Abstract
Hemos desarrollado una plataforma de cribado para identificar proteínas quinasas humanos dedicados para sustratos fosforilados que pueden utilizarse para dilucidar nuevas vías de transducción de señales. Nuestro enfoque ofrece el uso de una biblioteca de proteínas quinasas humana marcada con GST purificada y un sustrato de proteína recombinante de interés. Hemos utilizado esta tecnología para identificar MAP / microtúbulos afinidad de regulación de quinasa 2 (MARK2) como la quinasa para un sitio regulada por glucosa en CREB-regulado transcripcional Coactivador 2 (CRTC2), una proteína necesaria para la proliferación de células beta, así como la la familia de tirosina quinasas de Axl como reguladores de la metástasis de las células por la fosforilación de la proteína adaptador de ELMO. Se describe esta tecnología y discutimos cómo puede ayudar a establecer un mapa completo de cómo las células responden a estímulos ambientales.
Introduction
Proteína modificaciones post-traduccionales (PTMs) son esenciales para la comunicación intracelular. Tal vez el mejor estudiado de todos PTM es la fosforilación, catalizada por proteínas quinasas, que regulan una gran variedad de funciones de proteínas, incluyendo su actividad bioquímica, localización subcelular, conformación, y la estabilidad. La identificación de sitios de fosforilación en las proteínas diana se puede lograr mediante mapeo de fosfopéptidos trípticos o mediante técnicas proteómicas ahora estándar usando muestras enriquecidas para los péptidos fosforilados 1,2. Aunque se espera que tres cuartas partes del proteoma expresado ser fosforilados 3 y un identificaron 200.000 sitios de fosforilación 5, con estimaciones de hasta 1 millón 6, muchos de éstos no tienen asignada la biología, la vía de señalización, o la proteína quinasa.
Mientras que la identificación de sitios fosforilados es relativamente sencillo, una comparativamente mayor reto esidentificar la quinasa cognado (s) que se dirige a estos sitios, un proceso que nos referimos como mapeo de quinasa: sustrato pares. Varios enfoques para la identificación de quinasa: sustrato pares se han descrito, ya sea comenzando con una quinasa de interés y en busca de sus sustratos o comenzar con un sustrato de interés y tratando de encontrar una quinasa de modificación experimentalmente 7-11 o computacionalmente 12. Para identificar quinasas para un sustrato fosforilado conocido, la bioinformática se pueden utilizar para identificar las proteínas que contienen una secuencia corta conservada de aminoácidos que flanquean el residuo fosforilado (el sitio consenso), así como la identificación de quinasas que forman un complejo con el sustrato precipitable. Sin embargo, estos métodos requieren mucho tiempo ya menudo no cumplen con éxito.
Hemos desarrollado un enfoque funcional sistemático para identificar rápidamente quinasas que pueden phosphorylate un sustrato dado 13. El ensayo de la pantalla produce una excelente específicadad, con una selección muy claro para los posibles quinasas afines. Dada la centralidad de la fosforilación de la señalización biológica, la pantalla es útil para el descubrimiento de rutas de señalización prácticamente todos los teléfonos 14-16. La pantalla implica la realización de un ensayo de quinasa a gran escala con una biblioteca de proteínas quinasas humanas. Las quinasas han sido etiquetadas con glutatión bacteriana S-proteína transferasa (GST) y se purificó a partir de extractos de células de mamíferos, lo que significa que las enzimas recombinantes - a diferencia de los preparados a partir de bacterias - se generan en presencia de las proteínas quinasas aguas arriba a menudo requeridos para la enzimas recombinantes que tienen actividad in vitro. De hecho, mientras que la actividad quinasa de serina, treonina y tirosina requiere para la activación de la quinasa aguas abajo están presentes en la levadura 10, el genoma de la levadura codifica 122 proteínas quinasas, lo que indica que el kinome de mamífero, con más de 500 genes 17, ha llegado a ser significativamente más compleja con el fin de regulate La procesos únicos para los organismos de orden superior. Por otra parte, el efecto de diferentes estímulos relevantes a la biología celular y la enfermedad humana (por ejemplo, moléculas pequeñas, factores de crecimiento, hormonas, etc.) se puede utilizar para modular la actividad de quinasa 14,15 en un contexto apropiado.
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Protocol
1. Preparación de los reactivos, platos, y Células
- Hacer 500 ml de tampón de lisis: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glicerofosfato, 5% de glicerol. Almacenar a 4 ° C. Inmediatamente antes de usar, añadir ditiotreitol 1 mM (DTT), 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), vanadato de sodio y 1 mM. Después de este paso, PMSF no se requiere en cualquier tampón de enjuague.
- Hacer 20 ml de 10x tampón de quinasa: mM Tris 200 pH 7,5, 50 mM de beta-glicerofosfato (FW 216), vanadato de sodio 2 mM. Alícuota en 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C. Inmediatamente antes de usar, añadir DTT 5 mM.
- Hacer 20 ml de tampón M-ATP 10x: 300 M de adenosina trifosfato (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCl $ 2. alícuota de 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C.
- Hacer 100 ml de sulfato de sodio dodecil 2x (SDS) tampón de lisis: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glicerol, 30 ml de H 2 O. Disolver y ajustar el pH a 6,8 con HCl. Añadir 40ml 10% SDS, ajustar el volumen a 100 ml. Añadir 25 mg de azul de bromofenol.
- Spot 4 l de 25 ng / l de plásmido de expresión de mamífero que codifican un GST-quinasa por pocillo en 14 conjuntos de placas de 96 pocillos y placas de etiquetas en consecuencia. Seal y congelación placas a -20 ° C hasta su uso.
- 1-2 días antes de la transfección, las células de cultivo HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) + 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos en una incubadora a 37 ° suplementado con CO 2 (5% final). Pasaje con tripsina y no permiten que la acción se convierta en> 80% de confluencia durante la expansión. Se requiere un mínimo de 6 x 10 7 células para la pantalla (aproximadamente 3 x 15 cm de platos de células HEK293T en 80% de confluencia).
2. La transfección
Nota: Consulte la Figura 1 para un diagrama de flujo de protocolo entero.
- Si las placas que contienen plásmidos quinasa han sido congelados, descongelar a temperatura ambiente unnd centrifugar a 1900 xg durante 3 min para recoger cualquier humedad en el fondo de los pozos.
- Mezclar 8,6 ml de medio de suero reducido (por ejemplo, OPTI-MEM) con 312,7 l de reactivo de transfección a base de lípidos. Deje reposar durante 5 minutos.
- Añadir 10 l de medio de suero reducido a cada pocillo usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un pequeño volumen de casete.
- Añadir 10 l por pocillo de la mezcla de reactivo de medio con suero / transfección reducida desde el paso 2.2 utilizando un dispensador de líquido automatizado equipado con un pequeño volumen de casete. Deje reposar durante 20 a 45 min.
- Resuspender las células 293T en 7,5 x 10 5 células / ml en 80 ml de DMEM completo. Añadir 100 l de suspensión celular (es decir, 7,5 x 10 4 células) por pocillo usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete de volumen estándar.
- Compruebe pozos bajo el microscopio para la distribución uniforme de células y volver a la incubadora durante 24 horas.
3. desplegable GST-quinasa
- Haga fResh: 4 mM solución de pervanadato mediante la mezcla de 60 l de 0,2 M de vanadato de sodio con 540 l de H 2 O. En una segunda mezcla de tubo de 2,7 l de peróxido de 30% y 1,4 ml de PBS. Añadir las dos soluciones juntos y deje reposar durante 15 minutos antes de su uso.
- Con una pipeta multicanal (no utilizar un dispensador de líquido automatizado, ya que crea mucha turbulencia en el pozo) prescindir de 2 l de 0,25 M CaCl2 en cada pocillo, seguido de 2,5 l de la pervanadato preparada en el paso 3.1. Incubar cada placa a 37 ° C durante 10 min y luego se coloca en hielo.
- Prepare 35 ml de tampón de lisis mediante la adición de la TDT, PMSF, y vanadato de sodio, como se indica en la Sección 1 (Preparación de los reactivos).
- Mantener las placas en hielo, retire medio de cada pocillo usando un aspirador de vacío. Inmediatamente añadir 50 l / pocillo de tampón de lisis de hielo frío usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete estándar. Deje reposar 30 minutos en hielo para lisar (opcional: puede parar aquí si es necesario mediante plat selladocorreo y almacenamiento a -80 ° C. Para continuar, placas de deshielo en el hielo).
- Placas giran a 1.900 g durante 3 min a 4 ° C.
- Raspar las células de cada pocillo usando una pipeta multicanal y transferir todos los contenidos etiquetados apropiadamente a placas de 96 pocillos de fondo en V. Placas giran a 1900 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Durante el centrifugado, llenar placas revestidos con glutatión (uno para cada placa de 96 pocillos) con 100 l / pocillo de tampón de lisis de hielo frío (sin PMSF) como un enjuague. Mantenga las placas de hielo.
- Retire las placas de fondo en V de la centrífuga. Uno a la vez, invertir las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y mancha en una toalla de papel. Transferencia de tampón de lisis de las placas de fondo en V a las placas de glutatión por la inclinación de la placa y con una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento en la parte inferior. Tapar y dejar las placas en hielo durante un mínimo de 2 horas para unirse.
- Cerca del final de la etapa de unión 2 hr, preparar una estación de trabajo radiactividad, asegurando tque las medidas de seguridad necesarias están en su lugar para el trabajo radiactivo. Horno de hibridación Se establece en 30 ° C.
- Preparar 200 ml de tampón de lisis mediante la adición de DTT y sodio vanadato como se indica en la Sección 1. PMSF no se requiere en esta etapa.
- Invertir las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y secar sobre una toalla de papel. Enjuague pozos 3 veces con 100 l de tampón de lisis (sin PMSF). No deje que los pozos se sientan en seco - mantenerlos en enjuague hasta que esté listo para continuar.
- Prepare 55 ml de tampón de quinasa 1x (KB) diluyendo el 10x y añadiendo la TDT, como se indica en la Sección 1. Placas de enjuague una vez con 50 l de 1x KB utilizando un dispensador de líquido automático equipado con un cassette de volumen estándar. Deja 1x KB en los pozos hasta que la solución A es listo:
- Preparar la solución A mediante la adición de 500 a 530 g del sustrato de interés, 500 g de proteína básica de la mielina (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13.25 l de 1 M DTT, y H 2 O hasta 15,9 ml.
- Preparar la solución B en el área de trabajo radiactividad añadiendo 2,5 ml de 10x M-ATP, 32 P ATP 500 Ci gamma, y H 2 O a 10 ml.
- Añadir 20 l de solución B por pocillo usando una pipeta repetidora que ayuda en la mezcla debido a la fuerza de eyección. Cubrir e incubar en horno de hibridación 30 ° C durante 30 min.
- Después de 30 minutos, la transferencia de las placas de nuevo a hielo. Añadir 50 l de tampón de lisis 2x SDS a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Puede proceder en este punto con el siguiente paso, o sellar las placas con papel de aluminio y guardar a -20 ° C hasta el momento conveniente.
4. Correr, tinción y Geles de secado
Nota: Todo el trabajo debe realizarse en un área Designated la radiactividad.
- Encienda el horno de hibridación y se puso a 85 ° C. Descongelar las placas a temperatura ambiente. Una vez que el horno ha alcanzado la temperatura, placas de transferencia al horno y se incuba durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras.
- Cargar 26 pocillos geles prefabricados con 15 l de cada reacción utilizando una pipeta multicanal para llenar varios pozos a la vez. Se debe tener cuidado de que todos los consejos se alinean con las correspondientes así antes de añadir las muestras. Ejecute gel a 150 V. No deje que el tinte de seguimiento (línea azul) se escurra de la parte inferior del gel, ya que contiene la ATP no incorporado.
- Desmontar los geles y cortar el ATP no incorporado (línea azul), utilizando un bisturí o borde recto ya que sobreexponer las películas. Coloca los geles en contenedores etiquetados y cubrir con tinción de Coomassie durante 15 min.
- Retire la tinción de Coomassie, brevemente enjuagar los geles con agua y añadir destain solución. Destain los geles hasta que las proteínas son claramente visibles. Una banda de MBP y una banda para el sustrato debeser visible para cada muestra.
- Para secar los geles:
- Cortar una hoja grande de papel de filtro y colocarlo en la secadora.
- Moje una hoja de celofán en agua destilada hasta que esté suave y libre de arrugas, y colocarlo en la parte superior del papel.
- Coloque los geles en la parte superior de la hoja de celofán, haciendo una nota de la orden de los geles. Moje una segunda hoja de celofán y colocar en la parte superior de los geles.
- Estirar todas las burbujas (un rodillo sellado placa funciona bien para esto) para una superficie agradable uniforme. Cierre la tapa, encienda el vacío, y secar los geles durante 3 horas a 80 ° C.
- Una vez geles están secos, los exponen a una película XAR utilizando una pantalla de intensificar la señal. Envuelva la cinta con papel film o una bolsa de plástico y selle con cinta para mantener fuera a las heladas. Guarde el casete a -80 ° C durante la noche.
5. Desarrollar XAR Films
- Al día siguiente, eliminar el casete del congelador y dejar descongelar a temperatura ambiente. Desarrollar la película enun cuarto oscuro usando un procesador de película de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Nota: Examine las películas para pruebas de pares quinasa-sustrato. Una segunda exposición más larga también puede ser útil para detectar eventos de fosforilación más débiles.
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Representative Results
Los resultados representativos de una pantalla se muestran en la Figura 2. 180 quinasas fueron seleccionados utilizando un sustrato peptídico marcada con GST correspondiente a los aa 268-283 de CRTC2 así como la proteína básica de la mielina sustrato clásico ensayo de quinasa (MBP). Sólo dos quinasas, MARK2 y MARK3 la quinasa altamente relacionados con el péptido CRTC2 fosforilados. MBP se incluye como un control interno en todos los ensayos, ya que contiene muchos residuos fosforilables y funciona a 18 kDa, hacia la parte inferior del gel. Esto permite una interpretación de especificidad: algunos quinasa se robustamente fosforilar un sustrato y MBP. Es de destacar aquí es que los pocillos que contienen GST sola (es decir, los controles no hay quinasa) siempre purifican alguna actividad quinasa endógena, por lo tanto siempre existe la fosforilación de fondo en el ensayo. Si bien esto no descarta que la fosforilación del sustrato es real, sí sugiere que, en el in vitro estableciendo la quinasa puede ser menos selectiva.Es particularmente informativa para incluir múltiples sustratos de diferente MW para sacar conclusiones con respecto a la especificidad quinasa-sustrato.
Figura 1. Diagrama de flujo que muestra las etapas clave de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ejemplo de resultado pantalla. Autorradiografías de una pantalla de la versión 1 de la biblioteca (180 proteínas quinasas humanos) realiza utilizando sustrato GST-péptido correspondiente a los aa desde 268 hasta 283 de CRTC2 ratón (reproducido de Jansson et al., 2008). MBP, proteína básica de la mielina se indica. El alto grado de sselección ubstrate por quinasas relacionadas es una característica de la pantalla. Cada carril representa los productos de reacción de un ensayo de quinasa distinta. MARK3 (Gel 1) y MARK2 (Gel 16), los únicos quinasas que fosforilan TORC2 268-283 péptido, se indican. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Desde las publicaciones originales que describen el enfoque 14,15, la biblioteca original de 180 GST-quinasas se ha ampliado a 420 miembros, o ~ 80% de la kinome proteína humana. Con la biblioteca ampliada, el protocolo como se describe toma 4-5 días y después de 1-4 días para desarrollar películas (según se considere necesario), lo que podría ser acortada mediante el uso de phosphorimaging y mejora de la señal digital. Hay varios pasos clave en las que se debe tener cuidado (Ver Figura 1 para la visión general de protocolo). En primer lugar, es la salud de la población de células (libre de micoplasma, nunca se dejó que alcanzara la confluencia durante la expansión, y se trató con tripsina a cada pasaje) durante la etapa de expansión por lotes y en las placas de 96 pocillos en el momento de la transfección. Las células deben ser uniformemente cabeza de serie, y 80% de confluencia cuando la transfección se lleva a cabo (paso 1.5).
En segundo lugar, es ideal durante la transfección utilizar un dispensador de líquido automatizado para minimizar el volumen transferrores er, limitando así el coeficiente de variación ("cvs") entre los pozos. Para los pequeños volúmenes, encajando el dispensador con un volumen menor pérdida de reactivo límites de cassette, debido a la reducción de volúmenes muertos y aumentos de dispensación precisión. La etapa de tratamiento con pervanadato de sodio, un inhibidor de la tirosina fosfatasa pan, se utiliza como un estímulo general para aumentar estado de fosforilación de las quinasas diana. La inclusión de calcio en este paso aumenta la adhesión célula-matriz, la prevención de la pérdida de células debido al redondeo provocada por el tratamiento pervanadato prolongado. Este paso debe hacerse con estricto apego al tiempo de incubación de 10 minutos.
En tercer lugar, para el ensayo de quinasa en sí, hay varias consideraciones en la elección del sustrato recombinante: péptidos, dominios de proteínas, o proteínas intactas tan grandes como 120 kDa puede se utilicen todas. Si un sitio de fosforilación específica se conoce, un sustrato peptídico es el enfoque más directo, pero debe ser lo suficientemente grande como para detectaren un gel de SDS-PAGE. Por lo tanto, sustratos peptídicos pueden fusionarse con GST y se purificaron a partir de bacterias para dar un MW de> 25. Proteínas más grandes tienen la ventaja de que es probable que estén plegadas y sus residuos fosforilables expuestos como lo serían en la célula, sin embargo, vienen con el inconveniente de que van a incluir residuos adicionales que podrían ser fosforilada y dar la señal en el ensayo. Nuestra preferencia es ejecutar una pantalla usando un sustrato peptídico compuesto de 15-20 aminoácidos que rodean un residuo que se sabe que está fosforilada in vivo y es conocido para regular un evento biológico, ya que esto hace que la validación de las quinasas candidatos desde la pantalla tanto in vitro e in vivo mucho más rápido.
Última, idealmente la cantidad de enfoques de proteínas o superior a 1 g por así; Esto, por supuesto varía con el MW del sustrato. Menos de proteína por pozo puede producir éxitos significativos, pero el "más es mejor" regla se aplica, ya que aumenta la señal: noise. Estándar, se recomiendan geles no degradado como geles de gradiente grieta demasiado a menudo durante el secado. Después de secar los geles, la detección de una señal radiactiva sobre el fondo con un contador Geiger da una excelente indicación de éxito del ensayo.
Como la pantalla es in vitro y existen niveles adicionales de complejidad in vivo, una quinasa (s) candidato para un sustrato dado debe ser validado en las células. Específicamente, la pantalla puede identificar un miembro de la familia que tiene la capacidad bioquímica para fosforilar el sustrato in vitro, sin embargo, no se expresa en el mismo tipo de célula o en el mismo compartimento subcelular como sustrato. Por ejemplo, mientras MARK2 y MARK3 eran ambos accesos en una pantalla para la quinasa que podría fosforilar CRTC2 en Ser275, solamente MARK2 forma un complejo con el sustrato en las células 14. Los siguientes son una serie de experimentos adicionales que se pueden utilizar para confirmar la relevancia fisiológica de una quinasa candidato. Abetost, desplazamientos de movilidad del sustrato en SDS-PAGE siguientes coexpresión de la quinasa candidato puede ser utilizado como un control de confirmación. Controles apropiados tales cotransfección de una quinasa catalíticamente inactiva pueden confirmar la especificidad. En segundo lugar, el sustrato puede ser inmunoprecipitada a partir de extractos de células que han sido incubadas con 32 P-ortofosfato para confirmar la incorporación de fosfato en el sustrato en presencia del tipo salvaje y no una quinasa catalíticamente inactiva. En tercer lugar, un anticuerpo fosfoespecífico puede ser generada contra la secuencia phosphoacceptor (si se conoce) y se utiliza para confirmar un aumento en la fosforilación del sustrato cuando se sobreexpresa la quinasa. Una pantalla secundaria utilizando un sustrato mutante que lleva un residuo no fosforilable en el sitio diana puede confirmar la especificidad antes de la generación de una phosphoantibody, un control particularmente importante con sustratos más grande de dominio y de la proteína de longitud completa. La inhibición farmacológica se acerca para inhibir una candifecha quinasa también se puede utilizar, sin embargo, se debe tener cuidado ya que la inhibición de las quinasas relacionadas es una realidad poco apreciada. Por último, el silenciamiento de la quinasa candidato (s) en las células RNAi mediada seguidas y el Western Blot para controlar la pérdida de la fosforilación sitio de destino con un anticuerpo fosfoespecífico se puede realizar.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la beca NSERC 386634. Nos gustaría dar las gracias a los miembros del Laboratorio Screaton útil para los debates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
