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Medicine

miRNA expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

Un défi essentiel à cancer de la prostate (CaP) prise en charge clinique est posé par l'insuffisance des biomarqueurs actuellement utilisés pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement. Au cours des dernières années, les microARN (miARN) ont émergé biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic. Cependant, le développement de biomarqueurs miARN comme efficaces pour cancer de la prostate repose en grande partie sur leur détection précise dans les tissus cliniques. miARN analyse des spécimens cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l'hétérogénéité tumorale, les erreurs d'échantillonnage, la contamination du stroma, etc. Le but de cet article est de décrire un flux de travail simplifié pour miARN analyse en FFPE archivé ou spécimens cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé en utilisant une combinaison de quantitative PCR en temps réel (RT-PCR) et l'hybridation in situ (ISH). Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l'extraction de miARN FFPE et tissu de la prostate gelées et l'expression analyses par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR. En outre, nous décrivons une méthode optimisée pour ISH analyse de la détection formiRNA dans les tissus de la prostate à l'aide de l'acide nucléique verrouillé (LNA) - sondes basées. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA).

Introduction

Cancer de la glande de la prostate est une tumeur maligne mâle fréquemment diagnostiqué qui est l'une des principales causes de mortalité liée au cancer chez les hommes. Aux États-Unis, on estime que 220,800 nouveaux cas et 27,540 décès seront rapportés en 2015 1.

Cancer de la prostate est une maladie hétérogène avec une maladie très variable Cours-tumeurs peuvent être indolent ou très agressif. Un défi majeur dans le cancer de prostate gestion clinique est posé par l'insuffisance des méthodes actuellement utilisées / biomarqueurs pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement 2. Méthodes de dépistage actuelles comprennent l'antigène (PSA) des tests spécifiques de la prostate et un toucher rectal (DRE), suivi par biopsies de la prostate 3. Antigène spécifique de la prostate (PSA) est le biomarqueur du cancer de la prostate le plus largement utilisé qui a considérablement révolutionné la gestion clinique et l'amélioration des taux de survie 4. Toutefois, en raison des limites inhérentes de PSA incluant le lack de spécificité, le dépistage à base de PSA-dessus a conduit à un diagnostic et un traitement sur de la maladie. Dans cette perspective, des efforts intensifs sont dirigés vers la recherche de biomarqueurs du cancer de la prostate de rechange, en particulier ceux qui peuvent prédire l'agressivité de la maladie et de conduire de meilleures décisions de traitement 4,5. Au cours des quelques dernières années, les microARN (miARN) sont apparus comme des biomarqueurs du cancer de la prostate alternatives prometteuses.

Les microARN (miARN) constituent une classe évolutif conservé de petits ARN non-codants qui suppriment l'expression génique post-transcriptionnelle par des interactions spécifiques de séquence avec les régions non traduites 3 'UTR () de cibles d'ARNm apparentés. On estime que> 60% des ARNm cibles sont conservées de miARN 6. miRNA gènes sont situés dans les régions intergéniques ou dans des introns ou exons de protéines / non-protéique gènes codant 7. Ces gènes sont préférentiellement transcrites par l'ARN polymérase II dans primamiARN ry (pri-miARN, plusieurs kilobases de long) qui forment en épingle à cheveux en forme de tige-boucle structures secondaires. Ces pri-miARN sont transformées en précurseurs miARN (pré-miARN, 60-75 nucléotides de long) qui sont exportés vers le cytoplasme et traitées ultérieurement dans miARN matures (18-25 nucléotides de long) 8-10. miARN régulent les processus cellulaires clés, y compris la prolifération, le développement, la différenciation et l'apoptose 11. Des études suggèrent une dérégulation généralisée des profils d'expression de miARN dans diverses affections malignes humaines, notamment le cancer de la prostate de 12 à 15. les profils d'expression de miARN ont été rapportés pour être largement dérégulée dans le cancer de la prostate primaire et métastatique. L'expression du miARN modifié ont été liés à la progression du cancer de la prostate, de l'agressivité et de la récurrence soulignant le potentiel pronostique des miARN 12,14,16-19. Un nombre croissant de preuves indique que miARN jouent des rôles importants dans l'initiation mécanistes de cancer de la prostate, le développement, le progrèsion et les métastases. Globalement, miARN sont en train de biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic qui peuvent distinguer entre les tissus normaux et cancéreux et de l'aide dans la stratification des tumeurs de la prostate 12. Aussi, miARN sont des cibles importantes pour le développement de traitements efficaces contre le cancer de la prostate 20.

