Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

микроРНК экспрессии анализ рака предстательной железы Клинические тканей

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

Важнейшей задачей в рака простаты (РПЖ) клинического управления ставится в неадекватности используемых в настоящее время биомаркеров для скрининга заболевания, диагнозе, прогнозе и лечении. В последние годы, микроРНК (миРНК) появились как перспективные альтернативные биомаркеры для диагностики рака предстательной железы и прогноза. Тем не менее, развитие микроРНК в качестве эффективных биомаркеров рака предстательной железы в значительной степени зависит от их точного обнаружения в клинических тканей. микроРНК анализирует рака простаты клинических образцов часто вызов в связи с неоднородностью опухоли, ошибки выборки, загрязнения и т.п. стромы Цель этой статьи заключается в описании упрощенную рабочий процесс микроРНК анализы в заархивированном FFPE или свежезамороженной рака простаты клинических образцов с использованием комбинации Количественный ПЦР в реальном времени (RT-PCR) и гибридизация (ISH). В этом рабочем процессе, мы оптимизируем существующие методологии для извлечения микроРНК из FFPE и замороженные Tissu простатыES и выражение анализирует по Taqman-зонда на основе микроРНК-ПЦР. Кроме того, мы опишем оптимизированный метод ISH анализа обнаружения formiRNA в тканях предстательной железы с использованием заблокированного нуклеиновой кислоты (LNA) - зонды, основанные. Оптимизированное протокол микроРНК ISH могут быть применены к слайдам рака простаты ткани или ткани предстательной железы микрочипов (TMA).

Introduction

Рак предстательной железы является обычно диагноз мужского злокачественности, что является одним из ведущих причин рака, связанных с смертности среди мужчин. В США, по оценкам, 220,800 новых случаев и смертей 27,540 будут представлены в 2015 году 1.

Рак предстательной железы является гетерогенным заболеванием с высокой переменной болезни курс- опухоли могут быть ленивыми или очень агрессивны. Важнейшей задачей в рака простаты клинического управления ставится в неадекватности используемых в настоящее время методов / биомаркеров для скрининга заболеваний, диагностики, прогноза и лечения 2. Современные методы скрининга включают специфический антиген простаты (ПСА) и пальцевое ректальное исследование (DRE), а затем биопсии предстательной железы 3. Специфического антигена простаты (PSA) является наиболее широко используется рак простаты биомаркеров, что значительно революцию клиническое управление и улучшенные показатели выживания 4. Тем не менее, из-за ограничений, присущих PSA в том числе лакК специфичности, PSA-скрининг привел к более диагноза и в течение лечения заболевания. В связи с этим, интенсивные усилия направлены в сторону поиска альтернативных биомаркеров рака простаты, особенно тех, которые могут предсказать агрессивность заболевания и привод лучшие решения лечения 4,5. За последние несколько лет, микроРНК (миРНК) стали перспективных альтернативных биомаркеров рака простаты.

Микро (микроРНК) составляют эволюционно консервативный класс мелких некодирующих РНК, которые подавляют экспрессию генов посттранскрипционно помощью последовательности конкретных взаимодействий с 3'- нетранслируемые области (НТО) родственных целей мРНК. Считается, что> 60% мРНК сохраняются целей микроРНК 6. микроРНК гены расположены в межгенных или в интронов или экзонов белка / не кодирующих белок генов 7. Эти гены преимущественно расшифрованы РНК-полимеразы II в примыRy микроРНК (PRI-микроРНК, длиной в несколько тысяч пар нуклеотидов), которые образуют шпильки в форме стволовых петля вторичные структуры. Эти PRI-микроРНК обрабатываются в микроРНК-предшественников (пре-микроРНК, 60-75 нуклеотидов в длину), которые экспортируются в цитоплазму и далее перерабатывается в зрелых микроРНК (18-25 нуклеотидов в длину) 8-10. микроРНК регулируют ключевые клеточных процессов, включая пролиферацию, развития, дифференциации и апоптоза 11. Исследования показывают, широкое нарушение регуляции экспрессии микроРНК профилей в различных злокачественных опухолей человека, включая рак простаты 12-15. профили экспрессии микроРНК, как сообщается, широко Нарушение регуляции в сфере начального и метастатическим раком предстательной железы. Измененные выражение микроРНК были связаны с прогрессированием рака простаты, агрессивности и рецидива подсветкой прогностическое потенциал микроРНК 12,14,16-19. Растущее количество доказательств указывает, что микроРНК играют важную роль в механистических рак простаты инициации, развития, прогрессаионов и метастазы. В целом, микроРНК становится перспективные альтернативные биомаркеры для диагностики рака предстательной железы и прогноз, что может отличить нормальных и раковых тканях и помощи в стратификации опухолей простаты 12. Кроме того, микроРНК являются важными мишенями для разработки эффективных терапевтических против рака простаты 20.

