit.
    3. Collocare un divisore di fascio alla porta di uscita del microscopio per ottenere immagini e spettri simultaneamente.
    4. Impostare la fase di microscopio a temperatura controllata a 37 ° C ed equilibrare per 4 ore.
    5. Incorporare un assieme incubazione addizionale sul microscopio per regolare la concentrazione di CO 2 e l'umidità a 5% e 95%, rispettivamente.
  2. Preparazione Chip e montaggio:
    1. Funzionalizzare il chip LSPR come descritto nella Sezione 2 con le due componenti ottimali rapporti SAM determinate dagli esperimenti SPR.
    2. Caricare il chip all'interno di un titolare di microfluidica su misura come segue. Posizionare il chip su un pezzo inferiore in alluminio. Sandwich il chip tra questo pezzo inferiore e una guarnizione in silicone e una chiara pezzo superiore di plastica. Utilizzare 4 viti per bloccare il gruppo.
    3. Per una tipica applicazione tiolo basata SPC, goccia cappotto 300 microlitri di una miscela 1: 1tura di 133 mm di EDC e 33 mm di NHS in DDW per attivare i gruppi carbossilici del componente SPC tiolo.
    4. Attendere 10 minuti e risciacquare manualmente la superficie con PBS 10 mM.
    5. Coniugare il gruppo carbossilico attivato con il ligando (tipicamente un frammento di anticorpo o anticorpi) di interesse rivestendo 300 ml di soluzione di ligando goccia.
    6. Attendere per 30 minuti e risciacquare manualmente con PBS 10 mm.
    7. Goccia cappotto 300 ml di 0,1 M in PBS etanolamina sul chip per minimizzare legami non specifici. Attendere 10 min.
    8. Lavare il etanolamina con PBS contenente 0,005% di Tween 20 (PBS-T20).
    9. Posizionare un pezzo di quarzo sopra il chip per ridurre le fluttuazioni nei dati relativi ad un menisco cambiamento.
    10. Mantenere il chip bagnato con tampone PBS-T20 durante il montaggio sul microscopio.
    11. Posizionare il gruppo di chip LSPR saldamente il porta campioni palco riscaldato e collegare il tubo microfluidica.
    12. Collegare il tubo microfluidica alle bu di assemblaggio e di flussoffer (o media liberi siero per studi sulle cellule) fino uno stato stazionario viene raggiunto.
    13. Permettere il montaggio e microscopio per stabilizzare almeno 2 ore.
    14. Allineare il chip utilizzando joystick modo che l'apparato centrale è allineata con la fibra ottica per la spettroscopia. Dati spettroscopici viene presa utilizzando uno spettrometro e software di analisi spettrale.
    15. Mantenere gli array a fuoco tutto l'esperimento utilizzando il software autofocus, Zeiss Fuoco definitiva o un dispositivo equivalente autofocus.

5. LSPR Imaging di secrezioni anti-c-Myc da 9E10 cellule di ibridoma

Nota: La linea cellulare di ibridoma utilizzato per questo studio esprimono anticorpo anti-c-myc costitutivamente e quindi non richiedono un trigger chimica