En raison de leur petite taille et de résistance à l'activité de RNase endogène, miARN sont biomarqueurs stables qui peuvent être facilement détectés dans les tissus fixés au formol et 21 biopsies de la prostate 22. En outre, les profils d'expression des miARN ont été comparés dans les tissus fixés au formol et congelés et ont été trouvés à être fortement corrélé 21. Toutefois, l'expression des miARN profilage dans les tissus cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l'hétérogénéité tumorale, les erreurs d'échantillonnage, la contamination du stroma etc. Le développement des miARN comme biomarqueurs efficaces pour cancer de la prostate fortement relies sur leur détection précise dans les tissus cliniques. Nous décrivons ici un workflow simplifié utilisé dans notre laboratoire pour l'expression des miARN profilage dans FFPE archivé ou échantillons cliniques de cancer de la prostate frais congelé. Nous employons une combinaison de PCR quantitative en temps réel et l'hybridation in situ pour les miARN dans les analyses d'échantillons cliniques, avec l'ancien donnant davantage d'informations quantitatives et celui-ci pour visualiser l'expression différentielle des biomarqueurs miARN potentiels dans un éventail de tissus. Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l'extraction miARN de FFPE et les tissus de la prostate congelés, les analyses d'expression par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR et miARN technique d'hybridation in situ en utilisant l'acide nucléique verrouillé (LNA) à base de sondes 23. Sondes à base de LNA offrent une sensibilité et une spécificité accrue par rapport à l'ADN ou de l'ARN sondes basées et permet une détection robuste de toutes les séquences de miARN, quelle que soit leur teneur en GC et permettent également discrimination des familles de miARN. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA), ce dernier offrant la possibilité d'accélérer la découverte de biomarqueurs miARN.

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Protocol

Échantillons frais cancer de la prostate congelés fixés à la formaline, inclus en paraffine (FFPE) ou ont été obtenues à partir de la SFVAMC. Les échantillons provenaient de patients atteints de cancer de la prostate qui ont subi une prostatectomie radicale SFVAMC. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients et l'étude a été approuvée par le Comité sur la recherche humaine UCSF. Alternativement, les tissus de cancer de la prostate puces ont été achetés auprès de sources commerciales et utilisés pour miARN analyses par ISH. Informations clinico-pathologique et le suivi des patients atteints de cancer de la prostate analysées ont été recueillies.

1. Les échantillons de tissus

  1. Couper des échantillons de tissu de cancer de la prostate dans 10 um sections à l'aide d'un microtome et coloration à l'H & E en suivant le protocole du fabricant.
  2. Revoir lames colorées pour l'identification de la prostate foyers de cancer ainsi que épithélium glandulaire normal adjacent.
    Remarque: Un conseil certifié pathologiste doit examiner les diapositives H & E colorées et mark de zones normales et tumorales. Utilisez les diapositives marqués comme guides dans les sections suivantes pour miARN analyses de la tumeur vs zones normales.

2. miRNA expression analyses par PCR quantitative en temps réel

Remarque: Ce flux de travail comprend les étapes suivantes: microdissection laser, l'isolement de l'ARN total (y compris les miARN et ARNm), le dosage des miARN matures en utilisant les tests d'expression TaqMan microARN comme détaillé dans les sections suivantes.