Вследствие их маленького размера и устойчивости к эндогенным РНКазы активности, микроРНК являются стабильными биомаркеров, которые могут быть легко обнаружены в фиксированных формалином тканей 21 и 22 в биопсии простаты. Кроме того, профили экспрессии микроРНК были сравнены в замороженных и фиксированных формалином тканей и было обнаружено, что сильно коррелирует 21. Тем не менее, микроРНК выражение профилирования в рака простаты клинических тканей часто вызов в связи с неоднородностью опухоли, ошибки выборки, загрязнения стромы т.д. развития микроРНК в качестве эффективных биомаркеров рака предстательной железы в значительной степени RELIES на их точного обнаружения в клинических тканей. Здесь мы опишем упрощенный рабочий процесс, используемый в нашей лаборатории для микроРНК выражения профилирования в заархивированном FFPE или свежезамороженной рака простаты клинических образцов. Мы используем комбинацию количественного ПЦР в реальном времени и в гибридизация для микроРНК анализа клинических образцов, с бывшим уступая более количественной информации и последний для визуализации дифференциальное выражение потенциальных биомаркеров микроРНК в массиве тканей. В этом рабочем процессе, мы оптимизируем существующие методологии для извлечения микроРНК из FFPE и замороженных тканях простаты, выражение анализирует по Taqman-зонда на основе микроРНК-ПЦР и микроРНК в технике гибридизации месте с помощью заблокированного нуклеиновой кислоты (LNA) основе датчиков 23. LNA-зондов на основе предложить повышенную чувствительность и специфичность по сравнению с ДНК-РНК-зондов или основанных и позволяет надежную обнаружения всех последовательностей микроРНК, независимо от их содержания GC, а также позволит discriminaние микроРНК семей. Оптимизированное протокол микроРНК ISH могут быть применены к слайдам рака простаты ткани или ткани предстательной железы микрочипов (TMA), причем последний обладает потенциалом для ускорения поиска биомаркеров микроРНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Фиксированных формалином, парафин (FFPE) или свежие образцы рака простаты замороженном были получены из SFVAMC. Образцы от пациентов с раком предстательной железы, которые подверглись радикальной простатэктомии в SFVAMC. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов и исследование было одобрено UCSF Комитета по населенным исследований по. Кроме того, ткани рака простаты микрочипы были закуплены из коммерческих источников и используются для анализа микроРНК с ISH. Клинико и следить за информацией для анализируемых больных раком предстательной железы была собрана.

1. Образцы тканей

  1. Вырезать образцы рака простаты в ткани 10 мкм разделы, используя микротома и пятно Н & Е в соответствии с протоколом производителя.
  2. Просмотрите окрашенных слайды для идентификации рака простаты очагов, а также с нормальной железистой эпителия.
    Примечание: Совет сертифицированных патологоанатом должен рассмотреть Н & Е окрашенных слайды и магк для опухолевых и нормальных областей. Используйте отмеченные слайды качестве руководства в последующих разделах для микроРНК анализы из опухоли против нормальных областей.

2. микроРНК экспрессии анализ количественной ПЦР в реальном времени

Примечание: Этот рабочий процесс включает в себя следующие этапы: Лазерная микродиссекции Захват, изоляции общей РНК (в том числе микроРНК и мРНК), опробование зрелых микроРНК, используя выражение анализы TaqMan микроРНК, как описано в следующих разделах.