  1. Funzionalizzare le nanostrutture con c-myc peptide. Questo ha un valore K D di 1,77 nM per gli anticorpi anti-c-Myc secrete dalle cellule di ibridoma clone 9E10.
  2. Cultura le cellule di ibridoma in complete terreno di coltura con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotici in un pallone T75 a 37 ° C sotto 5% CO 2. Mantenere una densità cellulare di 4 × 10 5 cellule / ml.
  3. Per gli studi di secrezione delle cellule, le cellule pellet dal pallone T75 per centrifugazione, lavare due volte con RPMI-1640 siero media liberi (SFM) per rimuovere gli anticorpi secreti e regolare la densità cellulare di 4 × 10 6 cellule / ml.
  4. Raccogliere le cellule e di prova di redditività prima di introdurli sulle ai chip LSPR.
  5. Introdurre 50 ml di soluzione di cellule manualmente sui chip LSPR con una micropipetta. Dopo pochi minuti da 25 a 50 cellule aderiscono alla superficie dei chip LSPR.
  6. Lavare via le cellule rimanenti in soluzione fresca SFM utilizzando il sistema di perfusione microfluidica.
  7. Selezionare gli array LSPR per l'imaging che sono vicino, a meno di 10 micron, ma non si sovrappongono con le cellule.
  8. Per assicurare che il segnale è specifico per il secreto anti-c-myc ANTIBodies introducono i mezzi di coltura cellulare con e senza gli anticorpi presenti così come con gli anticorpi, ma con i loro siti di legame bloccati dalla presenza di una concentrazione saturante di c-myc peptide nella soluzione.
  9. Calibrare i sensori al termine di ogni corsa con una soluzione satura di anticorpi anti-c-myc (250 nM). Questo aiuta a normalizzare la risposta dei sensori e determinare occupazione frazionato in base al profilo biofunzionalizzazione di ogni corsa.
  10. Correggere la deriva nella direzione X e Y utilizzando software allineamento dell'immagine.

Representative Results

In un tipico studio di secrezione delle cellule vive ci sono diverse modalità di raccolta dei dati in atto. La figura 3 mostra una sovrapposizione di un'immagine LSPRi, che mette in evidenza le matrici quadrate, e un illuminato immagine luce trasmessa, che evidenzia la cella in basso a sinistra. I dati sono tipicamente raccolti su un periodo di 3 ore seguita dall'introduzione di una soluzione saturante dell'analita per il calcolo di normalizzazione descritta di seguito. Imagery fluorescenza può anche essere integrato nella routine di raccolta dati dalla commutazione automatica di un cubo filtro. Nella figura 4 una cella macchiato con la fluorescenza di membrana colorante rodamina DHPE esibisce estensioni lamellipodia-like (frecce). Se tali estensioni dovessero coincidere con le matrici avrebbero dato un falso positivo per la secrezione della proteina. Avere diverse modalità di immagini può aiutare a identificare tali eventi.

Figura 5 mostra i dati di spettrometria di prima e di poppaer l'introduzione di una soluzione saturante (400 nM) di acquistabile anticorpi anti-c-Myc alle matrici funzionalizzate c-myc. Non erano presenti cellule in questo esperimento. Lo spettro mostra sia uno spostamento rosso e un aumento di intensità. La differenza tra le aree sotto le due curve si traduce in un aumento dell'intensità dell'immagine array in modalità LSPRi sulla fotocamera CCD. Un approccio meno analisi dei dati quadrati non lineare è stato sviluppato per inferire occupazione frazionaria di superficie vincolata ligandi dagli spettri. 30,31

Alla fine dell'esperimento, i valori di intensità saturi (cioè, frazionale occupazione ≈ 1) sono utilizzati per calcolare una risposta normalizzata per ogni matrice utilizzando la seguente formula:

Dove sono l'intensità normalizzata al punto di tempo t, intensità iniziale all'inizio dell'esperimento, finale intensità saturato, e l'intensità misurata della matrice al punto di tempo t

Valori normalizzati da due array sono mostrati in figura 6. Una matrice era a 10 micron della cella in esame, mentre l'altro, utilizzato come controllo, era una distanza di 130 micron dalla cella. L'improvviso aumento nella risposta normalizzata della matrice più vicina alla cella relativa alla risposta piatta della matrice di controllo è indicativa di una raffica localizzata di anticorpi secreti.

