Abstract
前立腺癌（PCA）臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療のために現在使用されているバイオマーカーの不足によってもたらされています。近年では、マイクロRNA（miRNA）は、前立腺癌の診断および予後のための有望な代替バイオマーカーを浮上しています。しかし、前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてのmiRNAの開発が重く、臨床組織におけるそれらの正確な検出に依存しています。 miRNAは、多くの場合、腫瘍の不均一性、サンプリングエラー、間質汚染などのmiRNAは、組み合わせのを使用して、アーカイブFFPEや新鮮凍結前立腺癌臨床検体で分析するために、この記事の目的は、単純化されたワークフローを記述することであるために挑戦された前立腺癌臨床検体で分析します定量的リアルタイムPCR（RT-PCR）、およびインサイチュハイブリダイゼーション （ISH）。このワークフローの中で、私たちは、FFPEからのmiRNA抽出のための既存の方法論や凍結前立腺TISSUを最適化ESおよび発現は、タックマン・プローブベースのmiRNA RT-PCRにより分析します。ベースのプローブ - 加えて、我々は、ISHのための最適化された方法は、ロックされた核酸（LNA）を使用して、前立腺組織においてformiRNA検出を分析記述する。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。
Introduction
前立腺がんは男性の癌関連死亡率の主要な原因の一つである一般的に診断男性悪性腫瘍です。米国では、推定220800新たな症例と27540人の死亡は2015年1に報告されます。
前立腺癌は、腫瘍が無痛または非常に積極的であることができcourse-非常に可変性疾患を有する不均質な疾患です。前立腺癌の臨床管理における重要な課題は、疾患のスクリーニング、診断、予後および治療2のために現在使用されている方法/バイオマーカーの不足によってもたらされています。現在のスクリーニング方法は、前立腺生検3に続く前立腺特異抗原（PSA）試験及び直腸指診（DRE）が挙げられます。前立腺特異抗原（PSA）は、有意に臨床管理及び改善された生存率4に革命をもたらした最も広く使用されている前立腺癌のバイオマーカーです。しかし、LACを含むPSAの固有の制限のために特異性、PSAに基づくスクリーニングのkは診断の上、および疾患の治療の上につながっています。このビューでは、集中的な取り組みは、特に疾患の攻撃を予測し、より良い治療法の決定に4,5を駆動することができる、別の前立腺癌バイオマーカーの探索に向けられています。過去数年にわたり、マイクロRNA（miRNA）は、有望な代替前立腺癌バイオマーカーとして浮上しています。
マイクロRNA（miRNA）は、同族のmRNA標的の3 '非翻訳領域（UTR）との配列特異的相互作用を介して転写後の遺伝子発現を抑制する小さな非コードRNAの進化的に保存されたクラスを構成します。これは、mRNAの> 60％が6のmiRNAの標的を保存していると推定されます。 miRNA遺伝子は、遺伝子間領域内またはタンパク質/非タンパク質コード遺伝子のイントロン7またはエクソン内に位置しています。これらの遺伝子は優先的プリマに、RNAポリメラーゼIIによって転写されますヘアピン状のステムループ二次構造を形成RYのmiRNA（数キロベースの長いPRI-miRNAは、）。これらのpri-miRNAは、細胞質に輸送し、さらに成熟miRNA（18〜25ヌクレオチド長）8-10に加工された前駆体のmiRNA（プレmiRNAは、60〜75ヌクレオチド長）に加工されています。 miRNAは、増殖、発生、分化およびアポトーシスを11などの主要な細胞プロセスを調節します。研究では、前立腺癌12-15を含む種々のヒト悪性腫瘍におけるmiRNA発現プロファイルの広範な調節不全を示唆しています。 miRNA発現プロファイルは、広く原発性および転移性前立腺癌において異常調節されることが報告されています。改変されたmiRNAの発現は、前立腺癌の進行、攻撃性とのmiRNA 12,14,16-19の予後の可能性を強調再発とリンクされています。証拠の成長体は、miRNAが、前立腺癌の発生、発達、進行中の重要な機構的な役割を果たしていることを示していますイオンおよび転移。全体的に、miRNAは、前立腺腫瘍12の層別化に正常組織および癌組織と援助とを区別することができる前立腺癌の診断および予後のための有望な代替のバイオマーカーを浮上しています。また、miRNAは、前立腺癌20に対する有効な治療薬の開発のための重要な標的です。
