miRNA Expression Analyser i Prostate Cancer kliniska vävnader

Abstract

En kritisk utmaning i prostatacancer (PCA) klinisk behandling ställs av otillräckliga för närvarande används biomarkörer för sjukdomsscreening, diagnos, prognos och behandling. Under senare år har mikroRNA (miRNA) framträtt som lovande alternativa biomarkörer för prostatacancer diagnos och prognos. Men utvecklingen av miRNA som effektiva biomarkörer för prostatacancer är starkt beroende av deras noggrann detektering i kliniska vävnader. miRNA analyser i prostatacancer kliniska prover ofta utmanande på grund av tumör heterogenitet, urvalsfel, förorening stromal etc. Målet med denna artikel är att beskriva en förenklad arbetsflöde för miRNA analyser i arkiverad FFPE eller fryst prostatacancer kliniska prover med hjälp av en kombination av kvantitativ realtids-PCR (RT-PCR) och in situ-hybridisering (ISH). Inom detta arbetsflöde, vi optimera de befintliga metoderna för miRNA extraktion från FFPE och frysta prostata tissues och uttryck analyser av Taqman-prob baserad miRNA RT-PCR. Dessutom beskriver vi en optimerad metod för ISH analyserar formiRNA detektion i prostatavävnad med hjälp av låst nukleinsyra (LNA) - baserade prober. Vår optimerade miRNA ISH protokollet kan tillämpas på prostatacancer vävnad diabilder eller prostatacancer vävnad microarrays (TMA).

Introduction

Cancer i prostatakörteln är en mycket gemensamt diagnostiserade manliga malignitet som är en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad dödlighet bland män. I USA, uppskattningsvis 220,800 nya fall och 27,540 dödsfall kommer att redovisas under 2015 ^1.

Prostatacancer är en heterogen sjukdom med mycket varierande sjukdom kurs- tumörer kan vara loj eller mycket aggressiv. En kritisk utmaning i prostatacancer klinisk behandling ställs av otillräckliga för närvarande används metoder / biomarkörer för sjukdomsscreening, diagnos, prognos och behandling ^2. Nuvarande screeningmetoder innefattar prostataspecifikt antigen (PSA) testning och en digital rectal undersökning (DRE) följt av prostatabiopsier ^3. Prostataspecifikt antigen (PSA) är den mest använda prostatacancer biomarkör som väsentligt har revolution klinisk behandling och förbättrade överlevnad ^4. Men på grund av inneboende begränsningar av PSA inklusive lack från specificitet, PSA baserad screening har lett till över diagnos och över behandling av sjukdomen. Mot bakgrund av detta, är ett intensivt arbete är riktad mot ett sökande efter alternativa prostatacancer biomarkörer, särskilt sådana som kan förutsäga aggressiviteten av sjukdomen och kör bättre behandlingsbeslut ^4,5. Under de senaste åren har mikroRNA (miRNA) dykt upp som lovande alternativa prostatacancer biomarkörer.

MicroRNAs (miRNA) utgör ett evolutionärt konserverad klass av små icke-kodande RNA som hämmar genuttryck efter transkription via sekvensspecifika interaktioner med 3'- otranslaterade regioner (UTR) av besläktade mRNA-mål. Det uppskattas att> 60% av mRNA bevaras mål för miRNA ^6. miRNA gener är belägna i intergeniska regioner eller inom introner eller exoner av protein / icke-proteinkodande generna ^7. Dessa gener är företrädesvis transkriberas av RNA-polymeras II i primary miRNA (pri-miRNA flera kilobaser lång) som bildar hårnålsformiga spindeln loop sekundära strukturer. Dessa pri-miRNA bearbetas till föregångare miRNAs (pre-miRNA, 60-75 nukleotider lång) som exporteras till cytoplasman och bearbetas vidare till mogna miRNA (18-25 nukleotider lång) ^8-10. miRNAs reglerar viktiga cellulära processer, inklusive spridning, utveckling, differentiering och apoptos ^11. Studier tyder på en utbredd dysreglering av miRNA uttryck profiler i olika humana maligniteter inklusive prostatacancer ^12-15. miRNA uttryck profiler har rapporterats vara allmänt oreglerad inom primärvården och metastaserande prostatacancer. Förändrad miRNA uttryck har kopplats med prostatacancer progression, aggressivitet och återfall belysa prognostiska potential miRNA ^12,14,16-19. En växande mängd bevis tyder på att miRNAs spela viktiga mekanistiska roller i prostatacancer inledande utveckling, framstegjon och metastas. Sammantaget miRNA växer fram som lovande alternativa biomarkörer för prostatacancer diagnos och prognos som kan skilja mellan normala och cancervävnader och stöd skiktning av prostatatumörer ^12. Även miRNAs är viktiga mål för utveckling av effektiva läkemedel mot prostatacancer ^20.