Figura 1
Figura 1. Sensore design. Un disegno raffigurante la geometria di un tipico esperimento secrezione di cellule vive. La cella (sferoide blu) viene depositato sulla al chip LSPR che contiene array di nanostrutture oro biofunctionalized. Nella vista ingrandita-in, la secrezione delle cellule di interesse, in questo caso gli anticorpi indicati come molecole a forma di Y, viene misurata in quanto si legano alla superficiedelle nanostrutture funzionalizzate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. configurazione dell'ottica. La luce illuminato da una lampada alogena viene prima filtrato da un filtro passaggio lungo (LP). La luce viene polarizzata linearmente (P1) e illumina il campione con un obiettivo 40X / 1.4 NA. La luce diffusa viene raccolta dall'obiettivo e passato attraverso un polarizzatore incrociato (P2). Un divisore di fascio 50/50 (BS) è inserito nel percorso ottico raccolti per spettroscopica simultanea e analisi delle immagini. In alto a destra:. Un'immagine microscopia a forza atomica di 9 nanostrutture individuali separati da un passo di 300 nm Clicca quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Live Cell LSPRi Studio. Una luce trasmessa e immagine LSPRi mostra una cella ibridomi singolo (in basso a sinistra), circondato da 12 matrici fusa. Questa è un'immagine contrasto migliori. Barra della scala è di 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Live Cell Fluorescence Studio. Un fluorescente immagine a falsi colori di una singola cella ibridoma colorati con rodamina DHPE, che è un colorante membrana. In modalità di imaging fluorescente gli array non sono generalmente visibili, tuttavia, una matrice vicina è osservabile qui come abmanca quadrato nell'angolo in basso a destra. La cella può essere visto per essere separato dalla matrice sebbene estensioni tentacolari (possibilmente filopodi o lamellipodi) vengono estende verso l'esterno dalle cellule (frecce). Barra della scala è di 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. spettrale Modalità. Gli spettri ottenuti da un array funzionalizzato c-myc, prima e dopo l'introduzione della soluzione di 400 nM di anticorpi anti-c-Myc. Nessuna cellula erano presenti in questo studio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6 Figura 6. secrezione Single Cell. La risposta di un array si trova a meno di 15 micron di una singola cellula e quello che si trova 130 micron di distanza (di controllo). Barra della scala è di 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm diameter glass coverslips Bioscience Tools  CSHP-No1.5-25   170±5 µm is optimal
Poly-methyl methacrylate Microchem PMMA 950 A4
Ethyl lactate methyl metacrylate Microchem MMA EL6
Electron beam evaporator Temescal FC-2000
Electron beam lithography Raith Series 150
Ethanol Sigma-Aldrich 459836
Acetone Sigma-Aldrich 320110
CR-7 chromium etchant Cyantek CR-7
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 55
Atomic force microscope Veeco Nanoscope III
Plasma ashing system Technics Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) Prochimia TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) Prochimia TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) Prochimia TH 002-m11.n3-0.2
Surface plasmon resonance system Biorad XPR36
Bare gold chip Biorad GLC chip Plasma ashed to remove the monolayer
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Thermo 22980
N-hydroxysuccinimide (NHS) Thermo 24510
Pentylamine-Biotin      Thermo 21345
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
Neutraavidin Thermo 31000
Phosphate buffered saline Thermo 28374
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287
Inverted microscope Zeiss Axio Observer Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH
CCD camera Hamamatsu Orca R2 Thermoelectrically cooled (16 bit)
Spectrometer Ocean Optics QE65Pro
Spectrasuite Ocean Optics version1.4
c-myc peptide HyNic Tag Solulink SP-E003
monoclonal anti-c-myc antibody Sigma-Aldrich M4439
Hybridoma cell line ATCC CRL-1729
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Serum free media RPMI 1640  Invitrogen  11835-030 
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Rhodamine DHPE Life Technologies L-1392

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Bioingegneria Numero 105 localizzato risonanza plasmonica superficiale (LSPR) nanoplasmonics comunicazione cellulare secrezione di segnalazione ibridoma singola cella
Una tecnica senza etichetta per l'Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari
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Raghu, D., Christodoulides, J. A.,… More

Raghu, D., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Byers, J. M., Raphael, M. P. A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions. J. Vis. Exp. (105), e53120, doi:10.3791/53120 (2015).

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