  1. Extraction de l'ARN
    1. Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus FFPE
      1. Microdissection laser (LCM)
        Remarque: Effectuer les étapes 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 dans une hotte chimique.
        1. Préparer des lames de tissus (10 um sections) pour LCM. Sections Deparrafinize de tissu par trempage dans du xylene (2 x), pendant 10 minutes chacun, puis réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min chacun dans de l'éthanol à gradient (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), suivie de distillation eau(5 min).
        2. Après réhydratation, les sections de tache avec de l'hématoxyline pendant 30 secondes puis de l'eau.
        3. La place les tissus dans de l'éthanol gradué (70%, 95% à 90%, 80%, 70%) (5 min chacun) et du xylene (5 min).
        4. Diapositives sec dans une hotte et les placer dans l'instrument de LCM pour microdissection.
        5. Effectuer microdissections avec le système LCM en conformité avec les instructions du fabricant 24. Utiliser pathologiste balisé diapositives comme guides pour l'identification de la prostate foyers de cancer ainsi que le tissu normal adjacent. Utiliser le faisceau laser à impulsions d'un diamètre de 10-20 pm avec une puissance de 70 à 90 mW.
        6. Les zones de capture d'intérêt avec des impulsions laser infrarouges sur un bouchon d'LCM. Combiner les cellules de 2-5 bouchons pour l'extraction miARN par échantillon. Pour garantir l'intégrité de l'ARN extrait, traiter immédiatement cellules capturées pour l'extraction miARN.
        7. En variante, des cellules de lyse dans le tampon d'extraction miRNA (selon le protocole du fabricant) et store lysats à -80 ° C.
      2. Extraction miARN et Analyses de LCM microdisséquées tissus
        1. Extraire l'ARN total à partir de tissus FFPE microdisséquées utilisant un kit commercial en suivant les instructions du fabricant.
          Remarque: Le rendement de l'ARN à partir de capture laser miscrodissection est généralement faible. Par conséquent, l'ARN est élue dans de faibles volumes (20-30 pi) et utilisé pour le profilage d'expression en utilisant Taqman microARN essais d'expression suivant les instructions du fabricant (également décrits dans la section 2.2). Optimisation de l'ARN d'entrée pour la détection de PCR en temps réel de miARN matures suggère que 5 ul de l'ARN élue est optimale pour chaque réaction de transcription inverse spécifiques à des miARN. Comme un contrôle endogène, RNU48 / RNU24 est utilisé. Pour les réactions témoins, 2 ul de l'ARN élue est utilisé pour la réaction de transcription inverse.
    2. Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus congelés
      1. Homonize tissus prostatiques réséquées congelés par broyage des tissus dans de l'azote liquide en utilisant un mortier et un pilon. Transfert homogénéisés de tissu un tube de microcentrifugation en utilisant une spatule refroidi. Maintenir le mortier / pilon et spatule à la même température en plongeant dans l'azote liquide afin tissu homogénéisé peut être facilement transféré.
      2. Ajouter commercial isothiocyanate de guanidine-phénol réactif (1 ml / 0,1 g de tissu) dans le tissu homogénéisé et incuber à température ambiante pendant 5 min.
        Remarque: les tissus homogénéisés dans la guanidine réactif isothiocyanate-phénol commerciale peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs mois.
      3. Ajouter le chloroforme à l'homogénat (0,2 ml de chloroforme / ml) et agiter vigoureusement pendant 30 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 3-5 min, suivie d'une centrifugation à 10 000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
      4. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube stérile frais 1,5 ml sans RNase.
      5. Ajouter un volume égal d'alcool isopropylique. Mélanger et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante suivie par centrifugation à 12.000 g pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter l'ARN.
      6. Aspirer le surnageant et laver le culot d'ARN avec 1 ml d'éthanol à 70%. Centrifugeuse à 12.000 g pendant 10 min à 4 ºC.
      7. Aspirer délicatement le surnageant. Culots d'ARN à sec à température ambiante pendant 5-10 min. Dissoudre ARN dans 50-100 eau sans nucléase ul.
      8. Effectuer la quantification de l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop et de déterminer l'intégrité de l'ARN avec un bioanalyseur. Ajuster la concentration d'ARN de 10 ng / ul. Utilisez 10-50 ARN ng pour miRNA- réaction d'ADNc spécifique suivie en temps réel par les analyses PCR (section 2.2).
  2. PCR quantitative en temps réel pour miRNA expression Analyses
    Remarque: miARN matures dosage en utilisant un protocole de RT-PCR en deux étapes comme décrit ci-dessous.
    1. Transcription inverse (RT)
      1. Transcription inverse de l'ARN à partir de l'ADNc en utilisant un kit de transcription inverse miRNA conformément aux instructions du fabricant.Utilisez 10-50 ng d'ARN total avec miARN amorce spécifique du kit microARN dosages et RT. Utilisez RNU48 / RNU24 / RNU6B comme témoins. Diluer ADNc 1: 5 à 1:10 (en fonction de l'abondance du miRNA analysé) et utiliser dans la détection en temps réel PCR comme décrit dans l'étape suivante.
    2. PCR en temps réel pour la détection de miARN mûr
      1. Amplifier les produits de PCR à partir d'échantillons d'ADNc en utilisant les tests de microARN avec un mélange maître universel rapide en conformité avec les instructions du fabricant. Normaliser échantillons à RNU48 / RNU24 / contrôle de RNU6B. Utilisez la méthode comparative Ct (cycle seuil) pour calculer les changements relatifs dans l'expression des gènes sur le système de PCR en temps réel rapide. Analyser chaque échantillon en triple exemplaire.

3. miRNA expression analyses par hybridation in situ (ISH)

  1. Pré-traitement des tissus
    1. Couper coupes de 5 um à partir de blocs de tissus cancéreux de la prostate FFPE utilisant un microtome.
      2. Remarque: Les diapositives peuvent être stockées à température ambiante pendant plusieurs semaines pour les analyses de miARN.
    2. Deparrafinize les tissus en trempant les lames avec du xylene (2 x), pendant 15 minutes chaque.
    3. Réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min dans de l'éthanol gradué chaque (de 100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) puis de l'eau distillée (5 min).
    4. Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS à la température ambiante pendant 20 min.
    5. Laver les lames avec du PBS (2x) à la température ambiante pendant 5 minutes chacun.
    6. Traiter les lames avec 10 ug / ml de proteinase K à 37 ° C pendant 10 min dans du tampon K proteinase préchauffé (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, 1 mM de NaCl).
    7. Après le traitement à la protéinase-K, rincer les lames avec 0,2% de glycine dans du PBS pendant 30 sec.
    8. Laver les lames dans du PBS (1x) à la température ambiante pendant 5 min.
    9. Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15 min.
    10. Rincer les lames avecPBS pendant 5 min.
  2. Hybridation
    1. Pré-hybrider les diapositives avec solution de pré-hybridation pendant 3-4 heures à 55 ° C dans une chambre humidifiée. Utiliser des lingettes de laboratoire de tissus imbibés de formamide à 50% / 50% 5x SSC de garder la chambre humidifié.
    2. Utilisez 5 'des sondes marquées à la digoxigénine à une concentration de 20 à 50 nM dans du tampon d'hybridation. Diluer sonde spécifique miARN (20-50 nM) et une petite sonde de contrôle de U6 ARN nucléaire (20 nM), la chaleur à 90 ° C pendant 4 min, placez-le sur la glace, et d'ajouter de la glace tampon d'hybridation à froid (2-4 ng / pl ).
    3. Retirer solution de pré-hybridation, ajouter la solution d'hybridation (sonde + tampon d'hybridation, 100 pi par diapositive), incuber pendant 12-16 h à la température d'hybridation spécifique sonde (température = hybridation sonde-Tm 21 ºC). Effectuer des hybridations dans une chambre humidifiée (50% de formamide / 50% 5x SSC).
  3. Les étapes de lavage
    1. Laver les lames avec 2x SSC pendant 10 min à 45 ° C.
    2. Laver til glisse avec 1,5x SSC pendant 10 min à 45 ° C.
    3. Laver les lames avec 0,2x SSC (2x) à 37 ºC pendant 20 minutes chacun.
    4. Incuber les lames avec une solution de blocage de 1x pendant 1-2 heures à la température ambiante
  4. Détection
    1. Incuber les lames avec 1: 100 PBS dilué anticorps anti-digoxigénine conjugué AP-pour 1-4 heures ou une nuit à 4 ºC.
    2. Laver les lames avec du PBS (3x) à température ambiante pendant 10 minutes chacun.
    3. Laver les lames (2x) avec de la phosphatase alcaline tampon (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à température ambiante pendant 5 min chacun.
    4. Incuber les lames dans le substrat BM Violet AP dans l'obscurité à température ambiante pendant 1-20 h.
    5. Rincer les lames avec du PBS contenant 0,1% de Tween-20 et lavage (2x) dans l'eau.
    6. Monter les lames en utilisant un milieu de montage aqueux et d'examiner sous un microscope.