  1. Экстракция РНК
    1. Выделение микроРНК из рака простаты FFPE тканей
      1. Лазерная захвата микродиссекции (LCM)
        Примечание: Выполните действия 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 в химической вытяжкой.
        1. Подготовка ткани слайды (10 мкм) для секций LCM. Deparrafinize срезы ткани путем замачивания в ксилоле (2x), в течение 10 мин каждого, а затем повторно гидратировать тканей путем инкубации слайды в течение 5 мин каждый в градуированной этанола (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) с последующим дистиллированной воды(5 мин).
        2. После регидратации, пятен секции с гематоксилином в течение 30 сек с последующим добавлением воды.
        3. Место ткани в градуированных этанола (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 мин каждый) и ксилол (5 мин).
        4. Сухие горки в вытяжном шкафу и затем поместить в LCM инструмент для микродиссекции.
        5. Выполните microdissections с LCM системе в соответствии с инструкциями 24 изготовителя. Использование патологоанатом размечена слайды в качестве руководства для идентификации рака простаты очагов, а также прилегающей нормальной ткани. Использование лазерного луча на импульсов 10-20 мкм, диаметр мощностью 70-90 мВт.
        6. Захват области, представляющие интерес с инфракрасными лазерными импульсами на LCM колпачков. Комбинат клетки от 2-5 колпачков для извлечения микроРНК в образце. Для обеспечения целостности добываемого РНК, немедленно обработать захваченных клеток для извлечения микроРНК.
        7. Кроме того, лизируют клетки в буфере для экстракции микроРНК (в соответствии с протоколом производителя) и СТОRe лизатов при -80 ° С.
      2. микроРНК Добыча и анализ от LCM микродиссекции тканей
        1. Извлечение общую РНК из тканей микродиссекции FFPE использованием коммерческого набора следующей инструкции производителя.
          Примечание: Выход РНК из лазерного захвата miscrodissection как правило, низка. Таким образом, РНК элюировали в малых объемах (20-30 мкл) и используется для выражения профилирования с использованием Taqman микроРНК выражение анализов следующие инструкции производителя (также описано в разделе 2.2). Оптимизация входного РНК для реального времени обнаружения ПЦР зрелых микроРНК предполагает, что 5 мкл элюированного РНК является оптимальным для каждого реакции обратной транскрипции микроРНК-специфические. Как эндогенного контроля, RNU48 / RNU24 используется. Для контрольных реакций, 2 мкл элюированного РНК используется для реакции обратной транскрипции.
    2. Выделение микроРНК из рака простаты замороженные ткани
      1. Homogenize замороженные ткани простаты резецировали путем измельчения ткани в жидком азоте с использованием ступки и пестика. Перевести гомогенизированный ткани микроцентрифужных трубки с помощью охлажденного лопаточку. Поддержание раствора / пестиком и шпатель при той же температуре путем погружения в жидкий азот, чтобы гомогенизированной ткани могут быть легко переданы.
      2. Добавить коммерческую гуанидинизотиоцианата-фенольного реагента (1 мл / 0,1 г ткани) в гомогенизированной ткани и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
        Примечание: гомогенизировали ткани в коммерческом гуанидинизотиоцианата-фенольного реагента можно хранить при -80 ° С в течение нескольких месяцев.
      3. Добавить хлороформ гомогената (0,2 мл хлороформа / мл) и энергично встряхивают в течение 30 сек. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 3-5 мин с последующим центрифугированием при 10000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
      4. Передача верхней водной фазы в новую стерильную РНКазы 1,5 мл пробирку.
      5. Добавить равный объем изопропилового спирта. Смешайте и инкубировать в течение 10 мип при комнатной температуре с последующим центрифугированием при 12000 х г в течение 20 мин при 4 ° С для осаждения РНК.
      6. Аспирируйте супернатант и мыть осадок РНК 1 мл 70% этанола. Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
      7. Тщательно аспирата супернатант. Сухие гранулы РНК при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Растворите РНК в 50-100 мкл нуклеазы без воды.
      8. Выполните количественную РНК с использованием спектрофотометра NanoDrop и определить целостность РНК с Bioanalyzer. Регулировка концентрации РНК в 10 нг / мкл. Используйте 10-50 нг РНК для miRNA- специфической реакции кДНК с последующим ПЦР в реальном времени анализирует (раздел 2.2).
  2. Количественный ПЦР в реальном времени для микроРНК Expression анализов
    Примечание: Аналитические зрелые микроРНК с использованием двухэтапного протокола ОТ-ПЦР, как описано ниже.
    1. Обратную транскрипцию (RT)
      1. Обратный транскрибировать РНК кДНК из использования обратного набора транскрипции микроРНК в соответствии с инструкциями изготовителя.Используйте 10-50 нг общей РНК с микроРНК специфического праймера из набора микроРНК Анализы и РТ. Используйте RNU48 / RNU24 / RNU6B в качестве контроля. Развести кДНК 1: 5 до 1:10 (в зависимости от обилия анализируемого микроРНК) и использовать в режиме реального времени обнаружения ПЦР, как описано в следующем шаге.
    2. ПЦР в реальном времени для обнаружения Пожилые микроРНК
      1. Amplify продуктов ПЦР из проб кДНК с использованием микроРНК анализов с Fast Всеобщей мастер смеси в соответствии с инструкциями изготовителя. Нормализовать образцы в RNU48 / RNU24 / контроля RNU6B. Используйте метод сравнительного Ct (пороговый цикл) для вычисления относительных изменений в экспрессии генов на Fast ПЦР в реальном времени системы. Анализ каждого образца в трех экземплярах.

