Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker (PCA) klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte biomarkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling. De laatste jaren microRNA (miRNAs) zijn gebleken veelbelovende alternatieve biomarkers voor prostaatkanker diagnose en prognose. De ontwikkeling van miRNAs zo effectief biomarkers voor prostaatkanker sterk afhankelijk van de nauwkeurige detectie in klinische weefsels. miRNA analyses in prostaatkanker klinische monsters is vaak een uitdaging vanwege tumor heterogeniteit, steekproeffouten, stromale vervuiling etc. Het doel van dit artikel is om een vereenvoudigde workflow beschrijven miRNA analyses in gearchiveerde FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische monsters met een combinatie van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH). Binnen deze workflow optimaliseren we de bestaande methodieken voor miRNA extractie uit FFPE en bevroren prostaat tissues en expressie geanalyseerd door Taqman-probe gebaseerde miRNA RT-PCR. Verder beschrijven we een geoptimaliseerde werkwijze voor ISH analyse formiRNA detectie in prostaatweefsel met behulp vergrendeld nucleïnezuur (LNA) - probes. De geoptimaliseerde miRNA ISH protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefselobjectglaasjes of prostaatkanker weefsel microarrays (TMA).

Introduction

Kanker van de prostaat is een algemeen diagnose mannelijke maligniteit dat is een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte bij mannen. In de VS zijn naar schatting 220.800 nieuwe gevallen en 27.540 sterfgevallen zal worden gerapporteerd in 2015 1.

Prostaatkanker is een heterogene ziekte met zeer variabele ziekte natuurlijk- tumoren kunnen indolente of zeer agressief zijn. Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte methoden / biomerkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling 2. Huidige screeningswerkwijzen omvatten prostaatspecifiek antigeen (PSA) test en een digitaal rectaal onderzoek (DRE) gevolgd door prostaatbiopsieën 3. Prostaatspecifiek antigeen (PSA) de meest gebruikte prostaatkanker biomarker die aanzienlijk revolutie klinische behandeling en verbeterde overlevingskansen 4. Vanwege inherente beperkingen van PSA waaronder lack specificiteit, PSA-screening heeft geleid tot meer diagnose en op behandeling van de ziekte. Gelet hierop, zijn intensieve inspanningen gericht op het zoeken naar alternatieve prostaatkanker biomarkers, met name die welke de agressiviteit van de ziekte kunnen voorspellen en betere beslissingen te nemen behandeling 4,5. In de afgelopen jaren, microRNAs (miRNAs) zijn ontstaan ​​als veelbelovende alternatieve prostaatkanker biomarkers.

MicroRNAs (miRNAs) vormen een evolutionair geconserveerde klasse van kleine niet-coderende RNA's die genexpressie onderdrukken post-transcriptie via sequentie-specifieke interacties met de 3'-onvertaalde gebieden (UTR) van verwante mRNA targets. Geschat wordt dat> 60% van mRNA's zijn geconserveerd doelwit van miRNAs 6. miRNA genen in intergene gebieden of binnen introns en exons eiwit / niet-eiwit coderende genen 7. Deze genen worden preferentieel getranscribeerd door RNA polymerase II in primary miRNAs (pri-miRNAs, diverse kilobasen lang) die vorm haarspeld vormige stam lus secundaire structuren. Deze pri-miRNAs worden verwerkt tot voorloper miRNAs (pre-miRNAs, 60-75 nucleotiden lang) die worden geëxporteerd naar het cytoplasma en verder verwerkt tot mature miRNAs (18-25 nucleotiden lang) 8-10. miRNAs regelen belangrijke cellulaire processen waaronder proliferatie, ontwikkeling, differentiatie en apoptose 11. Studies suggereren een wijdverspreide ontregeling van miRNA expressie profielen in verschillende menselijke maligniteiten waaronder prostaatkanker 12-15. miRNA expressie profielen zijn gemeld op grote schaal worden dysregulated in primaire en uitgezaaide prostaatkanker. Veranderde miRNA expressie in verband gebracht met prostaatkanker progressie, agressiviteit en herhaling gewezen op de prognostische mogelijkheden van miRNAs 12,14,16-19. Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal blijkt dat miRNAs spelen een belangrijke mechanistische rol bij prostaatkanker initiatie, ontwikkeling, vooruitgangion en metastase. Overall, miRNAs zijn in opkomst als veelbelovende alternatieve biomarkers voor prostaatkanker diagnose en prognose die onderscheid kunnen maken tussen normale en kanker weefsels en hulp in gelaagdheid van prostaattumoren 12. Ook miRNAs zijn belangrijke doelen voor de ontwikkeling van effectieve therapieën tegen prostaatkanker 20.

Vanwege hun kleine omvang en de weerstand tegen endogene RNase activiteit miRNAs stabiel biomarkers die gemakkelijk kan worden gedetecteerd in formaline gefixeerde weefsels 21 en prostaatbiopsieën 22. Bovendien hebben de expressie profielen van miRNAs vergeleken in bevroren en in formaline gefixeerde weefsels en zijn gevonden om sterk te zijn gecorreleerd 21. Echter, miRNA expressie profilering bij prostaatkanker klinische weefsels vaak uitdagende vanwege tumor heterogeniteit, steekproeffouten, stromale vervuiling etc. De ontwikkeling van miRNAs zo effectief biomarkers voor prostaatkanker zwaar relies hun nauwkeurige detectie in klinische weefsels. Hier beschrijven we een vereenvoudigde workflow gebruikt in ons lab voor miRNA expressie profilering in gearchiveerde FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische monsters. We gebruiken een combinatie van kwantitatieve real-time PCR en in situ hybridisatie voor miRNA analyses van klinische monsters, met de voormalige waarbij meer kwantitatieve informatie en de laatste voor het visualiseren van de differentiële expressie van miRNA potentiële biomarkers in een reeks van weefsels. Binnen deze workflow optimaliseren we de bestaande methodieken voor miRNA extractie uit FFPE en bevroren prostaat weefsels, expressie geanalyseerd door Taqman-probe gebaseerde miRNA RT-PCR en miRNA in situ hybridisatie techniek met behulp vergrendeld nucleïnezuur (LNA) gebaseerde sondes 23. LNA-probes bieden verhoogde gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met DNA- of RNA probes en maakt robuuste detectie van alle miRNA sequenties, ongeacht hun GC-gehalte en tevens discriminatie toestaantie van miRNA families. De geoptimaliseerde miRNA ISH protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefselobjectglaasjes of prostaatkanker weefsel microarrays (TMA), waarbij de laatste met het vermogen om miRNA biomarkers versnellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) of vers ingevroren prostaatkanker werden verkregen van de SFVAMC. Monsters waren van patiënten met prostaatkanker die een radicale prostatectomie bij SFVAMC onderging. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle patiënten en de studie werd goedgekeurd door de UCSF Commissie Human Research. Als alternatief werden prostaatkanker weefsels microarrays verkregen van commerciële bronnen en gebruikt voor miRNA analyses door ISH. Clinicopathologische en follow-up informatie geanalyseerd prostaatkankerpatiënten werd verzameld.

1. weefselmonsters

  1. Knip prostaatkanker weefselmonsters in 10 urn secties met behulp van een microtoom en vlek met H & E volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Beoordeel gekleurde coupes voor de identificatie van prostaatkanker foci en aangrenzend normaal klierepitheel.
    Opmerking: Een raad gecertificeerd patholoog zou de H & E gekleurde dia's en ma herzienrk voor tumor en normale gebieden. Gebruik de gemarkeerde dia's als gidsen in de volgende secties voor miRNA analyses van tumor vs normale gebieden.

2. miRNA Expression Analyses door kwantitatieve real-time PCR

Opmerking: Deze workflow omvat de volgende stappen: lasermicrodissectie, isolatie van totaal RNA (inclusief miRNA en mRNA), het testen van de volwassen miRNAs met behulp van de TaqMan MicroRNA expressie assays zoals beschreven in de volgende paragrafen.

  1. RNA-extractie
    1. Isolatie van miRNA van prostaatkanker FFPE Tissues
      1. Lasermicrodissectie (LCM)
        Opmerking: Voer de stappen 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in een chemische dampkap.
        1. Bereid weefsel dia's (10 micrometer secties) voor LCM. Deparrafinize weefselcoupes door onderdompeling in xyleen (2 x), gedurende 10 minuten elk, dan hydrateren de weefsels door het incuberen van de objectglaasjes gedurende 5 minuten elk in gegradeerde ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), gevolgd door gedestilleerd water(5 min).
        2. Volgende rehydratie, beits secties met hematoxyline gedurende 30 seconden, gevolgd door water.
        3. Plaats weefsels in gegradeerde ethanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min elk) en xyleen (5 min).
        4. Droge dia's in een zuurkast en plaats dan in het LCM instrument microdissectie.
        5. Voeren microdissections met de LCM-systeem in overeenstemming met de instructies van de fabrikant 24. Gebruik patholoog gemarkeerd dia als leidraad voor de identificatie van prostaatkanker foci en aangrenzend normaal weefsel. Met de laserstraal op een 10-20 micrometer diameter pulsen met een vermogen van 70-90 mW.
        6. Capture gebieden van belang met infrarood laserpulsen op LCM caps. Combineer cellen 2-5 caps voor miRNA extractie per monster. Om de integriteit van geëxtraheerde RNA waarborgen onmiddellijk verwerken gevangen cellen miRNA extractie.
        7. Alternatief lyseren cellen in het miRNA extractiebuffer (volgens het protocol van de fabrikant) en store lysaten bij -80 ° C.
      2. miRNA extractie en analyses van LCM gemicrodissecteerde Tissues
        1. Extract totaal RNA uit FFPE gemicrodissecteerde weefsels met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
          Opmerking: De opbrengst van RNA van laser capture miscrodissection is meestal laag. Daarom wordt RNA uitgewassen in lage volumes (20-30 pi) en worden gebruikt voor expressie profilering gebruik Taqman microRNA expressie assays volgens de instructies van de fabrikant (ook beschreven in paragraaf 2.2). Optimalisatie van invoer RNA real time PCR detectie van mature miRNAs suggereert dat 5 pl van het geëlueerde RNA optimaal is voor elke miRNA-specifieke reverse transcriptie reactie. Als endogene controle wordt RNU48 / RNU24 gebruikt. Voor controlereacties, wordt 2 pl van het geëlueerde RNA toegepast voor de reverse transcriptie reactie.
    2. Isolatie van miRNA van prostaatkanker Frozen Tissues
      1. HomogeNize bevroren weggesneden prostaatweefsel gemalen weefsel in vloeibare stikstof met een vijzel en stamper. Overdracht gehomogeniseerd weefsel een microcentrifugebuis met een gekoelde spatel. Handhaaf de vijzel / stamper en spatel bij dezelfde temperatuur door dompelen in vloeibare stikstof gehomogeniseerd, zodat weefsel kan gemakkelijk worden overgedragen.
      2. Naar commerciële guanidine isothiocyanaat-fenol reagens (1 ml / 0,1 g weefsel) aan de gehomogeniseerde weefsel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
        Opmerking: Gehomogeniseerde weefsels in de commerciële guanidine isothiocyanaat-fenol reagens kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele maanden.
      3. Chloroform Aan het homogenaat (0,2 ml chloroform / ml) toe en schud krachtig gedurende 30 seconden. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
      4. Breng de bovenste waterige fase een nieuwe steriele RNase-free 1,5 ml buis.
      5. Voeg een gelijk volume isopropylalcohol. Meng en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur, gevolgd door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C tot de RNA pellet.
      6. Zuig het supernatant en was de RNA pellet met 1 ml 70% ethanol. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
      7. Zuig het supernatant zorgvuldig. Droge RNA pellets bij kamertemperatuur 5-10 min. Ontbinden RNA in 50-100 ul nuclease-vrij water.
      8. Voer kwantificering van RNA met behulp van een spectrofotometer en NanoDrop bepalen RNA integriteit met bioanalyzer. Pas RNA concentraties 10 ng / ul. Gebruik 10-50 ng RNA voor miRNA- specifieke cDNA reactie gevolgd door real-time PCR-analyses (paragraaf 2.2).
  2. Kwantitatieve real-time PCR voor miRNA Expression Analyses
    Opmerking: Assay rijpe miRNAs behulp van een tweestaps RT-PCR protocol zoals hieronder beschreven.
    1. Reverse transcriptie (RT)
      1. Reverse transcriptie van cDNA uit RNA met een miRNA reverse transcriptie kit volgens instructies van de fabrikant.Gebruik 10-50 ng totaal RNA met miRNA specifieke primer uit de MicroRNA Testen en RT kit. Gebruik RNU48 / RNU24 / RNU6B als controles. CDNA Verdun 1: 5 tot 1:10 (afhankelijk van de abundantie van de geanalyseerde miRNA) en gebruik in real-time PCR-detectie zoals in de volgende stap.
    2. Real-time PCR voor de detectie van Mature miRNA
      1. PCR amplificeren uit cDNA monsters met de MicroRNA assays met een Fast Universal master mix volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Normaliseren monsters RNU48 / RNU24 / RNU6B controle. Met de vergelijkende methode Ct (cyclus drempelwaarde) van de relatieve veranderingen in genexpressie te berekenen op Fast Real Time PCR System. Analyseer elk monster in drievoud.