その小さなサイズと、内因性RNase活性に対する抵抗性のために、miRNAは、容易に、ホルマリン固定組織21及び22の前立腺生検で検出することができる安定したバイオマーカーです。さらに、miRNAの発現プロファイルは、凍結およびホルマリン固定組織で比較されており、21強く相関することが見出されています。しかし、前立腺癌臨床組織においてmiRNA発現プロファイリングはしばしば重くRELI前立腺癌のための有効なバイオマーカーとしてなど、エラーをサンプリングする、腫瘍の不均一性に起因するmiRNAの開発を間質汚染を挑戦され臨床組織における自分の正確な検出にES。ここでは、アーカイブFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床検体でmiRNA発現プロファイリングのための私たちの研究室で使用される単純化されたワークフローについて説明します。我々は、定量的リアルタイムPCRの組み合わせを採用したmiRNAのためのin situハイブリダイゼーション旧得、より定量的な情報および組織の配列に潜在的なmiRNAバイオマーカーの発現差異を可視化するため、後者で、臨床検体の分析。このワークフローの中で、私たちはFFPE、凍結前立腺組織からのmiRNA抽出のための既存の方法論を最適化し、式はロックされた核酸（LNA）を用いたin situ ハイブリダイゼーション技術でのTaqmanプローブベースのmiRNA RT-PCRおよびmiRNAの分析により、プローブ23をベース。 LNAベースのプローブは、DNAまたはRNA-ベースのプローブと比較して増加した感度と特異性を提供し、すべてのmiRNA配列のロバストな検出を可能に関係なく、GC含量のもdiscriminaを許可miRNAファミリーのる。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、miRNAバイオマーカーの発見を加速する可能性を提供し、後者で、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）に適用することができます。
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Protocol
ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）または新鮮な凍結前立腺癌試料はSFVAMCから得ました。サンプルはSFVAMCで根治的前立腺切除術を受けた前立腺癌患者からのものでした。書面によるインフォームドコンセントがすべての患者から得られたものであり、研究はヒト研究に関するUCSF委員会により承認されました。代替的に、前立腺癌組織マイクロアレイは、商業的供給源から入手し、miRNAはISHによって分析のために使用しました。分析前立腺癌患者のための臨床病理学的およびフォローアップ情報を収集しました。
1.組織サンプル
- 製造業者のプロトコルに従ってH＆Eとのミクロトームや染色を用いて10μmの切片に前立腺癌組織サンプルをカットします。
- 前立腺がん病巣の同定のための染色スライドだけでなく、隣接する正常な腺上皮を確認します。
注意：ボード認定病理医は、H＆E染色スライドとミリアンペアを確認する必要があります腫瘍および正常領域に対するRK。 miRNAのための後続のセクションのガイドが通常のエリア対腫瘍から分析するとマークされたスライドを使用してください。
定量的リアルタイムPCRによる2 miRNA発現解析
注意：レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、（miRNAおよびmRNAを含む）全RNAを単離し、次のセクションで説明するようにTaqMan（登録商標）マイクロRNA発現アッセイを用いて、成熟miRNAのアッセイ：このワークフローは、以下の工程を含みます。
- RNA抽出
- 前立腺癌FFPE組織からのmiRNAの単離
- レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）
注：化学ヒュームフードの手順2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4を実行します。- LCMのための組織スライド（10μmのセクション）を準備します。 10分ごとに、（2×）キシレンに浸してDeparrafinize組織切片を、蒸留に続く段階的エタノール（100％、95％、90％、80％、70％）で各5分間、スライドをインキュベートすることにより組織を再水和水（5分）。
- 再水和後、30秒間ヘマトキシリンで染色のセクションでは、続いて水。
- 段階的なエタノール（70％、95％、90％、80％、70％）（各5分）およびキシレン（5分）に入れ組織。
- その後、ドライヒュームフード内スライドとは、顕微解剖用のLCM器に置きます。
- 製造元の指示24に従ってLCMシステムとmicrodissectionsを実行します。病理医が前立腺がん病巣だけでなく、隣接する正常組織の同定のためのガイドとしてスライドをマークアップされた使用します。 70〜90ミリワットの電力で10〜20ミクロンの直径のパルスのレーザービームを使用してください。
- LCMキャップ上に赤外線レーザーパルスで関心領域をキャプチャします。サンプルあたりのmiRNA抽出に2-5キャップから細胞を組み合わせます。抽出したRNAの完全性を確保するために、すぐにmiRNAの抽出のために捕獲された細胞を処理します。
- 代替的に、miRNAの抽出緩衝液中の溶解細胞（メーカーのプロトコールに従って）およびSTO-80ºCで溶解物の再。
- LCMマイクロダイセクション組織からのmiRNA抽出と分析
- 製造者の指示に従って市販のキットを使用して、顕微解剖FFPE組織から全RNAを抽出します。
注：レーザーキャプチャーmiscrodissectionからのRNAの収量は、典型的には低いです。したがって、RNAは、少量（20〜30μL）中に溶出し、製造業者の指示に従ってタックマンマイクロRNA発現アッセイを用いた発現プロファイリング（また、セクション2.2に記載されている）のために使用されます。成熟miRNAのリアルタイムPCR検出のための入力RNAの最適化は、溶出されたRNAの5マイクロリットルを各miRNA特異的逆転写反応のために最適であることを示唆しています。内因性の対照として、RNU48 / RNU24が使用されます。コントロール反応のために、溶出されたRNAの2μlの逆転写反応に使用されます。
- 製造者の指示に従って市販のキットを使用して、顕微解剖FFPE組織から全RNAを抽出します。
- レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）
- 前立腺癌凍結組織からのmiRNAの単離
- Homoge乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で組織を粉砕することにより凍結切除した前立腺組織をnize。冷却されたスパチュラを用いてマイクロチューブにホモジナイズした組織を転送します。組織は簡単に転送することができるように均質化し、液体窒素中に浸漬することにより、同じ温度で、乳鉢/乳棒とへらを維持します。
- ホモジナイズした組織に商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬（組織を1ml / 0.1 g）を加え、室温で5分間インキュベートします。
注：商業グアニジンイソチオシアネート - フェノール試薬中でホモジナイズした組織は、数ヶ月間-80ºCで保存することができます。 - ホモジネート（0.2ミリリットルのクロロホルム/ mlの）にクロロホルムを加え、30秒間激しく振ります。 4ºCで20分間10,000×gで遠心分離し、3〜5分間、室温でサンプルをインキュベートします。
- 新しい滅菌RNaseフリー1.5mlチューブに上部の水相を転送します。
- イソプロピルアルコールを等量加えます。 10マイルのために混合し、インキュベートnはRTでRNAをペレットに4ºCで20分間12,000×gで遠心分離しました。
- 上清を吸引し、70％エタノール1mLでRNAペレットを洗浄します。 4ºCで10分間12,000×gで遠心分離します。
- 慎重に上清を吸引。 5〜10分間室温で乾燥RNAペレット。 50〜100μlのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶解します。
- ナノドロップ分光光度計を用いてRNAの定量化を行い、バイオアナライザーとRNAの完全性を決定します。 10 NG /μlにRNA濃度を調整します。 PCR分析リアルタイム（2.2節）に続いてmiRNA-特異的cDNA反応のために10〜50 ngのRNAを使用してください。
- 前立腺癌FFPE組織からのmiRNAの単離
- miRNA発現解析のための定量的リアルタイムPCR
注：以下に記載されるように、二段階RT-PCRプロトコルを用いて成熟miRNAをアッセイ。- 逆転写（RT）
- 製造者の指示に従い、miRNAの逆転写キットを用いてRNAからcDNAを逆転写。マイクロRNAアッセイおよびRTキットからのmiRNA特異的プライマーを用いて全RNAの10〜50 ngのを使用してください。コントロールとしてRNU48 / RNU24 / RNU6Bを使用してください。 （分析miRNAの豊富さに応じて）1:10 5次のステップで説明するように、リアルタイムPCR検出に使用します。cDNAの1を希釈します。
- 成熟miRNAの検出のためのリアルタイムPCR
- 製造者の指示に従い、高速ユニバーサルマスターミックスを用いてマイクロRNAアッセイを用いてcDNA試料からPCR産物を増幅します。 RNU48 / RNU24 / RNU6Bコントロールにサンプルを正規化します。高速リアルタイムPCRシステム上の遺伝子発現の相対的変化を計算するために、比較Ct（閾値サイクル）メソッドを使用します。三連で各サンプルを分析します。
- 逆転写（RT）
in situハイブリダイゼーション （ISH） では 3. miRNA発現解析
- 組織の前処理
- ミクロトームを用いてFFPE前立腺癌組織ブロックから5μmの切片をカットします。
- 15分ごとに、キシレン（2×）でスライドを浸すことによって、組織をDeparrafinize。
- 蒸留水（5分間）、続いて段階的なエタノール（100％（2倍）、95％、90％、80％、70％）中で5分間ずつスライドをインキュベートすることにより組織を再水和します。
- 室温で20分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。
- それぞれ5分間、室温でPBS（2×）でスライドを洗浄します。
- 予熱したプロテイナーゼKバッファー中で10分間（5 mMのトリス塩酸pH7.4の、1mMのEDTA、1 mMのNaCl）で、37ºCで10 / mlのプロテイナーゼKでスライドを扱います。
- プロテイナーゼK処理後、30秒間、PBS中0.2％グリシンを有するスライドをすすぎます。
- 5分間室温でPBS（1×）でスライドを洗浄します。
- 15分間PBS中の4％パラホルムアルデヒドでスライドを修正しました。
- スライドをすすぎで5分間、PBS。
- 加湿チャンバー内55ºCで3〜4時間、プレハイブリダイゼーション溶液でスライドをプレハイブリダイズします。加湿チャンバーを維持するために、50％ホルムアミド/ 50％5×SSCに浸した組織ラボワイプを使用してください。
- ハイブリダイゼーション緩衝液中の20〜50 nMの濃度で5 'ジゴキシゲニン標識プローブを使用してください。 、miRNA特異的プローブ（20〜50 nM）を、小さな核RNA U6コントロールプローブ（20 nM）を希釈して4分間90ºCでの熱、氷の上に置き、冷ハイブリダイゼーション緩衝液（2-4 NG /μLを氷に追加）。
- プローブ特異的ハイブリダイゼーション温度で12〜16時間インキュベート、ハイブリダイゼーション溶液（プローブ+ハイブリダイゼーション緩衝液、スライドあたり100μl）を追加し、プレハイブリダイゼーション溶液を除去（ハイブリダイゼーション温度= Tmのプローブ-21ºC）。加湿チャンバー（50％ホルムアミド/ 50％5×SSC）でハイブリダイゼーションを行います。
- 45ºCで10分間の2×SSCでスライドを洗浄します。
- ウォッシュトン彼は45ºCで10分間1.5×SSCでスライドします。
- 20分ごとに37ºCで0.2×SSCの（2×）でスライドを洗浄します。
- 室温で1〜2時間、1×ブロッキング溶液でスライドをインキュベート
- 1でスライドをインキュベート：100 PBSを1-4時間、または一晩、4ºCでAP結合抗ジゴキシゲニン抗体を希釈しました。
- 10分ごとに、室温でPBS（3×）でスライドを洗浄します。
- 5分ごとに室温でアルカリホスファターゼバッファー（100 mMトリスpHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaCl、0.1％のTween-20）とスライド（2×）で洗浄します。
- 1-20時間室温で暗所でのBMパープルAP基質でスライドをインキュベートします。
- PBSは、水中0.1％のTween-20および洗浄（2回）を含むでスライドを洗浄します。
- メディアのマウント水溶液を使用してスライドをマウントし、顕微鏡で調べます。
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Representative Results
RT-PCRによってLCM原発性前立腺癌臨床検体におけるmiR-203の発現プロファイリング分析（図1）
RT-PCRは、LCM原発性前立腺癌組織中のmiR-203の相対的発現の分析及びコントロールとして使用したSAINI ら RNU48 15で説明したようにマッチした隣接する正常領域を行いました。以下の表は、隣接する正常組織に比べて前立腺癌腫瘍組織における相対的なのmiR-203の発現を要約したものです。
RT-PCRによるのmiR-383の発現の比較は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション対に解析する（ 図2）のPCa組織を顕微解剖
前立腺癌組織は、いずれかの顕微鏡下で顕微解剖した、またはRT-PCR、続いLCMに供した腫瘍組織中のmiR-383発現の腫瘍サンプルにおける一致隣接する正常tissues.RelativeのmiR-383発現に対して分析しますshown.RNU48を対照として使用しています。 図2に示すように、miRNA発現は、これらの組織で分析したとき、差異が観察されました。それは前立腺組織の比較的純粋な集団の単離を可能にし、より信頼性があるようにLCMは、顕微鏡下で顕微解剖上の利点を有しています。
ISHは、前立腺癌の臨床組織におけるmiR-203の発現の分析（図3）
15前立腺癌組織マイクロアレイは、ISHのために使用したら SAINIに記載されるようにインサイチュハイブリダイゼーション正常および骨転移性前立腺癌組織におけるmiR-203の発現の分析を用いて5'- DIGは、のmiR-203に特異的なLNAプローブを標識化分析を行いました。 U6。 ISHの代表的な例を分析し、図3、部分的にSAINI らから再生図に示されている。（2011）15 図3Aおよび 3B showsmiR-203 EXPRES示された組織中のシオン（左）とU6制御式（右）。 ISHシグナルは、半定量的に染色し、染色された細胞のパーセントの強度に基づいて等級分けし、正規化されたmiR-203発現レベルを得るために、U6式のもので割ったのmiR-203発現の1~4強度スコアのスコアを割り当てたこと図3Cにプロットしました。
図1：RT-PCRによるLCM原発性前立腺癌臨床検体におけるmiR-203の発現プロファイリング分析します 。 LCM-前立腺癌組織と一致した隣接する正常な領域における相対的なのmiR-203発現のRT-PCR分析。 RNU48を対照として使用しました。以下の表は、隣接する正常組織に比べて前立腺癌腫瘍組織における相対的なのmiR-203の発現をまとめています。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図2：のmiR-383発現の比較RT-PCRは、レーザーキャプチャー対顕微解剖さに分析することによっては、PCaの組織を顕微解剖前立腺癌組織は、いずれの顕微鏡下で顕微解剖し、またはRT-PCRはにおけるmiR-383の発現の分析に続いて、LCMに供しました。マッチした隣接する正常組織に比べて腫瘍組織。腫瘍サンプル中のmiR-383の相対式はshown.RNU48を対照として使用したされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3は：ISHは、前立腺癌の臨床組織におけるmiR-203の発現の分析は、この図15から変更されています。組織は、DIG-ラベとハイブリダイズさせましたmiR-203及びU6のために満たさロックド核酸（LNA）プローブベース（制御）15に記載されているように。骨転移組織における弱毒化したmiR-203発現を示すヒト前立腺癌と正常な骨転移性組織におけるmiR-203の発現（左パネル）のISH分析と制御U6式（右パネル）の代表的な例。高倍率（40倍）で、Aに示す代表的ISH例。正常前立腺組織および骨転移性前立腺癌組織中のmiR-203の相対的な発現レベルISH分析によって評価されます。 miR-203の発現は、U6のスコアに正規化スコア化し、プロットしました。水平線は平均値を表している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、アーカイブされたFFPEまたは新鮮凍結前立腺癌臨床組織中のmiRNA発現プロファイリングのための単純化されたワークフローについて説明します。前立腺癌では、いくつかの研究は、前立腺癌の開始、進行および転移におけるマイクロRNAの重要な役割を示唆しています。しかし、矛盾する結果は、多くの場合、miRNAを抽出するので、特定のmiRNA 22で得られると方法は広く異なって分析されています。前立腺癌の予後、診断および治療のための代替的な前立腺癌のバイオマーカーとしてのmiRNAの潜在的なアプリケーションをサポートする新たな証拠を考慮して、正確な臨床組織におけるmiRNA発現プロファイルを定量する必要があります。
我々は、定量的リアルタイムPCRの組み合わせを採用したmiRNAのためのin situハイブリダイゼーションにおける前立腺癌の臨床検体の分析。このワークフローの中で、我々はmiRNAの抽出のための既存の方法を最適化し、表現は、Taqによって分析しますRT-PCRおよびISHベースの男プライマーは、LNAプローブによって分析します。ワークフロー全体の間に、RNaseを含まない環境を維持することが最も重要です。使用される全ての試薬/ソリューションは、RNaseフリーすべきであり、特別な注意は、RNAおよび他の試薬の処理に使用されるべきです。すべてのリアルタイムの反応はRNA分解を最小限に抑えるために氷の上に設定する必要があります。
前立腺癌組織における正確な発現プロファイリングは、しばしば不均質および前立腺癌病変25の多焦点性質によって妨げられています。これは、前立腺組織22,25の正確な下流分子の分析を可能にする、良性および悪性の上皮細胞の分離を可能にし、また間質汚染を低減レーザーキャプチャーmicrodisssection技術を用いて克服することができます。我々は、信頼できると報告されているマイクロRNA発現のTaqmanアッセイを用いてプロファイリングmiRNA発現に続いて、アーカイブFFPE組織のLCMを使用します。 LCM組織のmiRNAプロファイリングはsignifましたicant可能性は、miRNAバイオマーカーの発見を強化します。実際には、これらの組織が 広く臨床分析、保存、およびアーカイブのために病理学者によって使用され、3容易に入手可能であることを考慮するとFFPE組織を分析することにかなりの関心が寄せられています。また、そのサイズが小さいと、内因性RNase活性に対する抵抗性のために、miRNAは比較的少ないFFPE依存的分解の影響を受けており、魅力的な潜在的なバイオマーカー3です。ホルマリン固定組織のmiRNA発現プロファイルが強く凍結組織21のものと相関することが報告されています。
我々は、使用し、FFPE組織からのmiRNA抽出のための2つの異なる市販のキットを比較しました。 RT-PCR分析のために、両方のキットは、高品質のRNAが得られますが、私たちは、miRNAの一貫した精製およびFFPE組織からの全RNAのためのシンプルな、合理化されたプロトコルを使用するものを使用します。
整合性、純度及びRNA shoulの濃度RT-PCR分析前にテストさdは。低A260 / A230比（<1.8）を示すサンプルは、RT反応に使用する前に再沈殿させ、純度を再分析する必要があります。また、リアルタイムPCRは、さらに最適化する必要がある場合があり、臨床的組織の分析。閾値サイクル（Ct値）が> 33、低出発cDNA鋳型を反映低い増幅を示します。この場合には、cDNA鋳型入力を増加させることができます。また、それは、適切な制御が正常化し、正常組織および腫瘍組織との間の相対的なmiRNAの定量を決定するために使用されることが最も重要です。内因性コントロール（RNU48 / RNU24 / RNU6B）は腫瘍サンプル対正常で増幅シグナルの均一性に基づいて選択されます。