På grund av sin ringa storlek och motståndskraft mot endogen RNas aktivitet miRNAs är stabila biomarkörer som lätt kan detekteras i formalinfixerade vävnader ²¹ och prostatabiopsier ^22. Dessutom har uttryck profiler av miRNA jämförts i frysta och formalinfixerade vävnader och har visat sig vara starkt korrelerade ^21. Dock är miRNA uttryck profilering i prostatacancer kliniska vävnader ofta utmanande på grund av tumör heterogenitet, urvalsfel, förorening stromal etc. Utvecklingen av miRNA som effektiva biomarkörer för prostatacancer kraftigt relies på deras noggrann detektering i kliniska vävnader. Här beskriver vi en förenklad arbetsflöde som används i vårt labb för miRNA uttryck profilering i arkiverad FFPE eller fryst prostatacancer kliniska prover. Vi använder en kombination av kvantitativ realtids-PCR och in situ hybridisering för miRNA analyser av kliniska prover, med den förstnämnda ger mer kvantitativ information och den senare för att visualisera det differentiella uttrycket av potentiella miRNA biomarkörer i en rad vävnader. Inom detta arbetsflöde, vi optimera de befintliga metoderna för miRNA extraktion från FFPE och frysta prostatavävnad, analyserar uttryck av Taqman-prob baserad miRNA RT-PCR och miRNA in situ hybridisering teknik med hjälp av låst nukleinsyra (LNA) -baserade sonder ^23. LNA-baserade prober erbjuder ökad känslighet och specificitet jämfört med DNA- eller RNA- baserade prober och möjliggör robust detektering av alla miRNA sekvenser, oavsett GC-innehåll och även tillåta disning av miRNA familjer. Vår optimerade miRNA ISH protokollet kan tillämpas på prostatacancer vävnad diabilder eller prostatacancer vävnad microarrays (TMA), med den senare erbjuder möjlighet att accelerera miRNA biomarkörer.

Protocol

Formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) eller fryst prostatacancerprover erhölls från SFVAMC. Prover från prostatacancerpatienter som genomgick radikal prostatektomi på SFVAMC. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter och studien godkändes av UCSF utskottet för humanforskning. Alternativt, var prostatacancer vävnader mikromatriser anskaffas från kommersiella källor och används för miRNA analyser genom ISH. Klinisk-patologisk och följa upp information analyserade prostatacancerpatienter samlades.

1. Vävnads Prover

1. Skär prostata cancer vävnadsprover i 10 ìm sektioner med hjälp av en mikrotom och fläcken med H & E följa tillverkarens protokoll.
2. Granska färgade diabilder för identifiering av prostatacancer fokus liksom angränsande normal körtelepitel.
   Obs: En certifierad patolog bör granska H & E färgade diabilder och mark för tumör och normala områden. Använd de markerade bilderna som guider i de efterföljande avsnitten för miRNA analyser från tumör vs normala områden.

2. miRNA Expression Analyser av kvantitativ realtids-PCR

Obs: Det här arbetsflödet omfattar följande steg: Laser Capture microdissection, isolering av totalt RNA (inklusive miRNA och mRNA), analys av mogna miRNA med hjälp av TaqMan mikroRNA expressionsanalyser som beskrivs i följande avsnitt.

1. RNA-extraktion
   1. Isolering av miRNA från Prostate Cancer FFPE vävnader
      1. Laser capture microdissection (LCM)
         Obs: Utför steg 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 i en kemisk draghuv.
         1. Förbered vävnad diabilder (10 um sektioner) för LCM. Deparrafinize vävnadssnitt genom att blötlägga i xylen (2 x), för 10 min vardera, sedan rehydrera vävnaderna genom att inkubera objektglasen i 5 minuter vardera i graderad etanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) följt av destillerat vatten(5 min).
         2. Efter rehydrering, fläck sektioner med hematoxylin under 30 sekunder följt av vatten.
         3. Placera vävnader i graderad etanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min vardera) och xylen (5 min).
         4. Torra glasen i ett dragskåp och sedan placera i LCM instrumentet för microdissection.
         5. Utför microdissections med LCM systemet i enlighet med tillverkarens anvisningar ^24. Använd patolog märkt upp diabilder som guider för identifiering av prostatacancer fokus liksom angränsande normal vävnad. Använd laserstrålen mot en pulser um diameter 10-20 med en effekt på 70-90 mW.
         6. Fånga områden av intresse med infraröda laserpulser på LCM caps. Kombinera celler från 2-5 landskamper för miRNA extraktion per prov. För att säkerställa integriteten av extraherat RNA omedelbart behandla infångade cellerna för miRNA extraktion.
         7. Alternativt lyserar celler i miRNA extraktionsbuffert (enligt tillverkarens protokoll) och store lysat vid -80 ° C.
      2. miRNA Utvinning och Analyser från LCM microdissected vävnader
         1. Utdrag totalt RNA från microdissected FFPE vävnader med hjälp av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner.
            Obs: Utbytet av RNA från laser capture miscrodissection är vanligtvis lågt. Därför är RNA eluerades i låga volymer (20-30 pl) och används för expression profiling använder Taqman mikroRNA expressionsanalyser efter tillverkarens instruktioner (även beskrivs i avsnitt 2.2). Optimering av ingångs RNA för realtids PCR-detektion av mogna miRNA tyder på att 5 pl av den eluerade RNA är optimal för varje miRNA-specifika omvänd transkriptionsreaktion. Som en endogen kontroll, är RNU48 / RNU24 används. För kontrollreaktioner, är 2 ^ il av den eluerade RNA: t användes för den omvända transkriptionsreaktionen.
   2. Isolering av miRNA från Prostate Cancer Frysta vävnader
      1. Homogenize frysta resekterade prostatavävnader genom målning av vävnaderna i flytande kväve med användning av en mortel och mortelstöt. Överför homogeniserad vävnad till ett mikrocentrifugrör med hjälp av en kyld spatel. Bibehålla mortel / mortelstöt och en spatel vid samma temperatur genom doppning i flytande kväve så homogeniserad vävnad kan enkelt överföras.
      2. Lägg kommersiell guanidinisotiocyanat-fenolreagens (1 ml / 0,1 g vävnad) till den homogeniserade vävnaden och inkubera vid rumstemperatur under 5 minuter.
         Obs: Homogeniserade vävnader i kommersiella guanidinisotiocyanat-fenolreagens kan lagras vid -80 ° C i flera månader.
      3. Lägg kloroform till homogenatet (0,2 ml kloroform / ml) och skaka kraftigt i 30 sekunder. Inkubera proverna vid RT i 3-5 min följt av centrifugering vid 10000 xg under 20 min vid 4 ° C.
      4. Överför den övre vattenhaltiga fasen till ett färskt sterilt RNas-fri 1,5 ml rör.
      5. Tillsätt en lika volym av isopropylalkohol. Blanda och inkubera under 10 min vid RT, följt av centrifugering vid 12 tusen xg under 20 min vid 4 ° C för pelletering av RNA.
      6. Aspirera supernatanten och tvätta RNA-pelleten med en ml 70% etanol. Centrifugera vid 12.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
      7. Försiktigt aspirera supernatanten. Torra RNA pellets vid RT under 5-10 min. Lös RNA i 50-100 l nukleasfritt vatten.
      8. Utför kvantifiering av RNA med användning av en Nanodrop spektrofotometer och bestämma RNA-integritet med en Bioanalyzer. Justera RNA koncentrationer 10 ng / l. Använd 10-50 ng RNA för miRNA- specifik cDNA reaktionen följt av realtids-PCR-analyser (avsnitt 2.2).
2. Kvantitativ realtids-PCR för miRNA Expressionsanalyser
   Obs: Analys mogna miRNA med användning av en två-stegs RT-PCR-protokoll som beskrivs nedan.
   1. Omvänd transkription (RT)
      1. Omvänd transkribera cDNA från RNA med hjälp av en miRNA omvänd transkription kit i enlighet med tillverkarens anvisningar.Använd 10-50 ng av totalt RNA med miRNA specifik primer från mikroRNA Assays och RT kit. Använd RNU48 / RNU24 / RNU6B som kontroller. Späd cDNA 1: 5 till 1:10 (beroende på det överflöd av det analyserade miRNA) och användning i realtid PCR-detektion som beskrivs i följande steg.
   2. Realtids-PCR för detektion av mogna miRNA
      1. Amplify PCR-produkter från cDNA prover med hjälp av mikroRNA-analyser med en snabb Universal masterblandning i enlighet med tillverkarens instruktioner. Normalisera prover till RNU48 / RNU24 / RNU6B kontroll. Använd jämförande Ct (tröskelcykel) för att beräkna relativa förändringar i genuttryck på Fast Real Time PCR System. Analysera varje prov i triplikat.

3. miRNA Expression Analyser av in situ hybridisering (ISH)

1. Förbehandling av vävnader
   1. Skär 5 um sektioner från FFPE prostatacancer vävnadsblock med hjälp av en mikrotom.
   Notera: Objektglas kan förvaras vid rumstemperatur under flera veckor för miRNA analyser.
   2. Deparrafinize vävnaderna genom blötläggning glasen med xylen (2 x), för 15 min vardera.
   3. Rehydrera vävnaderna genom att inkubera objektglasen i 5 minuter vardera i graderad etanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) följt av destillerat vatten (5 min).
   4. Fäst objektglasen med 4% paraformaldehyd i PBS vid rumstemperatur under 20 minuter.
   5. Tvätta bilderna med PBS (2x) vid rumstemperatur under 5 min vardera.
   6. Behandla glasen med 10 | ig / ml proteinas K vid 37 ° C i 10 min i förvärmda proteinas K-buffert (5 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCI).
   7. Efter Proteinas-K-behandling, skölj glasen med 0,2% glycin i PBS under 30 sek.
   8. Tvätta objektglasen i PBS (1x) vid rumstemperatur under 5 minuter.
   9. Fäst objektglasen med 4% paraformaldehyd i PBS under 15 minuter.
   10. Skölj objektglasen medPBS under 5 minuter.
2. Hybridisering
   1. Förhands hybridisera glasen med pre-hybridiseringslösning för 3-4 h vid 55 ° C i en fuktig kammare. Använd vävnads lab våtservetter indränkt i 50% formamid / 50% 5 x SSC för att hålla kammaren befuktas.
   2. Använd 5 'digoxigenin märkta prober vid en koncentration av 20 till 50 nM i hybridiseringsbuffert. Späd miRNA-specifik sond (20-50 nM) och snrna U6 kontrollsond (20 nM), värme vid 90 ° C under 4 min, placera den på is, och lägg till iskall hybridiseringsbuffert (2-4 ng / l ).
   3. Ta bort pre-hybridisering lösning, tillsätt hybridisering lösning (sond + hybridiseringsbuffert, 100 ul per bild), inkubera under 12-16 timmar vid sond-specifik hybridisering temperatur (Hybridiseringstemperaturen = Tm probe-21 ° C). Utför hybridiseringar i en fuktig kammare (50% formamid / 50% 5 x SSC).
3. Tvättsteg
   1. Tvätta bilderna med 2x SSC under 10 min vid 45 ° C.
   2. Tvätta than glider med 1,5x SSC under 10 minuter vid 45 ° C.
   3. Tvätta bilderna med 0,2x SSC (2x) vid 37 ° C i 20 minuter vardera.
   4. Inkubera objektglasen med 1x blockeringslösningen under 1-2 timmar vid rumstemperatur
4. Detektion
   1. Inkubera glasen med 1: 100 PBS utspädd AP-konjugerat anti-digoxigenin antikropp för 1-4 timmar eller över natten vid 4 ° C.
   2. Tvätta bilderna med PBS (3 x) vid rumstemperatur under 10 min vardera.
   3. Tvätta bilderna (2x) med alkaliskt fosfatas-buffert (100 mM Tris pH 9,5, 50 _mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) vid RT under 5 min vardera.
   4. Inkubera objektglasen i BM Lila AP-substrat i mörker vid RT under 1-20 h.
   5. Skölj objektglasen med PBS innehållande 0,1% Tween-20 och tvättvätskan (2x) i vatten.
   6. Montera bilderna med hjälp av en vatten montering media och undersök provet i ett mikroskop.

Representative Results

Expression profilering av miR-203 i LCM primära prostatacancer kliniska prover genom RT-PCR-analyser (Figur 1)

RT-PCR-analyser av relativ MIR-203-expression i LCM primära prostatacancervävnader och de avstämda intilliggande normala regioner utfördes såsom beskrivits i Saini et al. ¹⁵ RNU48 användes som en kontroll. Tabellen nedan sammanfattar den relativa miR-203 uttryck i prostatacancertumörvävnader i förhållande till intilliggande normala vävnader.

Jämförelse av miR-383-expression genom RT-PCR-analyser i microdissected vs laser capture microdissected PCA vävnader (Figur 2)

Prostatacancervävnader var antingen microdissected under mikroskop eller utsattes för LCM följt av RT-PCR-analyser av MIR-383-expression i tumörvävnader i förhållande till matchad närliggande normal tissues.Relative MIR-383-expression i tumörproverär shown.RNU48 användes som kontroll. Såsom visas i fig 2, har skillnader observerades när miRNA uttryckning analyserades i dessa vävnader. LCM har en fördel framför mikrodissektion under mikroskop eftersom det medger isolering av en relativt ren population av prostatavävnader och är mer tillförlitlig.

ISH analyser av miR-203 uttryck i prostatacancer kliniska vävnader (Figur 3)

Hybridisering in situ-analyser av MIR-203-expression i normala och ben metastaserande prostatacancer vävnader utfördes såsom beskrivs i Saini et al. ¹⁵ Prostatacancer vävnadsmikromatris användes för ISH-analyser med användning av 5'-DIG-märkta LNA-prober specifika för MIR-203 och U6. Representativa exempel på ISH-analyser visas i figur 3, en siffra delvis reproduceras från Saini et al., (2011) ¹⁵ Figur 3A och 3B showsmiR-203 expressionen (vänster) och U6 kontroll uttryck (till höger) i de angivna vävnaderna. ISH signaler var halv kvantitativt graderas baserat på intensiteten av färgningen och procent av färgade celler och tilldelas en poäng på 1 till 4. Intensitet mängder av miR-203 uttryck delades av fack U6 uttryck för att erhålla normaliserade miR-203 expressionsnivåer som plottades i fig 3C.

Figur 1: Expression profilering av miR-203 i LCM primära prostatacancer kliniska prover genom RT-PCR-analyser. RT-PCR-analys av relativ miR-203 uttryck i LCM-prostatacancervävnader och matchade intilliggande normala områden. RNU48 användes som kontroll. Tabellen nedan sammanfattar den relativa miR-203 uttryck i prostatacancer tumörvävnader i förhållande till intilliggande normala vävnader. Klicka häratt se en större version av denna siffra.

Figur 2: Jämförelse av miR-383 uttryck genom RT-PCR-analyser i microdissected kontra laser capture microdissected PCA vävnader Prostatacancer vävnader antingen microdissected under mikroskop eller utsattes för LCM följt av RT-PCR-analyser av miR-383 uttryck i. tumörvävnader relativt matchade intilliggande normala vävnader. Relativa miR-383 uttryck i tumörprover shown.RNU48 användes som en kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3:. ISH analyser av miR-203 uttryck i prostatacancer kliniska vävnader Denna siffra har ändrats ^från 15. Vävnader hybridiserades med DIG-labelled låst nukleinsyra (LNA) baserade prober för mir-203 och U6 (kontroll) såsom beskrivs i ^15. Representativt exempel på ISH analys av miR-203 uttryck (vänster paneler) och kontroll U6 uttryck (höger sida) i human prostatacancer normala och ben metastaserande vävnader visar dämpas miR-203 uttryck i ben metastatiska vävnader. Representativa ISH exemplen som visas i A vid en högre förstoring (40X). Relativa miR-203 uttrycksnivåer i normala prostatavävnad och ben metastaserande prostatacancer vävnader fastställdes genom ISH analys. miR-203 uttryck gjorde, normaliserat till U6 poäng och ritas. Horisontella linjen representerar medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I den här artikeln beskriver vi ett förenklat arbetsflöde för miRNA uttryck profilering i arkiverade FFPE eller fryst prostatacancer kliniska vävnader. I prostatacancer, flera studier tyder på en viktig roll mikroRNA i prostatacancer initiering, progression och metastasering. Men motstridiga resultat ofta erhålls på en specifik miRNA ²² eftersom miRNA utvinning och analyserar metoder varierar kraftigt. Mot bakgrund av den framväxande bevis för den möjliga tillämpningen av miRNA som alternativa prostatacancer biomarkörer för prostatacancer prognos, diagnos och terapi, det finns ett behov av att noggrant kvantifiera miRNA uttryck profiler i kliniska vävnader.

Vi använder en kombination av kvantitativ realtids-PCR och hybridisering in situ för miRNA analyser av prostatacancer kliniska prover. Inom detta arbetsflöde, optimerad vi befintliga metoder för miRNA utvinning, analyserar uttryck av TaqMannen primer baserad RT-PCR och ISH analyser av LNA sonder. Under hela arbetsflödet, är det av yttersta vikt att upprätthålla en RNas fri miljö. Alla reagens / lösningar som används bör RNas fritt och extra försiktighet bör iakttas vid hantering av RNA och andra reagens. Alla realtid reaktioner bör inrättas på is för att minimera RNA nedbrytning.

Exakt uttrycksprofilering i prostatacancervävnader hindras ofta av heterogenitet och den multifokala karaktären av prostatacancer lesioner ^25. Detta kan övervinnas genom användning av en laser-infångnings microdisssection teknik som möjliggör separation av benigna och maligna epitelceller och minskar också förorening stromaceller, vilket möjliggör noggranna nedströms molekylära analyser av prostatavävnader ^22,25. Vi använder LCM av arkiverade FFPE vävnader följt av miRNA uttryck profilering med hjälp av Taqman mikroRNA expressionsanalyser som har rapporterats vara tillförlitliga. miRNA profilering av LCM vävnader har Signifdande potential för att förbättra miRNA biomarkörer. I själva verket finns det ett stort intresse för att analysera FFPE vävnader med tanke på att dessa vävnader används flitigt av patologer för kliniska analyser, bevarande och arkivering och lätt ^{tillgängligt} 3. Också på grund av sin ringa storlek och motståndskraft mot endogen RNas aktivitet miRNAs är relativt mindre påverkade av FFPE beroende nedbrytning och är attraktiva potentiella biomarkörer ^3. Mirna uttryck profiler av formalinfixerade vävnader har rapporterats vara starkt korrelerad med de frysta vävnader ^21.

Vi har anställt och jämfört två olika kommersiella kit för miRNA extraktion från FFPE vävnader. Även om båda satser gav hög kvalitet RNA för RT-PCR-analyser, använde vi en som använder ett enkelt, strömlinjeformad protokoll för konsekvent rening av miRNA och totalt RNA från FFPE vävnader.

Integritet, renhet och koncentration av RNA should testas innan RT-PCR-analyser. Prover visar låg A260 / A230 förhållandet (<1,8) bör återutfälldes och återanalyserades med avseende på renhet innan de används i en RT-reaktionen. Även realtids-PCR-analyser av kliniska vävnader kan behöva ytterligare optimeras. Tröskelcykeln (Ct-värden)> 33 indikerar låg förstärkning återspeglar låg start cDNA mall. I detta fall kan cDNA mall ingångar ökas. Dessutom är det av yttersta vikt att tillräcklig kontroll används för att normalisera och bestämma relativa miRNA kvantifieringar mellan normal och tumörvävnad. Endogent kontroll (RNU48 / RNU24 / RNU6B) väljs baserat på likformigheten i förstärkningssignaler i normalt kontra tumörprover.

Dessutom beskriver vi en optimerad protokoll för miRNA ISH analyser av prostatacancervävnader baserade på LNA- baserade prober. Vår optimerade miRNA ISH protokollet kan tillämpas på prostatacancer vävnad diabilder eller prostatacancer vävnad microarrays (TMA), med den sistnämnda erbjudande den potentaIAL att påskynda miRNA biomarkörer. Detta protokoll kan också tillämpas på andra typer av vävnad. Emellertid kan varaktigheten av proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment måste optimeras. Proteinas K-spjälkning gör att miRNA sond för att komma in i cellerna medan paraformaldehyd fixering behövs för att förhindra miRNA förlust efter permeabilization. Detta protokoll, som ursprungligen utvecklats för att användas med LNA sonder ²⁶ är optimerad för att få en specifik signal med minimal bakgrund i prostatavävnad. Sond koncentrationer och inkubationsbetingelser är optimerade för prostatacancervävnader. Vi använder 5'digoxigeninlabeledprobes vid en koncentration av 20 till 50 nM beroende på överflöd av miRNA. Emellertid 3'digoxigeninlabeledprobes och dubbla märkt (5 'och 3') märkta sönder kan vara substituerade. I själva verket, dubbla märkta prober har potential för en bättre kolorimetrisk utveckling för mikroRNA detektering och rekommenderas för låg förekomst miRNA upptäckt. Dessutom kan varaktigheten av blockerande och antikropps inkubationer optimeras. Längre blockering rekommenderas för lägre bakgrund, i synnerhet med låga överflöd miRNAs. Thedurationofcolor reaktion med BM lila substrat bör övervakas noga. Längre inkubationer kan generera bakgrundsfärgning. Vanligtvis, riklig miRNAs kräver kortare inkubationer (1-2 hr) medan mindre riklig miRNA detekteras med längre inkubationer. Under ISH, är det viktigt att se till att de vävnadssnitt inte torkar ut under något av stegen eftersom detta kan leda till färgning artefakter.

Sammanfattningsvis, om flera studier tyder på miRNAs som viktiga prostatacancer biomarkörer, är betydelsen av flera av dessa studier ofta debatteras på grund av motstridiga resultat. Här har vi definierat ett optimerat arbetsflöde för noggrann miRNA uttryck analyser i prostatacancer kliniska prover som har en potential för att påskynda upptäckten av miRNA som biomarkörer för prostatacancer. Medandetta arbetsflöde har en betydande potential att exakt profil miRNA uttryck i prostatacancer kliniska vävnader, det finns inneboende begränsningar av tekniker som används. Low rikliga miRNA kan vara svårt till profilen med den optimerade miRNA RT-PCR och ISH-analyser beskrivs här. Även RT-PCR-baserad profilering har ett bredare dynamiskt omfång än ISH ^27,28, kan låga RNA belopp som erhållits från LCM begränsa detektering av låga rikliga miRNA. ISH-baserad detektering av miRNA ger kraftfull rumslig information, men dess begränsningar är att det är en semikvantitativ teknik med en mindre dynamiskt område ^28. Denna teknik bygger på sensitivitet och specificitet sönder anställda och även på optimering av förutsättningarna för hybridisering och detektion av miRNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Leica Biosystems	RM2255
Arcturus Autopix for LCM	Arcturus/ Life Technologies	LCM1621/LCM1110	Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
miRNeasy FFPE Kit	Qiagen	217504
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems/ Life Technologies	4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems/ Life Technologies	4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix	Applied Biosystems/ Life Technologies	4352042
DIG labeled LNA probe for U6	Exiqon	99002-01
BM Purple AP substrate	Roche	11442074001
Pre-hybridization solution	Biochain	K2191050-1
Hybridization solution	Biochain	K2191050-2
Blocking solution	Biochain	K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody	Biochain	K2191050-7
Aqueous mounting media	Vector Laboratories	H-5501
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)	Life Technologies	15596-018
Harris hematoxylin	Statlab	SL200
Eosin	Statlab	SL201