3. miRNA Expressie Analyses door in situ hybridisatie (ISH)

  1. Pre-behandeling van weefsels
    1. Snijd 5 micrometer secties van FFPE prostaatkanker weefsel blokken met behulp van een microtoom.
      2. Opmerking: Dia's kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende enkele weken miRNA analyses.
    2. Deparrafinize de weefsels door het weken de glaasjes met xyleen (2 x), gedurende 15 minuten elk.
    3. Hydrateren het weefsel met incuberen van de objectglaasjes gedurende 5 minuten elk in gegradeerde ethanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), gevolgd door gedestilleerd water (5 min).
    4. Bevestig de glaasjes met 4% paraformaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    5. Was de glaasjes met PBS (2x) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten elk.
    6. Behandel de objectglaasjes met 10 ug / ml proteïnase K bij 37 * C gedurende 10 min in voorverwarmde proteïnase K-buffer (5 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl).
    7. Na Proteinase K-behandeling, spoel de objectglaasjes met 0,2% glycine in PBS gedurende 30 sec.
    8. Was de glaasjes in PBS (1x) bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    9. Bevestig de glaasjes met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 min.
    10. Spoelen met glijbanenPBS gedurende 5 min.
  2. Hybridisatie
    1. Pre-hybridiseren de objectglaasjes met pre-hybridisatieoplossing gedurende 3-4 uur bij 55 ° C in een bevochtigde kamer. Gebruik weefsel lab doekjes gedrenkt in 50% formamide / 50% 5x SSC te houden van de kamer bevochtigd.
    2. Met 5 'digoxigenine gemerkte probes in een concentratie van 20-50 nM in hybridisatiebuffer. Verdunnen miRNA-specifieke probe (20-50 nm) en kleine nucleaire RNA U6 controle sonde (20 nM), warmte bij 90 ° C gedurende 4 minuten, plaats het op het ijs en voeg aan koude hybridisatiebuffer ijs (2-4 ng / ul ).
    3. Verwijder pre-hybridisatieoplossing, voeg hybridisatieoplossing (+ probe hybridisatie buffer, 100 pl per slide), incubeer 12-16 uur bij probe specifiek hybridisatietemperatuur (hybridisatietemperatuur = probe Tm-21 ° C). Voer hybridisaties in een bevochtigde kamer (50% formamide / 50% 5x SSC).
  3. Wassen Steps
    1. Was de glaasjes met 2 x SSC gedurende 10 minuten bij 45 ° C.
    2. Wash tglijdt hij met 1,5x SSC gedurende 10 minuten bij 45 ° C.
    3. Was de dia's met 0,2 x SSC (2x) bij 37 ° C gedurende 20 minuten elk.
    4. Incubeer dia met 1x blokkerende oplossing gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur geroerd
  4. Opsporing
    1. Incubeer de glaasjes met 1: 100 PBS verdund AP-geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam voor 1-4 uur of overnacht bij 4 ºC.
    2. Was de glaasjes met PBS (3 x) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk.
    3. Was de dia (2x) met alkalisch fosfatase buffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten elk.
    4. Incubeer de glaasjes in BM Purple AP substraat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1-20 uur.
    5. De dia's spoelen met PBS met 0,1% Tween-20 en was (2x) in water.
    6. Monteer de slides een waterig fixeermiddelen en onderzocht onder een microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Expressieprofiel van miR-203 in LCM primaire prostaatkanker klinische monsters met RT-PCR-analyses (figuur 1)