Анализы 3. микроРНК выражение, в гибридизация (ISH)

  1. Предварительная обработка тканей
    1. Вырезать 5 мкм разделы из раковых тканей предстательной железы FFPE блоков с использованием микротома.
      2. Примечание: Слайды можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель для микроРНК анализа.
    2. Deparrafinize ткани путем замачивания слайды с ксилолом (2x), в течение 15 мин каждый.
    3. Увлажняет ткани путем инкубации слайды в течение 5 мин каждый градуированной этанола (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), а затем дистиллированной водой (5 мин).
    4. Fix слайды с 4% параформальдегидом в PBS при комнатной температуре в течение 20 мин.
    5. Промыть слайды с PBS (2х) при комнатной температуре в течение 5 мин каждый.
    6. Treat слайды с 10 мкг / мл протеиназы К при 37 ° С в течение 10 мин в предварительно нагретой протеиназой К буфере (5 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaCl).
    7. После лечения протеиназы-К, промойте слайды с 0,2% глицина в PBS в течение 30 сек.
    8. Промыть слайдов в PBS (1x) при комнатной температуре в течение 5 мин.
    9. Fix слайды с 4% параформальдегидом в PBS в течение 15 мин.
    10. Промыть слайды сPBS в течение 5 мин.
  2. Гибридизация
    1. Предварительно гибридизуются слайды с заранее растворе для гибридизации в течение 3-4 ч при 55 ° С во влажной камере. Используйте ткани лабораторных салфетки, смоченные в 50% формамид / 50% 5x SSC, чтобы камера увлажняется.
    2. Использование 5 'дигоксигенин меченых зондов в концентрации 20-50 нМ в буфере для гибридизации. Развести микроРНК-специфического зонда (20-50 нм) и малые ядерные РНК управления U6 зонд (20 нМ), тепло на 90 ºC в течение 4 мин, поместить его на льду, и добавить к ледяным буфером гибридизации (2-4 нг / мкл ).
    3. Удалить предварительно гибридизации решение, добавить гибридизации решение (зонд + гибридизации буфер, 100 мкл на слайд), инкубировать в течение 12-16 ч при зонда конкретных температуры гибридизации (температура гибридизации = Tm зонда 21 ° C). Выполнение гибридизации в увлажненной камере (50% формамид / 50% 5x SSC).
  3. Стиральные Шаги
    1. Вымойте слайды с 2х SSC в течение 10 мин при 45 ° С.
    2. Вымойте тон скользит с 1.5x SSC в течение 10 мин при 45 ° С.
    3. Вымойте слайды с 0,2 x SSC (2x) при 37 ° С в течение 20 минут каждый.
    4. Инкубируйте слайды с блокирующим раствором 1x в течение 1-2 ч при комнатной температуре
  4. Обнаружение
    1. Инкубируйте слайды с 1: 100 PBS разбавляют AP-сопряженных анти-дигоксигенином антитела для 1-4 ч или в течение ночи при 4 ° С.
    2. Вымойте слайды с PBS (3x) при комнатной температуре в течение 10 минут каждый.
    3. Промыть слайдов (2x) щелочной фосфатазой буфера (100 мМ Трис, рН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Твин-20) при комнатной температуре в течение 5 мин каждый.
    4. Инкубируйте слайды в БМ Фиолетовый AP подложки в темноте при комнатной температуре в течение 1-20 ч.
    5. Промыть слайды с PBS, содержащим 0,1% Tween-20 и мытье (2x) в воде.
    6. Установите слайды, используя крепежные средства массовой информации водные и изучить под микроскопом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Профилирование экспрессии Мир-203 в LCM первичного рака простаты клинических образцов ОТ-ПЦР анализ (рисунок 1)

ОТ-ПЦР анализ экспрессии микроРНК относительной-203 в LCM раковых тканей предстательной железы первичного и соответствующего смежных нормальных областей проводили, как описано в Saini и др. 15 RNU48 был использован в качестве контроля. В таблице ниже приведены относительные выражения микроРНК-203 в рака простаты опухолевых тканях по сравнению с соседними нормальных тканях.

Сравнение выражения микроРНК-383 ОТ-ПЦР анализы в микродиссекции против лазерной захвата микродиссекции РПЖ тканей (Рисунок 2)

Ткани рака простаты были либо микродиссекции под микроскопом или были подвергнуты LCM последующим RT-PCR анализ MIR-383 экспрессии в опухолевых тканях по сравнению с согласованной с нормальной tissues.Relative MIR-383 экспрессии в образцах опухолейкоторые shown.RNU48 был использован в качестве контроля. Как показано на рисунке 2, различия наблюдались при экспрессии микроРНК была проанализирована в этих тканях. LCM имеет преимущество по сравнению микродиссекции под микроскопом, как это позволяет выделить из относительно чистой популяции тканей предстательной железы и является более надежным.

ISH анализа экспрессии микроРНК-203 в рака простаты клинических тканей (Рисунок 3)

В гибридизация анализ экспрессии микроРНК из-203 в нормальных и кости метастатическим раком простаты был тканей, как описано в Saini и др. 15 Рак простаты ткани микрочипов был использован для ISH анализа с использованием 5'-DIG помечены LNA зондов, специфичных для MIR-203 и U6. Типичный пример ISH анализа показан на рисунке 3, фигура частично, от Saini и др. (2011) 15 Рис 3а и 3b showsmiR-203 ExpresСион (слева) и выражение управления U6 (справа) в указанных тканях. ISH сигналы были полуколичественно оцениваются по интенсивности окрашивания и процент окрашенных клеток и присваивается балл от 1 до 4. баллов интенсивности Мир-203 выражения были разделены те выражения U6, чтобы получить нормированные микроРНК-203, что уровни экспрессии были нанесены на рис 3С.

Фигура 1
Рисунок 1: профилирование Выражение микроРНК-203 в LCM первичного рака простаты клинических образцов ОТ-ПЦР анализы. ОТ-ПЦР анализ экспрессии микроРНК относительной-203 в LCM-простаты раковых тканей и соответствующего соседних нормальных областей. RNU48 был использован в качестве контроля. В таблице ниже приведены относительные выражения микроРНК-203 в опухолевых тканях предстательной железы по отношению к соседних нормальных тканей. Пожалуйста, нажмите здесьЧтобы смотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Сравнение микроРНК-383 выражения ОТ-ПЦР анализы в микродиссекции против лазерной захвата микродиссекции РПЖ тканей ткани рака простаты были либо микродиссекции под микроскопом или подвергались LCM последующим RT-PCR анализ микроРНК-383 в выражении. ткани опухоли по отношению к подобранных соседних нормальных тканей. Относительные микроРНК-383 в пробах выражения опухоли shown.RNU48 был использован в качестве контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. ISH анализа микроРНК-203 в выражении рака простаты клинических тканей Эта цифра была изменена с 15. Ткани гибридизации с DIG-Лабезаполненной заблокирован нуклеиновой кислоты (LNA), основанные зонды для MIR-203 и U6 (контроль), как описано в 15. Представитель пример ISH анализа микроРНК-203 выражения (слева) и панели управления U6 выражения (правая панели) в человеческой рака простаты нормальных и костных тканей метастатических показывая ослабляется микроРНК-203 выражение в кости метастатических тканей. Типичные примеры ISH показаны в с большим увеличением (40х). Относительные уровни экспрессии микроРНК-203 в нормальных тканях простаты и костных тканей метастатическим раком простаты, как оценивается путем анализа ISH. Выражение микроРНК-203 был забит, нормированная на десятки U6 и нанесены. Горизонтальная линия представляет собой среднее значение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы опишем упрощенный рабочий процесс для выражения микроРНК профилирования заархивированные FFPE или свежезамороженной рака простаты клинических тканей. При раке предстательной железы, некоторые исследования свидетельствуют о важной роли микроРНК в инициации рака простаты, прогрессии и метастазирования. Тем не менее, противоречивые результаты часто получают по конкретной микроРНК 22 после извлечения микроРНК и анализирует методы отличаются друг от друга. В связи с появлением новых фактических данных, поддерживающей потенциальное применение микроРНК в качестве альтернативных биомаркеров рака простаты для рака простаты прогноз, диагностики и терапии, существует необходимость точно количественно экспрессии микроРНК профилей в клинических тканей.

Мы используем комбинацию количественного ПЦР в реальном времени и в гибридизация для микроРНК анализа рака простаты клинических образцов. В этом рабочем процессе, мы оптимизировали существующие методологии для извлечения микроРНК выражение анализирует по TaqЧеловек грунтовка на основе ОТ-ПЦР и ISH анализа на LNA зондов. В течение всего процесса, это имеет первостепенное значение для поддержания свободной среды РНКазы. Все реактивы, используемые / решения должны быть РНКазы и дополнительное предостережение должно быть использован в работе РНК и другие реагенты. Все реакции в режиме реального времени должна быть создана на льду, чтобы минимизировать деградацию РНК.

Точная профилирование выражение в тканях рака простаты часто затруднено неоднородностью и мультифокальной природы рака простаты поражений 25. Эту проблему можно решить с помощью метода, microdisssection лазерного захвата, что позволяет разделить доброкачественных и злокачественных эпителиальных клеток, а также уменьшает загрязнение стромы, что позволяет точно вниз по течению молекулярные анализы ткани простаты 22,25. Мы используем LCM архивных тканей FFPE затем микроРНК выражения профилирования с помощью микроРНК Taqman анализов экспрессии, которые были сообщены, чтобы быть надежным. микроРНК профилирования LCM тканях significant потенциал для повышения открытие биомаркеров микроРНК. На самом деле, существует значительный интерес при анализе FFPE тканей, учитывая, что эти ткани широко используется патологоанатомами для клинических анализов, сохранение и архивирование и легко доступны 3. Кроме того, вследствие их небольшого размера и устойчивости к эндогенным РНКазы деятельности, микроРНК являются относительно менее затронуты FFPE зависимой деградации и привлекательные потенциальные биомаркеры 3. Выражение микроРНК профили фиксированных формалином тканей, как сообщается, будет сильно коррелирует с тем, замороженных тканей 21.

Мы использовали и сравнивали два различных коммерческих наборов для извлечения микроРНК из тканей FFPE. В то время как оба наборы дали высокое качество РНК для ОТ-ПЦР анализы, мы использовали тот, который использует простой, обтекаемый протокол для последовательного очищения микроРНК и общей РНК из тканей FFPE.

Честность, чистота и концентрация РНК зачиститьD испытано перед ОТ-ПЦР анализы. Образцы, показывающие низкий коэффициент A260 / A230 (<1,8) должны быть повторно осаждают и вновь проанализировали чистоты перед использованием в реакции RT. Кроме того, ПЦР в реальном времени анализ клинических тканей, возможно, потребуется дополнительно оптимизировать. Пороговый цикл (Ct значения)> 33 указывают на низкую отражающую усиление низкой шаблон отправной кДНК. В этом случае входы матрицы кДНК может быть увеличена. Кроме того, это имеет первостепенное значение, что адекватный контроль используется для нормализации и определения относительных количественными микроРНК между нормальных и опухолевых тканей. Эндогенный контроль (RNU48 / RNU24 / RNU6B) выбирается в зависимости от равномерности усиления сигналов от нормального в сравнении образцов опухоли.

Кроме того, мы опишем оптимизированный протокол для микроРНК ISH анализа тканей рака простаты на основе зондов, основанных LNA-. Оптимизированное протокол микроРНК ISH могут быть применены к ткани предстательной железы слайдов или рак предстательной железы ткани микрочипов (TMA), с последним мощным предложенияIAL ускорить открытие биомаркеров микроРНК. Этот протокол также может быть применено к другим типам тканей. Однако продолжительность proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment возможно, должны быть оптимизированы. Протеиназа К пищеварение позволяет зонд микроРНК, чтобы попасть в клетки, а параформальдегиде фиксация необходима, чтобы предотвратить потерю микроРНК следующий проницаемости. Этот протокол, первоначально разработанный для использования с LNA зондов 26 оптимизирована для получения определенного сигнала с минимальным фоне в тканях предстательной железы. Концентрации зонд и условия инкубации оптимизированы для тканей рака простаты. Мы используем 5'digoxigeninlabeledprobes в концентрации 20-50 нМ в зависимости от обилия микроРНК. Тем не менее, 3'digoxigeninlabeledprobes и двойной помечены (5 'и 3') меченых зондов могут быть замещены. На самом деле, два меченых зондов обладают потенциалом для улучшения колориметрического развития для выявления микроРНК и рекомендуются для обнаружения низкой численности микроРНК, Кроме того, продолжительность блокировки и антител инкубации могут быть оптимизированы. Более блокировка рекомендуется для нижней фоне, в частности, с низким микроРНК изобилия. Thedurationofcolor реакция с БМ фиолетовый подложки следует тщательно контролировать. Более длинные инкубации может генерировать фоновое окрашивание. Как правило, обильные микроРНК требуют более короткие инкубации (1-2 ч), в то время как менее обильными микроРНК обнаружены с более инкубации. Во время выставки ISH, важно убедиться, что срезы ткани не высохнуть в течение любого из шагов, как это может привести к окрашивания артефактов.

В заключение, хотя некоторые исследования показывают, микроРНК в качестве важных биомаркеров рака предстательной железы, значение некоторых из этих исследований часто обсуждается в связи с противоречивыми результатами. Здесь мы определили оптимизированный рабочий процесс для точного выражения микроРНК анализирует рака простаты клинических образцов, которые имеют потенциал, чтобы ускорить открытие микроРНК в качестве биомаркеров рака простаты. В то время какЭтот рабочий процесс имеет значительный потенциал для точного выражения микроРНК профиль в рака простаты клинических тканей, есть недостатки, присущие методам, используемым. Низкие обильные микроРНК может быть трудно профиль с оптимизированной микроРНК-ПЦР и анализа ISH описано здесь. Хотя ОТ-ПЦР на основе профилей имеет более широкий динамический диапазон, чем ISH 27,28, небольшие количества РНК, полученные из LCM может ограничить обнаружение низких обильные микроРНК. ISH основе обнаружения микроРНК дает мощную пространственную информацию, однако его ограничения, что это полуколичественный метод с меньшей динамического диапазона 28. Этот метод основан на чувствительности и специфичности зондов, используемых, а также по оптимизации условий для гибридизации и обнаружения микроРНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Роджер Эриксон за поддержку и помощь в подготовке рукописи.

Эта работа была поддержана Национальным институтом рака при Национальном институте здравоохранения

(Грант Количество RO1CA177984; RO1CA138642), В. А. проект программы на рак предстательной железы (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

Tags

Медицина выпуск 103 Микро рак предстательной железы клинические ткани выражение анализирует ПЦР в реальном времени,
микроРНК экспрессии анализ рака предстательной железы Клинические тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter