Abstract
Vi har udviklet en screening platformen til at identificere specifikke humane proteinkinaser for phosphorylerede substrater, der kan anvendes til at belyse hidtil ukendte signaltransduktionsveje. Vores tilgang angår anvendelse af et bibliotek af oprensede GST-mærket human proteinkinaser og et rekombinant protein substrat af interesse. Vi har brugt denne teknologi til at identificere MAP / mikrotubuli affinitet-regulering kinase 2 (MARK2) som kinasen for en glucose-reguleret site på CREB-regulerede transkriptions-coaktivator 2 (CRTC2), et protein nødvendigt for beta-celleproliferation, samt Axl familie af tyrosin kinaser som regulatorer af celle metastase ved fosforylering af adapteren protein ELMO. Vi beskriver denne teknologi og diskutere hvordan det kan hjælpe til at etablere et omfattende kort over, hvordan celler reagerer på miljømæssige stimuli.
Introduction
Protein post-translationelle modifikationer (PTMS) er afgørende for intracellulær kommunikation. Måske er den bedst undersøgte af alle PTMS er phosphorylering, katalyseret af proteinkinaser, som regulerer et utal af protein funktioner, herunder deres biokemiske aktivitet, subcellulære lokalisering, konformation og stabilitet. Identifikationen af phosphoryleringssteder på målproteiner kan opnås ved tryptisk kortlægning phosphopeptid eller ved nu standard proteomiske teknikker ved anvendelse af prøver beriget med phosphorylerede peptider 1,2. Mens tre fjerdedele af det udtrykte proteom forventes at blive phosphoryleret 3 og et specifikt 200.000 phosphoryleringssteder 5, med skøn på op til 1 million 6, mange af disse ikke har nogen tilknyttet biologi, signalvejen eller proteinkinase.
Mens identifikation af phosphorylerede steder er forholdsvis ligetil, en forholdsvis større udfordring er atidentificere det beslægtede kinase (r), der er målrettet disse steder, en proces, vi kalder kortlægning kinase: substrat par. Adskillige fremgangsmåder til identifikation af kinase: substrat-par er blevet beskrevet, enten starter med en kinase af interesse og leder efter dets substrater eller starte med et substrat af interesse og forsøger at finde en modificerende kinase eksperimentelt 7-11 eller beregningsmæssigt 12. For at identificere kinaser for en kendt phosphorylerede substrat kan bioinformatik anvendes til at identificere proteiner, der indeholder en kort konserveret sekvens af aminosyrer, der flankerer den phosphorylerede rest (konsensus stedet), samt identifikation af kinaser, der danner en præcipiterbart kompleks med substratet. Men disse metoder er tidskrævende og ofte ikke mødes med succes.
Vi udviklede en systematisk funktionel tilgang til hurtigt at identificere kinaser, der kan phosphorylerer et givet substrat 13. Skærmen analysen producerer fremragende specifikkehed, med meget klare valg for potentielle beslægtede kinaser. I betragtning af den centrale i fosforylering til biologisk signalering, skærmen er nyttigt for opdagelse i næsten alle celle signalveje 14-16. Skærmen omfatter udførelse af en storstilet kinase assay med et bibliotek af humane proteinkinaser. Kinaserne er blevet mærket med bakteriel glutathion S-transferase (GST) protein og oprenses fra mammale celleekstrakter, hvilket betyder at de rekombinante enzymer - i modsætning til dem, der fremstilles fra bakterier - genereres i nærværelse af de opstrøms proteinkinaser som ofte er nødvendige for rekombinante enzymer at have aktivitet in vitro. Faktisk mens serin, threonin og tyrosin kinase-aktivitet kræves for downstream kinase aktivering er til stede i gær 10, gærgenomet koder 122 proteinkinaser, hvilket indikerer, at det mammale kinome, med over 500 gener 17, er blevet betydeligt mere kompliceret med henblik på at regulate processerne unikke for højere ordens organismer. Desuden kan virkningen af forskellige stimuli relevante for cellebiologi og human sygdom (såsom små molekyler, vækstfaktorer, hormoner, etc.) anvendes til at modulere 14,15 kinaseaktivitet i en passende sammenhæng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af reagenser, plader, og celler
- Gør 500 ml lysepuffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glycerophosphat, 5% glycerol. Opbevares ved 4 ° C. Umiddelbart før brug tilsættes 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 mM natriumvanadat. Efter dette trin, er PMSF kræves ikke i noget skyllepuffer.
- Lav 20 ml 10x kinasepuffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glycerophosphatopløsninger (FW 216), 2 mM natriumvanadat. Portion i 1 ml rør og opbevares ved -20 ° C. Umiddelbart før brug tilsættes 5 mM DTT.
- Lav 20 ml 10x M-ATP-buffer: 300 uM adenosintriphosphat (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCl 2. alikvot i 1 ml rør og opbevares ved -20 ° C.
- Lav 100 ml 2x natriumdodecylsulfat (SDS) lyseringsbuffer: 1,5 g Tris-base, 20 ml glycerol, 30 ml H 2 O. Opløses og justering af pH til 6,8 med HCI. Tilsæt 40ml 10% SDS, justere lydstyrken til 100 ml. Tilsættes 25 mg bromphenol blå.
- Spot 4 pi 25 ng / pl pattedyr ekspressionsplasmid, der koder for et GST-kinase 14 per brønd i sæt af plader med 96 brønde og label plader i overensstemmelse hermed. Seal og fryse plader ved -20 ° C indtil anvendelse.
- 1-2 dage før transfektion, kultur HEK293T celler i fuldstændig Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) + 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika i en 37 ° C inkubator suppleret med CO 2 (endelig 5%). Passage med trypsin og tillader ikke bestanden til at blive> 80% sammenflydende under ekspansion. Et minimum på 6 x 10 7 celler er nødvendige for skærmen (ca. 3 x 15 cm skåle af HEK293T celler ved 80% konfluens).
2. Transfektion
Bemærk: Se figur 1 for et rutediagram over hele protokollen.
- Hvis plader indeholdende kinase plasmider er blevet frosset, optøning ved stuetemperatur ennd centrifugeres ved 1.900 x g i 3 min at indsamle fugt i bunden af brøndene.
- Bland 8,6 ml reduceret serummedium (f.eks OPTI-MEM) med 312,7 pi lipid-baserede transfektionsreagens. Lad det sidde i 5 min.
- Tilsæt 10 pi reduceret serum medium til hver brønd under anvendelse af en automatiseret dispenser udstyret væske med et lille volumen kassette.
- Tilsæt 10 pi per brønd af den reducerede serummedium / transfektion reagensblanding fra trin 2.2 anvendelse af en automatiseret dispenser udstyret væske med et lille volumen kassette. Lad det sidde i 20 til 45 min.
- Resuspender 293T-celler ved 7,5 x 10 5 celler / ml i 80 ml komplet DMEM. Tilsæt 100 pi cellesuspension (dvs. 7,5 x 10 4 celler) pr anvendelse af et automatiseret væskedispenser udstyret med en standard volumen kassette.
- Tjek brønde under mikroskop for ensartet celle distribution og vende tilbage til inkubator i 24 timer.
3. GST-kinase Pulldown
- Foretag fresh: 4 mM pervanadat opløsning ved at blande 60 pi 0,2 M natriumvanadat med 540 pi H 2 O. I et andet rør mix 2,7 pi 30% peroxid og 1,4 ml PBS. De to opløsninger sammen og lad det sidde i 15 minutter før brug.
- Ved hjælp af en multikanal pipette (brug ikke en automatiseret flydende dispenser, da det skaber for meget uro i brønden) dispensere 2 pi 0,25 M CaCl2 i hver brønd, efterfulgt af 2,5 pi af pervanadat forberedt i trin 3.1. Inkuber hver plade ved 37 ° C i 10 minutter og derefter placere på is.
- Forbered 35 ml lyseringspuffer ved at tilføje DTT, PMSF, og natriumvanadat som angivet i afsnit 1 (Klargøring af reagenser).
- Holde plader på is, fjernes mediet fra hver brønd med en vakuum aspirator. Straks tilføje 50 pl / brønd iskold lysepuffer anvendelse af en automatiseret væskedispenser udstyret med en standard kassette. Lad sidde 30 minutter på is for at lysere (ekstraudstyr: kan stoppe her, hvis nødvendigt ved at forsegle plate og opbevaring ved -80 ° C. For at fortsætte, tø plader på is).
- Spin plader på 1.900 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Skrabe cellerne fra hver brønd med en multikanalpipette og overføre hele indholdet ud på passende mærket V-bundede 96 brøndsplader. Spin plader på 1.900 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Under centrifugering, fylde glutathion coatede plader (én for hver 96-brønds plade) med 100 pl / brønd iskold lysepuffer (uden PMSF) som en skylning. Hold pladerne på is.
- Fjern V-bund plader fra centrifugen. En ad gangen, vendes glutathion plader over en vask til at ryste ud lyseringspufferen og skamplet på et stykke køkkenrulle. Overfør lyseringspuffer fra V-bund plader til glutathion pladerne ved at vippe pladen og ved hjælp af en multikanal pipette, være omhyggelig med at ikke forstyrre pellet i bunden. Dækplader og lad på is i mindst 2 timer til at binde.
- Tæt på afslutningen af den 2 timer bindende trin fremstilles en radioaktivitet arbejdsstation, der sikrer tHan nødvendige sikkerhedsforanstaltninger er på plads for radioaktivt arbejde. Indstil hybridisering ovnen til 30 ° C.
- Forbered 200 ml lysepuffer ved tilsætning DTT og natriumvanadat som angivet i afsnit 1. PMSF er ikke påkrævet på dette tidspunkt.
- Vend glutathion plader over en vask til at ryste ud lyseringspufferen og duppes på et stykke køkkenrulle. Brøndene skylles 3 gange med 100 pi lysisbuffer (uden PMSF). Lad ikke brønde sidde tørre - holde dem i skylning indtil den er klar til at fortsætte.
- Forbered 55 ml 1x kinasebuffer (KB) ved at fortynde 10x lager og tilføje DTT som angivet i afsnit 1. Skyl plader en gang med 50 pi 1x KB ved hjælp af en automatiseret flydende dispenser udstyret med et standard volumen kassette. Lad 1x KB i brønde, indtil opløsning A er klar:
- Forbered opløsning A ved tilsætning af 500 til 530 ug af substratet af interesse, 500 ug myelin basisk protein (MBP), 2,65 ml 10x KB, 13,25 pi 1 M DTT og H2O op til 15,9 ml.
- Forbered Opløsning B i radioaktiviteten arbejdsområdet ved tilsætning af 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gamma-32P ATP og H2O til 10 ml.
- Tilføj 20 pi af opløsning B pr brønd med en gentagelsespipette som hjælper med at blande grund udstødelseskraft. Dække og inkuberes i 30 ° C hybridisering ovn i 30 minutter.
- Efter 30 minutter overføres pladerne tilbage til is. Der tilsættes 50 pi 2x SDS lysepuffer til hver brønd med en multikanalpipette. Kan fortsætte på dette punkt til det næste trin, eller forsegle pladerne med aluminiumfolie og opbevares ved -20 ° C indtil praktisk.
4. Løb, farvning og tørring Gels
Bemærk: Alt arbejde skal udføres i et område Designated for radioaktivitet.
- Tænd hybridisering ovn og indstillet til 85 ° C. Optø plader ved stuetemperatur. Når ovnen har nået temperatur, overføre plader til ovn og inkuberes i 10 min for at denaturere prøver.
- Load 26-brønds færdigstøbte geler med 15 pi af hver reaktion under anvendelse af en multikanalpipette at fylde flere brønde på en gang. Der skal udvises forsigtighed, at alle tips linie med tilsvarende godt, før du tilføjer prøver. Kør gel ved 150 V. Lad ikke tracking farvestof (blå linje) køre ud af bunden af gelen, da dette indeholder ikke-inkorporeret ATP.
- Afmonter geler og afbrød ikke-inkorporeret ATP (blå linje) ved hjælp af en skalpel eller lige kant, da det vil overexpose filmene. Placer geler i mærkede beholdere og dække med Coomassie plet i 15 min.
- Fjern coomassieplet kortvarigt skyl gelerne med vand og tilsættes affarvning løsning. Affarvning gelerne indtil proteinerne er klart synlige. Et band til MBP og et band til underlaget skalvære synlig for hver prøve.
- At tørre geler:
- Skær et stort ark filtrerpapir og placere den på tørretumbleren.
- Fugt en cellofan ark i destilleret vand, indtil den er glat og rynke fri, og placere den på toppen af papiret.
- Læg geler på toppen af cellofan ark, hvilket gør et notat i størrelsesordenen geler. Fugt en anden cellofan plader og placere på toppen af geler.
- Rul alle bobler (en plade forsegling rulle fungerer godt for dette) for en dejlig ensartet overflade. Luk klappen, tænd vakuum og tørre gelerne i 3 timer ved 80 ° C.
- Når geler er tørre, udsætte dem for XAR-film ved hjælp af en skærm til at intensivere signalet. Wrap kassetten med Saran wrap eller en plastpose og segl med tape til at holde ud frost. Opbevar kassetten ved -80 ° C natten over.
5. Udvikling XAR Films
- Den følgende dag fjernes kassetten fra fryseren og lad tø op ved stuetemperatur. Udvikle filmen iet mørkekammer anvendelse af en film processor ifølge producentens instruktioner.
Bemærk: Undersøg film til dokumentation for kinase-substrat par. En anden længere eksponering kan også være nyttigt at detektere svagere phosphoryleringsbegivenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater fra en skærm er vist i figur 2. 180 kinaser blev screenet under anvendelse af et GST-tagget peptidsubstrat svarende til aa 268-283 fra CRTC2 samt den klassiske kinaseassay substrat myelin basisk protein (MBP). Kun to kinaser, MARK2 og stærkt relateret kinase MARK3 phosphoryleret i CRTC2 peptid. MBP er inkluderet som en intern kontrol i alle analyser, da den indeholder mange phosphorylatable rester og kører ved 18 kDa, mod bunden af gelen. Dette giver mulighed for en fortolkning af specificitet: nogle kinase vil håndfast phosphorylerer et substrat og MBP. Fremhæves her er, at brøndene indeholdende GST alene (dvs. ingen kinase kontroller) altid oprense nogle endogen kinaseaktivitet, der er således altid baggrund phosphorylering i assayet. Selv om dette ikke udelukke, at phosphorylering af substratet er fast, men det betyder, at i in vitro indstilling kinasen kan være mindre selektiv.Det er særligt oplysende at omfatte flere substrater af forskellig MW til at drage konklusioner vedrørende kinase-substrat specificitet.
Figur 1. Flowchart viser vigtige skridt i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksempel på skærmen resultat. Autoradiografier af en skærm på Version 1 af biblioteket (180 humane proteinkinaser) udført under anvendelse af GST-peptidsubstrat svarende til aa 268-283 af muse CRTC2 (reproduceret fra Jansson et al., 2008). MBP er myelin basisk protein er angivet. Den høje grad af substrate udvælgelse af beslægtede kinaser er en funktion af skærmen. Hver bane repræsenterer reaktionsprodukterne fra en særskilt kinase assay. MARK3 (Gel 1) og MARK2 (Gel 16), at de eneste kinaser phosphorylerer TORC2 268-283 peptid, er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Da de oprindelige publikationer, der beskriver den fremgangsmåde 14,15, har det oprindelige bibliotek på 180 GST-kinaser blevet udvidet til 420 medlemmer, eller ~ 80% af det humane protein kinome. Med den udvidede bibliotek protokollen som beskrevet tager 4-5 dage og derefter 1-4 dage til at udvikle film (som det skønnes nødvendigt), som kunne forkortes ved anvendelse af phosphorafbildning og digital signalforbedring. Der er flere vigtige skridt, hvor der foretages pleje (Se figur 1 for oversigt over protokol). For det første er sundheden af bestanden af celler (mycoplasma fri, aldrig lov til at nå sammenflydning under ekspansion, og behandlet med trypsin ved hver passage) under batch ekspansionsfasen og i 96-brønds plader på tidspunktet for transfektion. Cellerne skal være ensartet seedet, og 80% sammenflydende, når transfektion finder sted (trin 1.5).
For det andet, er det ideelt under transfektion til at bruge en automatiseret flydende dispenser for at minimere volumen transfER fejl, hvilket begrænser koefficient på variationer ("cvs") mellem brønde. For små volumener, montering dispenseren med en mindre volumen kassette grænser reagens tab som følge af reducerede døde volumener og stiger udlevering nøjagtighed. Behandlingstrinnet med natrium pervanadat, en pan tyrosinphosphataseinhibitor, anvendes som en generel stimulus for at øge phosphorylering status target kinaser. Inddragelse af calcium på dette trin øger celle-matrix adhæsion, forhindrer celle tab på grund af afrunding fremkaldt ved længere tids pervanadat behandling. Dette trin bør ske med streng overholdelse 10 minutters inkubationstid.
For det tredje, for kinaseanalysen selv, er der flere overvejelser ved valg af rekombinante substrat: peptider, proteindomæner eller intakte proteiner så store som 120 kDa kan alle anvendes. Hvis en bestemt phosphoryleringssite er kendt, et peptidsubstrat er den mest ligetil tilgang, men skal være stort nok til at detekterepå en SDS-PAGE-gel. Således kan peptidsubstrater fusioneres til GST og oprenses fra bakterier til opnåelse af en MW på> 25. Større proteiner har den fordel, at de sandsynligvis foldes og deres phosphorylatable rester eksponeret som de ville være i cellen, men kommer med den ulempe, at de vil indbefatte yderligere rester, der kunne være phosphoryleret og giver signal i assayet. Vores præference er at køre en skærm ved hjælp af et peptidsubstrat bestående af 15-20 aminosyrer omgiver en rest, der er kendt for at phosphoryleres in vivo og er kendt for at regulere en biologisk begivenhed, da dette gør validering af kandidat-kinaser fra skærmen både in vitro og in vivo meget hurtigere.
Sidst, ideelt mængden af protein fremgangsmåder eller overstiger 1 ug per brønd; dette er naturligvis varierer med MW substratet. Mindre protein per brønd kan give meningsfulde hits, men den "mere er bedre" regel gælder da det øger signal: noiSE. Standard, ikke-gradientgeler anbefales som gradientgeler knække for ofte under tørring. Efter tørring af gelerne, påvisning af en radioaktiv signal over baggrund med en geigertæller giver en fremragende indikation af succes assayet.
Da skærmen er in vitro og yderligere niveauer af kompleksitet eksisterer in vivo, skal en kandidat kinase (s) for en givet substrat valideres i celler. Specifikt kan skærmen identificere et familiemedlem, der har den biokemiske evne til at phosphorylere substratet in vitro, men ikke udtrykkes i den samme celle type eller i samme rum som subcellulære substratet. For eksempel, mens MARK2 og MARK3 var begge hits i en skærm for kinase, som kunne phosphorylere CRTC2 på Ser275, kun MARK2 dannet et kompleks med substratet i celler 14. Følgende er en række yderligere forsøg, der kan anvendes til at bekræfte den fysiologiske relevans af en kandidat-kinase. First, kan mobilitetsforskydninger af substratet på SDS-PAGE efter coekspression af kandidat kinase anvendes som en bekræftelse kontrol. Passende kontroller sådan cotransfektion af en katalytisk inaktiv kinase kan bekræfte specificiteten. For det andet kan substratet immunopræcipiteres fra celleekstrakter, der er blevet inkuberet med 32P-orthophosphat at bekræfte inkorporering af phosphat i substratet i nærværelse af vildtype og ikke en katalytisk inaktiv kinase. For det tredje kan en phosphospecifikt antistof dannet mod phosphoacceptor sekvens (hvis kendt) og anvendt til at bekræfte en stigning i substratphosphorylering når kinase overudtrykkes. En sekundær screening under anvendelse af et substrat, der bærer mutant et ikke-phosphorylatable rest ved målstedet kan bekræfte specificiteten før generering af en phosphoantibody, en særlig vigtig kontrol med større domæne og fuld længde proteinsubstrater. Farmakologisk hæmning tilgange til at hæmme en candidato kinase kan også anvendes, men skal der udvises forsigtighed, da hæmning af relaterede kinaser er en underappreciated realitet. Sidst, RNAi-medieret inaktivering af kandidat-kinase (r) i celler følges, og western blotting for at overvåge tab af målstedet phosphorylering med en phosphospecifikt antistof kan udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSERC tilskud 386634. Vi vil gerne takke medlemmerne af Screaton Lab for nyttige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