RT-PCR analyse van relatieve miR-203 expressie in LCM primaire prostaatkanker weefsels en de bijbehorende aangrenzende normale gebieden werd uitgevoerd zoals beschreven in Saini et al. 15 RNU48 werd gebruikt als controle. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de relatieve miR-203 expressie bij prostaatkanker tumor weefsel ten opzichte van de aangrenzende normale weefsels.

Vergelijking van miR-383 expressie door RT-PCR analyses gemicrodissecteerde vs laser capture microdissectie PCa weefsels (figuur 2)

Prostaatkanker weefsels werden ofwel gemicrodissecteerde onder de microscoop of werden onderworpen aan LCM gevolgd door RT-PCR analyse van miR-383 expressie in tumorweefsels ten opzichte afgestemd aangrenzend normaal tissues.Relative miR-383 expressie in tumormonstersworden shown.RNU48 werd gebruikt als controle. Zoals getoond in Figuur 2, werden verschillen waargenomen wanneer miRNA expressie werd geanalyseerd in deze weefsels. LCM heeft een voordeel boven microdissectie onder microscoop het mogelijk isoleren van een relatief zuivere populatie van prostaatweefsel en betrouwbaarder.

ISH analyse van miR-203 expressie in klinische prostaatkanker weefsels (Figuur 3)

In situ hybridisatie analyse van miR-203 expressie in normaal bot uitgezaaide prostaatkanker weefsels werd uitgevoerd zoals is beschreven in Saini et al. 15 Prostaatkankerweefsel microarray werd gebruikt voor ISH analyses gebruik 5'- DIG gemerkte LNA probes specifiek voor miR-203 en U6. Representatieve voorbeeld ISH analyses wordt weergegeven in figuur 3, een figuur gedeeltelijk gereproduceerd van Saini et al. (2011) 15 Figuur 3A en 3B showsmiR-203 expressie (links) en U6 besturingsuitdrukking (rechts) in de aangegeven weefsels. ISH signalen werden semi-kwantitatief ingedeeld op basis van de intensiteit van de kleuring en het percentage gekleurde cellen en krijgt een score van 1 tot 4. Intensiteit scores van miR-203 expressie werd gedeeld door die van U6 expressie genormaliseerd miR-203 expressieniveaus verkregen dat in figuur 3C werden uitgezet.

Figuur 1
Figuur 1: Expressie profilering van miR-203 in LCM primaire prostaatkanker klinische monsters met RT-PCR analyses. RT-PCR-analyse van relatieve miR-203 expressie in LCM-prostaatkanker weefsels en de bijbehorende aangrenzende normale gebieden. RNU48 werd gebruikt als controle. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de relatieve miR-203 expressie bij prostaatkanker tumor weefsel ten opzichte van de aangrenzende normale weefsels. Klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Vergelijking van miR-383 expressie door RT-PCR analyses gemicrodissecteerde vs. laser capture microdissectie PCa weefsels Prostaatkanker weefsels werden ofwel gemicrodissecteerde onder de microscoop of werden onderworpen aan LCM gevolgd door RT-PCR analyse van miR-383 expressie. tumorweefsels ten opzichte afgestemd aangrenzend normaal weefsel. Relatieve miR-383 uitingen in de tumor monsters worden shown.RNU48 werd gebruikt als een controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3:. ISH analyses van miR-203 expressie bij prostaatkanker klinische weefsels Dit cijfer is aangepast van 15. Weefsels werden gehybridiseerd met DIG-labegevuld vergrendeld nucleïnezuur (LNA) probes voor mir-203 en U6 (controle) zoals beschreven in 15. Representatief voorbeeld van ISH analyse van miR-203 expressie (linker panelen) en controle U6 expressie (rechts panelen) in de menselijke prostaatkanker normaal en bot metastase weefsels die verzwakt miR-203 expressie in bot uitgezaaide weefsels. ISH Representatieve voorbeelden in A bij een hogere vergroting (40X). Relatieve miR-203 expressie niveaus in normale prostaat weefsels en bot uitgezaaide prostaatkanker weefsels zoals bepaald door ISH analyse. miR-203 expressie werd gescoord, genormaliseerd tot U6 scores en uitgezet. Horizontale lijn geeft de gemiddelde waarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel beschrijven we een vereenvoudigde workflow voor miRNA expressie profilering in gearchiveerd FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische weefsels. Bij prostaatkanker, een aantal studies suggereren een belangrijke rol van microRNAs bij prostaatkanker initiatie, progressie en metastase. Echter, vaak tegenstrijdige resultaten verkregen op een specifieke miRNA 22 sinds de miRNA extractie en analyse methoden verschillen sterk. Gezien de opkomende onderzocht van de mogelijke toepassing van miRNAs als alternatieve prostaatkanker biomarkers voor prostaatkanker prognose, diagnose en therapie, is er behoefte aan miRNA expressieprofielen nauwkeurig kwantificeren klinische weefsels.

We gebruiken een combinatie van kwantitatieve real-time PCR en in situ hybridisatie voor miRNA analyses van prostaatkanker klinische monsters. Binnen deze workflow, we geoptimaliseerd de bestaande methodieken voor miRNA extractie, expressie analyse door Taqman primer op basis van RT-PCR en ISH-analyses door LNA sondes. Gedurende de gehele workflow, is het van het grootste belang dat RNase vrij milieu te handhaven. Alle reagentia / oplossingen gebruikt, moet vrij worden RNase en extra voorzichtigheid moet worden betracht bij de behandeling van RNA en andere reagentia. Alle real-time reacties moeten worden opgezet op het ijs om RNA degradatie te minimaliseren.

Nauwkeurige expressie profilering bij prostaatkanker weefsels wordt vaak bemoeilijkt door heterogeniteit en de multifocale aard van prostaatkanker laesies 25. Dit kan worden ondervangen door toepassing van een laser-capture techniek microdisssection dat de scheiding van goedaardige en kwaadaardige epitheelcellen maakt en vermindert ook stromale vervuiling, waardoor accurate downstream moleculaire analyses van prostaatweefsel 22,25. We maken gebruik van LCM van gearchiveerde FFPE weefsel gevolgd door miRNA expressie profilering met Taqman MicroRNA expressie testen die is gemeld betrouwbaar te zijn. miRNA profilering van LCM weefsels heeft significant potentieel om miRNA biomarker ontdekking verbeteren. In feite is er veel belangstelling voor de analyse FFPE weefsels aangezien deze weefsels op grote schaal gebruikt door pathologen voor klinische analyses, bewaring en archivering en zijn gemakkelijk verkrijgbaar 3. Ook vanwege hun geringe omvang en de weerstand tegen endogene RNase activiteit, miRNAs zijn relatief minder getroffen door FFPE afhankelijke degradatie en zijn aantrekkelijk mogelijke biomarkers 3. Het miRNA expressieprofielen formaline gefixeerde weefsels werden gerapporteerd sterk gecorreleerd met die van bevroren weefsels 21.

We gebruikt en vergeleken twee verschillende commerciële kits voor miRNA extractie uit FFPE weefsel. Hoewel beide kits leverden hoge kwaliteit RNA voor RT-PCR analyses gebruikten we degene die een eenvoudige, gestroomlijnde protocol gebruikt voor consistente zuivering van miRNAs en totaal RNA uit FFPE weefsels.

Integriteit, zuiverheid en de concentratie van RNA should worden getest voordat RT-PCR-analyses. Monsters toont lage A260 / A230-verhouding (<1,8) moet opnieuw geprecipiteerd en opnieuw geanalyseerd op zuiverheid voor gebruik in een RT-reactie. Ook real-time PCR-analyses van klinische weefsels kan moeten verder worden geoptimaliseerd. Drempel cyclus (Ct-waarden)> 33 duiden lage versterking reflecterende laag uitgangspunt cDNA template. In dit geval kan cDNA template inputs worden verhoogd. Ook is het van groot belang dat een adequate controle wordt gebruikt voor het normaliseren en het bepalen van relatieve kwantificering miRNA tussen normale en tumorweefsels. Endogene controle (RNU48 / RNU24 / RNU6B) gekozen gebaseerd op de uniformiteit van amplificatie signalen in normale versus tumormonsters.