また、私たちがmiRNA ISH用に最適化されたプロトコルを記述することはLNA-ベースのプローブに基づいて、前立腺癌組織の分析。我々の最適化されたmiRNAのISHプロトコールは、後者が、強力に提供して、前立腺癌組織スライドまたは前立腺癌組織マイクロアレイ（TMA）を適用することができますmiRNAバイオマーカーの発見を加速するIAL。このプロトコルは、他の組織タイプに適用することができます。しかし、proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatmentの持続時間を最適化する必要があるかもしれません。プロテイナーゼK消化はパラホルムアルデヒド固定は、透過性、以下のmiRNAの損失を防ぐために必要とされている間のmiRNAプローブは、細胞内に取得することができます。もともとLNAプローブ26で使用するために開発されたこのプロトコルは、前立腺組織における最小限の背景を持つ特定の信号を得るために最適化されています。プローブ濃度およびインキュベーション条件は、前立腺癌組織のために最適化されます。私たちは、miRNAの豊富に応じて20〜50 nMの濃度で5'digoxigeninlabeledprobesを採用しています。しかし、3'digoxigeninlabeledprobesデュアル（5 'および3'）を標識したプローブを置換することができる標識されました。実際には、二重標識プローブは、マイクロRNA検出のためのより良い比色発展の可能性を提供し、低量のmiRNA検出のために推奨されています。さらに、ブロッキング及び抗体インキュベーションの期間は、最適化することができます。長いブロッキングは、特に低存在量のmiRNAと、下のバックグラウンドをお勧めします。 BMパープル基板とThedurationofcolor反応が密接に監視する必要があります。長いインキュベーションは、バックグラウンド染色を生成することができます。あまり豊富miRNAが長いインキュベーションで検出されている間通常、豊富なmiRNAは短いインキュベーション（1〜2時間）が必要です。 ISHの間に、これは染色のアーティファクトにつながる可能性として組織切片をステップのいずれかの間に乾燥させないようにすることが重要です。
いくつかの研究は、重要な前立腺癌のバイオマーカーとしてのmiRNAを示唆しても結論として、これらの研究のいくつかの重要性は、しばしば矛盾する結果に議論されます。ここでは、定義した正確なmiRNA発現のために最適化されたワークフローは、前立腺癌のためのバイオマーカーとしてのmiRNAの発見を加速する可能性を秘めている前立腺癌臨床検体で分析します。一方このワークフローは、前立腺癌臨床組織における正確プロファイルmiRNAの発現に大きな可能性を持って、使用される技術の固有の制限があります。低豊富なmiRNAは、最適化されたmiRNAのRT-PCRおよびISHをプロファイリングすることは困難であり、ここで説明した分析。 RT-PCRに基づくプロファイリングはISH 27,28よりも広いダイナミックレンジを持っていますが、LCMから得られた低RNAの量は、低豊富なmiRNAの検出を制限することができます。 miRNAのISHベースの検出は、しかし、その限界は、それが低いダイナミックレンジ28と半定量的手法であるということである、強力な空間情報が得られます。この技術は、miRNAのハイブリダイゼーションおよび検出のための条件の最適化にも使用し、プローブの感度および特異性に依存しています。
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Acknowledgments
私たちは、原稿の準備と彼のサポートと支援のための博士ロジャーエリクソンに感謝します。
この作品は、 国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました
（認可番号RO1CA177984; RO1CA138642）、前立腺癌（BX001604）のVAプログラムプロジェクト。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
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