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Representative Results

Expression profiling de miR-203 dans des échantillons cliniques LCM prostate primaire de cancer par analyse RT-PCR (Figure 1)

Les analyses par RT-PCR de l'expression par rapport miR-203 dans des tissus de cancer de la prostate primaire LCM et les régions adjacentes appariées normales a été réalisée comme décrit dans l'Saini et al. RNU48 15 a été utilisé comme témoin. Le tableau suivant résume l'expression relative miR-203 dans des tissus de tumeurs cancéreuses de la prostate par rapport à des tissus normaux adjacents.

Comparaison de l'expression de miR-383 par analyse RT-PCR en microdissection par capture laser vs microdissection tissus PCA (Figure 2)

Les tissus de cancer de la prostate ont été soit micro-disséquées sous microscope ou ont été soumis à LCM suivie par des analyses RT-PCR de l'expression de miR-383 dans des tissus tumoraux par rapport à la normale tissues.Relative identifié le miR-383 dans des échantillons expression adjacent tumoralessont shown.RNU48 a été utilisé comme témoin. Comme le montre la Figure 2, les différences ont été observées lors de l'expression de miARN a été analysé dans ces tissus. LCM a un avantage sur microdissection sous microscope, parce qu'elle permet l'isolement d'une population relativement pur de tissus de la prostate et est plus fiable.

ISH analyse de l'expression de miR-203 dans des tissus cliniques sur le cancer de la prostate (Figure 3)

L'hybridation in situ des analyses d'expression de miR-203 dans les tissus cancéreux normales et de l'os de la prostate métastatique a été réalisée comme décrit dans Saini et al. 15 Prostate microréseau tissulaire de cancer a été utilisé pour ISH analyses en utilisant 5'-DIG marqué sondes LNA spécifiques de miR-203 et U6. Un exemple représentatif d'analyses ISH est montré dans la figure 3, un chiffre en partie reproduite à partir Saini et al. (2011) 15 Figure 3A et 3B showsmiR-203 expresSion (à gauche) et l'expression de contrôle de U6 (à droite) dans les tissus indiqués. Signaux ISH étaient semi-quantitative graduée basée sur l'intensité de la coloration et de pour cent des cellules colorées et attribué un score de 1 à 4. Intensité scores de miR-203 expression ont été divisés par ceux de l'expression des U6 pour obtenir miR-203 niveaux d'expression normalisées que ont été tracées sur la figure 3C.

Figure 1
Figure 1: Expression de profilage de miR-203 dans des échantillons cliniques LCM prostate primaire de cancer par analyse RT-PCR. Analyse RT-PCR de l'expression par rapport miR-203 dans des tissus de cancer de la prostate LCM et les régions adjacentes appariées normales. RNU48 a été utilisé comme témoin. Le tableau ci-dessous résume l'expression relative miR-203 dans les tissus tumoraux de cancer de la prostate par rapport aux tissus normaux adjacents. S'il vous plaît, cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Comparaison de miR-383 expression par RT-PCR analyse en microdissection par rapport à capture laser microdissection tissus PCa tissus de cancer de la prostate ont été soit micro-disséquées sous microscope ou ont été soumis à LCM suivie par RT-PCR des analyses de miR-383 expression dans. les tissus par rapport aux tissus normaux adjacents appariés tumorales. Relatives miR-383 expressions dans des échantillons de tumeurs sont shown.RNU48 a été utilisé comme témoin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. ISH analyses d'expression de miR-203 dans les tissus cliniques sur le cancer de la prostate Ce chiffre a été modifié depuis 15. Les tissus ont été hybridées avec DIG-Label'acide nucléique verrouillé rempli (LNA) des sondes basées pour mir-203 et U6 (contrôle), comme décrit dans 15. Un exemple représentatif de l'analyse de ISH d'expression de miR-203 (panneaux de gauche) et l'expression contrôle de U6 (des panneaux de droite) dans le cancer de la prostate humaine tissus métastatiques normales et en os montrant atténué miR-203 expression dans les tissus osseux métastatiques. Exemples de ISH représentatifs montrés dans un à un grossissement supérieur (40x). Les niveaux d'expression miR-203 par rapport à des tissus normaux de la prostate et les tissus de la prostate métastatique cancer des os comme évalué par une analyse par ISH. l'expression de miR-203 a été marqué, normalisée aux scores du U6 et tracée. La ligne horizontale représente la valeur moyenne. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans cet article, nous décrivons un flux de travail simplifié pour l'expression du miARN profilage dans FFPE archivé ou tissus cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé. Dans le cancer de la prostate, plusieurs études suggèrent un rôle important des microARN dans cancer de la prostate initiation, la progression et les métastases. Cependant, des résultats contradictoires sont souvent obtenus sur un miRNA spécifique 22 depuis l'extraction des miARN et analyses méthodes diffèrent largement. Compte tenu de la preuve émergente appui de la demande potentielle des miARN comme biomarqueurs de cancer de la prostate alternatives pour le pronostic du cancer de la prostate, le diagnostic et la thérapie, il est nécessaire de quantifier précisément les profils d'expression des miARN dans les tissus cliniques.

Nous utilisons une combinaison de PCR quantitative en temps réel et l'hybridation in situ pour des miARN analyse de spécimens cliniques sur le cancer de la prostate. Dans ce flux de travail, nous avons optimisé les méthodologies existantes pour l'extraction miARN, les analyses d'expression par la Taqhomme apprêt à base de RT-PCR et ISH analyses par les sondes LNA. Au cours de l'ensemble du workflow, il est de la plus haute importance de maintenir un environnement exempt de RNase. Tous les réactifs / solutions utilisées doivent être RNAse des précautions supplémentaires doivent être utilisés dans l'ARN et d'autres réactifs de manutention. Toutes les réactions en temps réel devraient être mis en place sur la glace pour minimiser la dégradation de l'ARN.

Précis profil d'expression dans les tissus de cancer de la prostate est souvent entravée par l'hétérogénéité et la nature multifocale des lésions cancéreuses de la prostate 25. Cela peut être surmonté en utilisant une technique de capture-microdisssection laser qui permet la séparation des cellules épithéliales bénignes et malignes et réduit également la contamination du stroma, ce qui permet des analyses moléculaires en aval précises des tissus de la prostate 22,25. Nous employons LCM de tissus FFPE archivés suivis par l'expression des miARN profilage utilisant Taqman microARN essais d'expression qui a été rapporté pour être fiable. miARN profilage des tissus de LCM a Significant potentiel pour améliorer la découverte de biomarqueurs miARN. En fait, il ya un intérêt considérable dans l'analyse de tissus FFPE Considérant que ces tissus sont largement utilisés par les pathologistes pour des analyses cliniques, la préservation et l'archivage et sont facilement disponibles 3. En outre, en raison de leur petite taille et de résistance à l'activité de RNase endogène, miARN sont relativement moins touchés par la dégradation dépendant de la FFPE et sont des biomarqueurs potentiels attractifs 3. Les profils d'expression de miARN de tissus fixés au formol ont été rapportés pour être fortement corrélé à ceux des 21 tissus congelés.

Nous avons utilisé et comparé deux kits commerciaux différents pour l'extraction à partir de tissus FFPE miARN. Bien que les deux kits ont donné des ARN de haute qualité pour les analyses RT-PCR, nous avons utilisé celui qui utilise un protocole simple, rationalisée pour la purification constante de miARN et l'ARN total à partir de tissus FFPE.

L'intégrité, la pureté et la concentration de l'ARN shoulD tester avant les analyses RT-PCR. Les échantillons montrant une faible ratio A260 / A230 (<1,8) doivent être ré-précipités et ré-analysés pour la pureté avant de l'utiliser dans une réaction RT. En outre, la PCR en temps réel des analyses des tissus cliniques peuvent avoir besoin d'être optimisé. Cycle seuil (valeurs Ct)> 33 indiquent une faible amplification reflétant faible gabarit départ d'ADNc. Dans ce cas, les entrées de matrice d'ADNc peuvent être augmentées. Aussi, il est de la plus haute importance que le contrôle adéquat est utilisé pour normaliser et déterminer quantifications miRNA relatifs entre tissus normaux et tumoraux. Contrôle endogène (RNU48 / RNU24 / RNU6B) est choisi sur la base de l'uniformité de signaux d'amplification dans des conditions normales par rapport à des échantillons de tumeurs.

En outre, nous décrivons un protocole optimisé pour miRNA ISH analyse de tissus de cancer de la prostate sur la base de sondes à base d'LNA-. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée aux lames de tissu de cancer de la prostate ou des puces de tissu de cancer de prostate (TMA), ce dernier offre la puissanteial pour accélérer la découverte de biomarqueurs miARN. Ce protocole peut également être appliquée à d'autres types de tissus. Toutefois, la durée de proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment peut avoir besoin d'être optimisé. Protéinase K digestion permet à la sonde miARN d'entrer dans les cellules tout en paraformaldéhyde fixation est nécessaire pour prévenir la perte miARN suivante perméabilisation. Ce protocole, développé à l'origine pour une utilisation avec des sondes LNA 26 est optimisé pour obtenir un signal spécifique avec un fond minimale dans les tissus de la prostate. Les concentrations de sonde et les conditions d'incubation sont optimisés pour les tissus de cancer de la prostate. Nous employons 5'digoxigeninlabeledprobes à une concentration de 20-50 nM en fonction de l'abondance des miARN. Cependant, 3'digoxigeninlabeledprobes double et étiquetés (5 'et 3') des sondes marquées peuvent être substitués. En fait, deux sondes marquées offrent le potentiel pour un meilleur développement colorimétrique pour la détection de micro-ARN et sont recommandés pour une faible abondance détection miARN. En outre, la durée de blocage et les incubations d'anticorps peut être optimisée. Blocage plus est recommandé pour le fond inférieur, en particulier avec les miARN de faible abondance. Thedurationofcolor réaction avec BM substrat violet doit être étroitement surveillée. Incubations plus longues peuvent générer la coloration de fond. Habituellement, miARN abondantes exigent incubations courtes (1-2 h), tandis que moins abondante miARN sont détectés avec de plus longues incubations. Pendant ISH, il est important de veiller à ce que les coupes de tissus ne se dessèchent pas pendant l'une des étapes, car cela pourrait conduire à des artefacts de coloration.

En conclusion, bien que plusieurs études suggèrent que les miARN importants biomarqueurs du cancer de la prostate, la signification de plusieurs de ces études est souvent débattue en raison des résultats contradictoires. Ici, nous avons défini un flux de travail optimisé pour l'expression précise de miARN analyses dans les échantillons cliniques de cancer de la prostate qui ont un potentiel pour accélérer la découverte de biomarqueurs miARN comme pour le cancer de la prostate. Pendant quece flux de travail a un potentiel important de précision le profil d'expression des miARN dans les tissus cliniques sur le cancer de la prostate, il ya des limites inhérentes aux techniques employées. Low miARN abondantes peuvent être difficiles à profil avec les miARN RT-PCR optimisé et ISH analyses décrites ici. Bien que la RT-PCR profilage basé sur une plage dynamique plus large que ISH 27,28, de faibles quantités d'ARN obtenus à partir de LCM peuvent limiter la détection de faibles miARN abondantes. Détection de miARN basé ISH donne puissant information spatiale, mais ses limites sont qu'il est une technique semi-quantitative avec une plage dynamique moins 28. Cette technique repose sur sensibilité et la spécificité de sondes employées ainsi que sur l'optimisation des conditions pour l'hybridation et la détection de miARN.

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Acknowledgments

Nous remercions le Dr Roger Erickson pour son soutien et aide à la préparation du manuscrit.

Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute à la National Institutes of Health

(Grant Nombre RO1CA177984; RO1CA138642), le projet de programme de VA sur cancer de la prostate (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

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Médecine Numéro 103 microARN le cancer de la prostate tissus cliniques les analyses d'expression PCR en temps réel,
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Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

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