Ook beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor miRNA ISH analyses van prostaatkanker weefsels gebaseerd op LNA- gebaseerde probes. Onze geoptimaliseerde miRNA ISH-protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefsel dia's of prostaatkanker tissue microarrays (TMA), waarbij de laatste offer de potenteial om miRNA biomarker ontdekking te versnellen. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere weefseltypes. Echter, kan het nodig zijn de duur van proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment worden geoptimaliseerd. Proteinase K digestie maakt de miRNA probe om in de cellen terwijl paraformaldehyde fixatie nodig miRNA verlies na permeabilisatie voorkomen. Dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik met LNA probes 26 is geoptimaliseerd voor een specifiek signaal met minimale achtergrond in prostaatweefsel krijgen. Probe concentraties en incubatieomstandigheden zijn geoptimaliseerd voor prostaatkanker weefsels. We maken gebruik 5'digoxigeninlabeledprobes in een concentratie van 20-50 nM afhankelijk van de abundantie van miRNA. Echter, 3'digoxigeninlabeledprobes en dubbele label (5 'en 3') gelabelde probes kunnen worden vervangen. In feite, tweevoudig gelabelde probes de mogelijkheid bieden betere colorimetrische ontwikkeling microRNA detectie en worden aanbevolen voor lage abundantie miRNA detectie. Ook kan de duur van blokkerend antilichaam en incubaties worden geoptimaliseerd. Langer blokkeren wordt aanbevolen voor een lagere achtergrond, in het bijzonder met een lage overvloed miRNAs. Thedurationofcolor reactie met BM paarse ondergrond moeten nauwgezet worden gecontroleerd. Langere incubaties kan background vlekken genereren. Gewoonlijk overvloedige miRNAs vereisen kortere incubaties (1-2 uur) maar minder overvloedig miRNA gedetecteerd met langere incubaties. Tijdens ISH, is het belangrijk dat de weefselcoupes niet uitdrogen tijdens een van de stappen kan leiden tot verkleuring artefacten.

Tot slot, hoewel een aantal studies suggereren miRNAs zo belangrijk prostaatkanker biomarkers, is de betekenis van een aantal van deze studies vaak gedebatteerd vanwege tegenstrijdige resultaten. Hier hebben we bepaald een optimale workflow nauwkeurige miRNA expressie analyses van prostaatkanker klinische specimens die potentieel tot de ontdekking van miRNA als biomarkers voor prostaatkanker versnellen hebben. TerwijlDeze workflow heeft een aanzienlijk potentieel om nauwkeurig profiel van miRNA meningsuiting in prostaatkanker klinische weefsels, zijn er inherente beperkingen van de gebruikte technieken. Lage overvloedige miRNAs kan moeilijk te profileren met de geoptimaliseerde miRNA RT-PCR en ISH analyses hier beschreven. Hoewel RT-PCR gebaseerde profilering heeft een groter dynamisch bereik dan ISH 27,28 kunnen vanaf verkregen van LCM hoeveelheden RNA detectie van lage overvloedige miRNAs beperken. ISH-gebaseerde detectie van miRNAs levert krachtige ruimtelijk effect de beperkingen dat het een semi-kwantitatieve techniek minder dynamisch bereik 28. Deze techniek berust op sensitiviteit en specificiteit van de sondes toegepast en ook op de optimalisatie van omstandigheden voor hybridisatie en detectie van miRNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Roger Erickson voor zijn steun en hulp bij de voorbereiding van het manuscript.

Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health

(Grant Number RO1CA177984; RO1CA138642), VA programma project over prostaatkanker (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

Tags

Geneeskunde MicroRNAs prostaatkanker klinische weefsels expressie analyses real-time PCR,
miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter