Abstract
Bu yeni sinyal transdüksiyon yollar aydınlatmak için kullanılabilir fosforile edilmiş alt tabakalar için özel bir insan protein kinazlar tespit için bir tarama platformu geliştirdik. Yaklaşımımız saflaştınldı GST-etiketli insan protein kinazların bir kütüphane ve ilgi konusu bir rekombinant protein alt-tabakanın kullanımı ile ilgilidir. Biz, CREB Düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici 2 (CRTC2) bir glükoz ayarlı bir site için kinaz MAP / mikrotübül afinite düzenleyici kinaz 2 (MARK2) tanımlamak için bir beta hücre çoğalması için gerekli olan bir proteini, hem de bu teknolojiyi kullanmıştır tirozin Axl ailesi adaptör protein ELMO fosforilasyonu, hücre metastazı düzenleyicileri olarak kinazlar. Biz bu teknolojiyi tanımlamak ve hücrelerin çevresel uyaranlara tepki nasıl kapsamlı bir haritasını oluşturmak için nasıl yardımcı olabileceğini tartışmak.
Introduction
Protein post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) hücre içi iletişim için gereklidir. Belki de en iyi incelenen PTMS hücre altı konumlanması, konformasyon ve kararlılık, biyokimyasal aktivitesi de dahil olmak üzere protein fonksiyonları, bir sayısız düzenleyen protein kinazlar tarafından katalize fosforilasyon vardır. Hedef proteinler üzerinde fosforilasyon tanımlanması triptik fosfopeptıt haritalaması ile fosforile peptidler 1,2 zenginleştirilmiş örnekler kullanılarak artık standart proteomik tekniklerle gerçekleştirilebilir. Ifade proteomun dörtte üçü 3 fosforile olması beklenen ve 1.000.000 6 kadar tahminleri ile 200,000 fosforilasyon siteleri 5 tespit edilir olsa da, bunların çoğu bir yol ya da protein kinazı sinyal, herhangi bir verilen biyoloji sahiptir.
Fosforile sitelerin tespiti nispeten büyük bir meydan okuma olduğunu, görece kolay olmasına karşınAlt tabaka çiftleri: bu siteleri hedefliyor soydaş kinaz (ler), biz haritalama kinaz olarak adlandırdığımız bir süreci tanımlamak. Alt tabaka çiftleri tarif edilmiştir, ya ilgi kinaz ile başlayan ve yüzeylerde arıyor veya ilgi bir alt tabaka ile başlayan ve bir modifiye kinaz deneysel 7-11 veya hesaplama 12 bulmaya çalışırken: kinaz tanımlamak için çeşitli yaklaşımlar. Bilinen bir fosforile edilmiş substrat için kinazlar tespit etmek için, alt-tabaka biyoinformatik ile çökeltilebilir kompleks oluşturmak kinazlar fosforilatlanmış bir tortu (konsensüs sitesi) yan, hem de tespit amino asitlerin kısa korunmuş dizisini içeren proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, zaman alıcı ve genellikle başarı ile uymayan.
Biz hızla belirli bir alt tabaka 13 fosforile edebilir kinazlar belirlemek için sistematik bir işlevsel yaklaşım geliştirdi. Ekran tahlil mükemmel spesifik üretirPotansiyel soydaş kinazlar için çok net bir seçim ile Sığ. Biyolojik sinyalleşme fosforilasyon merkezi konumu göz önüne alındığında, ekran hemen hemen tüm hücre sinyal yollarının 14-16'da keşfi için yararlıdır. Ekran, insan protein kinazlann bir kütüphane ile geniş çaplı bir kinaz tahlili yerine getirilmesini kapsamaktadır. Kinazlar bakteriyel glutation S-transferaz (GST) proteini ile etiketlenmiş ve rekombinant enzimlerin, yani memeli hücre özütlerinden saflaştırıldı - bakterilerden hazırlanmış olan farklı - genellikle için gerekli yukarı akış protein kinazların varlığında oluşturulur Rekombinant enzimlerin in vitro aktiviteye sahip oldukları. Serin, treonin ve tirosin kinaz aktivitesi alt kinaz aktivasyonu için gereken Nitekim, maya 10 içinde mevcut olan, maya genomu 500 gen üzerinde 17 memeli kinome, için önemli ölçüde daha karmaşık hale gelmiştir belirten 122 protein kinazlan kodlar regulayüksek mertebeden organizmalara özgü süreçleri te. Ayrıca, hücre biyolojisi ve (örneğin, vb küçük moleküller, büyüme faktörleri, hormonlar, gibi), insan hastalığı ile ilgili çeşitli farklı uyarıcı etkisi, uygun bir çerçevede 14,15 modüle kinaz aktivitesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Reaktifler, Tabaklar ve Hücreleri 1. Hazırlık
- 25 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.5 mM EDTA, pH 8.0,% 0.5 Triton X-100, 5 mM p-gliserofosfat,% 5 gliserol, 500 ml lizis tamponu sağlayın. 4 ° C'de saklayın. Kullanmak 1 mM ditiotreitol (DTT), 1mM fenilmetil sülfonil fluorür (PMSF) ve 1 mM sodyum vanadat eklemek için hemen önce. Bu aşamadan sonra, PMSF bir durulama tamponu içinde gerekli değildir.
- 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-gliserofosfat (FW 216), 2 mM sodyum vanadat: 10x Kinaz Tamponu 20 ml sağlayın. -20 ° C'de 1 ml'lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza. Kullanmak 5 mM DTT eklemek için hemen önce.
- 300 uM adenosin trifosfat (ATP), 66 mM MgCl2, -20 ° C'de 33 mM MnCl 2. 1 ml'lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza: 10x M-ATP tamponu 20 ml sağlayın.
- 2x sodyum dodesil sülfat 100 ml Yap (SDS) lizis tamponu: 1,5 g Tris baz, 20 ml gliserol, 30 ml H2O Eritin ve HCI ile 6.8 pH'a ayarlanır. 40 Ekleml% 10 SDS, 100 ml ses seviyesini ayarlamak. 25 mg bromofenol mavi ekleyin.
- Noktası buna uygun olarak, 96 gözlü levhalar ve etiket plakaları setleri göz başına bir GST-kinaz kodlayan 14 25 ng / | il memeli ekspresyon plazmidi 4 ul. Kullanılana kadar -20 ° C'de dondurularak mühür ve plakalar.
- Transfeksiyondan 1-2 gün önce, CO2 (son% 5) ile desteklenmiş 37 ° C inkübatör içinde bir kültür HEK293T tamamlandı Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) +% 10 cenin sığır serumu (FBS) hücreler ve antibiyotik. Ve tripsin ile Passage stok genişleme sırasında>% 80 konfluent haline izin vermez. 6 x 10 7 hücrelerinin en az ekran (80% birleştiği noktada HEK293T hücrelerinin yaklaşık 3 x 15 cm yemekleri) için gereklidir.
2. Transfeksiyon
Not: Tüm protokolün bir akış şeması için Şekil 1'e bakınız.
- Kinaz plazmidler içeren plakalar donduruldu varsa, oda sıcaklığı a at çözülmend kuyu altındaki nemi toplamak için 3 dakika boyunca 1900 x g'de santrifüjlenir.
- Lipit bazlı transfeksiyon reaktifi 312,7 ul düşük serum ortamında (örneğin, OPTI-MEM) 8,6 ml karıştırın. 5 dakika bekletin.
- Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak her bir kuyucuğa, düşük serum ortamı 10 ul ekle.
- Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak adım 2.2 düşük serum ortamı / transfeksiyon reaktifi karışımı oyuk başına 10 ul ekle. 20 ila 45 dakika bekletin.
- Tam DMEM, 80 ml 7.5 x 10 5 hücre / ml'de yeniden süspanse 293T hücreleri. Ve bir standart birim kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak göz başına hücre süspansiyonu (yani, 7.5 x 10 4 hücre), 100 ul ekle.
- Homojen hücre dağılımı için mikroskop altında kuyu kontrol edin ve 24 saat boyunca inkübatör dönmek.
3. GST-kinaz Düşürme
- F yapresh: H2O 540 ul 0.2 M sodyum vanadat 60 ul karıştırılarak 4 mM pervanadate çözeltisi Bir ikinci tüp karışımı 30% peroksit 2,7 ul PBS içinde 1.4 mi. Birlikte iki çözüm ekleyin ve kullanmadan önce 15 dakika bekletin.
- (Bu oyuk çok fazla türbülans yaratır gibi bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanmayın) Aşama 3.1'de elde pervanadate 2.5 ul ve ardından, her bir çukura 0.25 M CaCI2 2 ul dağıtmak çok kanallı pipet kullanarak. 10 dakika boyunca 37 ° C 'de, her plaka inkübe ve daha sonra buz üzerine yerleştirin.
- Bölüm 1 (reaktiflerinin preparasvonu) 'de gösterildiği gibi DTT, PMSF ve sodyum vanadat eklenerek liziz tamponu 35 ml hazırlayın.
- Buz üzerinde plakaları tutulması, her bir kuyunun bir vakum aspiratörü kullanarak orta çıkarın. Hemen standart kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 50 ul / oyuk buz soğuğu lizis tamponu ilave edin. Parçalamak için buz üzerinde 30 dk bekletin (opsiyonel: plat sızdırmazlık burada gerekirse durdurabilirsinize ve -80 ° C'de saklama. Buz üzerinde, çözülme plakaları) devam etmek.
- 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1900 x g'de Spin plakalar.
- Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanılarak hücreler kazıyın ve içeriğini aktarmak uygun V-tabanlı 96 gözlü levhalar etiketli. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1900 x g'de Spin plakalar.
- Spin sırasında, bir durulama maddesi olarak 100 ul / oyuk (PMSF) olmadan, buz sıcaklığında lizis tamponu ile glutatiyon kaplı plakalar (her biri 96-delikli plaka için bir adet) doldurun. Buz üzerinde tabak tutun.
- Santrifüj V-tabanlı plakalar çıkarın. Bir kerede bir, bir kağıt havlu üzerine lizis tamponu ve leke dışarı sallamak için bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Alt pelet rahatsız değil dikkatli olmak, plaka devirme ve çok kanallı pipet kullanarak glutatyon plakalarına V-tabanlı plakalardan lizis tamponu aktarın. Kapak plakaları ve bağlama en az 2 saat süreyle buz üzerinde bırakın.
- 2 saat bağlama aşamasında sonuna yakın, t sağlanması, bir radyoaktivite iş istasyonunu hazırlamakO gerekli güvenlik önlemleri radyoaktif çalışmalar için yerdesiniz. 30 ° C olarak ayarlayın hibridizasyon fırın.
- Bu aşamada gerekli değildir Bölüm 1. PMSF belirtildiği gibi ilave DTT ve sodyum vanadat ile liziz tamponu 200 ml hazırlayın.
- Lizis tamponu silkelemek ve bir kağıt havlu üzerine örtecek bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Durulayın kuyular (PMSF olmadan) 100 ul lizis tamponu ile 3x. Devam etmek için hazır olana kadar durulama saklayın - kuyular kuru oturup izin vermeyin.
- 10x stok seyreltilmesi ve standart bir ses kaseti ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 1x KB 50 ul 1. Durulama plakalar bir kere daha bölümünde belirtildiği gibi DTT ekleyerek 1x kinaz tamponu (KB) içinde 55 ml hazırlayın. Çözelti A hazır olana kadar kuyularda 1x KB bırakın:
- 15,9 ml kadar 530 ilgi substratın ug, miyelin bazik protein, 500 ug (MBP), 10x 2,65 ml KB, 1 M DTT 13.25 ul, ve H2O için 500 eklenerek çözelti bir hazırlayın.
- 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gama 32P ATP, ve H2O ile 10 ml ilave etmek suretiyle radyoaktivite çalışma alanında Çözelti B hazırlayın.
- Iyi İtme kuvveti nedeniyle karıştırma yardımcı olan bir tekrarlayıcı pipet kullanarak başına Çözüm B 20 ul ekleyin. Kapak ve 30 dakika boyunca 30 ° C hibridizasyon fırında inkübe edin.
- 30 dakika sonra, buz geri plakaları aktarın. Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanarak 2x SDS lizis tamponu 50 ul ekle. Bir sonraki adımda, bu noktada gerçekleştirilebilir, ya da uygun kadar -20 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza ile plakaları sızdırmaz olabilir.
4. Koşu, Boyama ve Kurutma Jeller
Not: Tüm çalışmalar bir alan DESIGNA'da yapılmalıdırradyoaktivite ted.
- Hibridizasyon fırında açın ve 85 ° C'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında Plakaları eritin. Bir kez fırın fırın ve 10 dk numune denatüre etmek için inkübe sıcaklık, devir plakaları ulaşmıştır.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak her reaksiyonun 15 ul yükleyin 26-iyi prekast jeller aynı anda birden fazla kuyu doldurun. Bakım Bütün ipuçlarını mukabil önce iyice örnekleri ekleyerek uyum dikkat edilmelidir. Bu unincorporated ATP içerdiği izleme boya (mavi çizgi) jel alt kaçıp izin vermeyin, 150 V'de jel çalıştırın.
- Jeller sökün ve bir neşter veya filmleri overexpose gibi cetvel kullanarak tüzel kişiliği olmayan ATP (mavi çizgi) kesti. Etiketli kaplar içinde jeller yerleştirin ve 15 dakika için Coomassie boyası ile kaplayın.
- Kısaca, Coomassie leke çıkarmak suyla durulayın jeller ve çözüm destain ekleyin. Jeller destain proteinler açıkça görünür olana kadar. MBP için bir bant ve alt tabaka için bir grup olmalıdırHer numune için görünür.
- Jeller kurutulması için:
- Filtre kağıdı büyük kesin, kurutma üzerine yerleştirin.
- Bu pürüzsüz olana kadar damıtılmış su içinde, bir selofan bir plaka ıslatın ve ücretsiz kırışıklık ve kağıdın üstüne yerleştirin.
- Jellerin düzen not ederek, selofan levha üstünde jeller yatırın. İkinci selofan sayfasını ıslatın ve jeller üstüne yerleştirin.
- Güzel bir üniforma yüzey tüm kabarcıklar (bir tabak sızdırmazlık silindir bunun için iyi çalışır) dışarı rulo. , Kapağını kapatın vakum açın ve 80 ° C'de 3 saat boyunca jeller kurulayın.
- Jeller kuru olduğunda, sinyal yoğunlaştırmak için bir ekran kullanılarak XAR filmi bunları ortaya çıkarmak. Saran wrap veya plastik torba ile kaseti sarın ve don dışında tutmak için bant ile mühür. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca kaseti saklayın.
5. XAR Filmleri Geliştirme
- Ertesi gün, dondurucudan kaseti çıkarmak ve oda sıcaklığında çözülme sağlar. Filmi geliştirinkaranlık oda üreticinin talimatlarına göre bir film işlemcisi kullanılarak.
Not: kinaz substrat çiftlerinin kanıt filmleri inceleyin. İkinci uzun pozlama da zayıf fosforilasyon olaylarını tespit etmek için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir ekranda Örnek sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir. 180 kinazlar CRTC2 gibi klasik kinaz deneyi alt-tabaka miyelin bazik proteini (MBP) ile ilgili aa 268-283 tekabül eden bir GST-etiketli peptid alt-tabakası kullanılarak taranmıştır. Sadece iki kinazlar MARK2 ve yüksek ölçüde ilişkili kinaz MARK3 CRTC2 peptidi fosforile. Birçok fosforlaştınlabilen kalıntısı içerir ve jelin alt kısmına doğru, 18 kDa'da çalışan olarak MBP, tüm deneylerde bir iç kontrol olarak dahil edilir. Bu özgüllük bir yorumlanması için izin verir: Bazı kinaz sağlam bir alt tabaka ve MBP fosforile olur. Burada dikkat edilmesi böylece her zaman tahlilde arka fosforilasyonu, orada (hiçbir kinaz kontrolleri yani) yalnız GST içeren kuyu her zaman bazı endojen kinaz aktivitesini arındırmak olduğunu. Bu alt tabakanın fosforilasyonu gerçek olduğunu ekarte etmez iken, daha az seçici olabilir kinaz ayarı in vitro düşündürmektedir.Bu kinaz substrat özgüllüğü ilgili sonuçlara ulaşmak için MW farklı birden fazla alt tabakaları dahil özellikle bilgilendirici.
Şekil protokolünde önemli adımları gösteren 1. Akış Şeması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kitaplığı (180 insan protein kinazlar) Sürüm 1 bir ekranın Şekil ekranı sonucu 2. Örnek. Otoradyografileri (Jansson çoğaltılmıştır ve diğ., 2008), fare CRTC2 aa 268-283 tekabül GST peptit substratı kullanılarak yapılan. MBP, miyelin bazik proteini gösterilir. S yüksek derecedeİlgili kinazlar tarafından ubstrate seçim ekranına bir özelliğidir. Her şerit, ayrı bir kinaz deneyi reaksiyon ürünlerini temsil etmektedir. MARK3 (Jel 1) ve MARK2 (Jel 16), tek kinazlar TORC2 268-283 peptit fosforile için belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yaklaşımı 14,15 tanımlayan özgün yayınlar bu yana, 180 GST-kinazlar orijinal kütüphanesi insan proteini kinome 420 üye, ya da ~% 80 genişletilmiştir. Genişletilmiş kütüphanesi ile, açıklanan protokol (gerekli görüldüğünde gibi) fosforlu ve dijital sinyal iyileştirme kullanılarak kısaltılmış olabilir, hangi filmleri geliştirmek için 4-5 gün sonra 1-4 gün sürer. Dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adımlar (protokol bakış için Bkz: Şekil 1) vardır. İlk olarak, hücre için stoklar sağlığı (mikoplazma serbest, genişleme sırasında konfluansa ulaşmalarına imkan veren hiçbir ve her geçiş için tripsin ile muamele edilmiş) bir toplu genişletme aşamasında ve transfeksiyon zamanı 96 oyuklu plakalarda plakalandı. Transfeksiyon yer (Aşama 1.5) aldığı zaman hücreler eşit tohumlanır olabilir ve% 80 konfluent olmalıdır.
İkincisi, bu hacim transf en aza indirmek için bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanmak için transfeksiyon sırasında idealdirer hataları, böylece kuyuların arasındaki varyasyon katsayısı ("cvs") sınırlayıcı. Azalan ölü hacimleri ve doğruluğu dağıtım artar küçük hacimli kaset sınırları reaktif kaybı ile dağıtıcı uydurma küçük hacimleri için. Sodyum pervanadate, bir tava tirosin fosfataz inhibitörü ile muamele aşaması, bir hedef kinazlann fosforilasyon durumunu geliştirmek için genel bir uyarıcı olarak kullanılır. Bu aşamada kalsiyum eklenmesi nedeniyle uzun süreli pervanadate tedavi ile ortaya yuvarlama hücre kaybını önleyerek, hücre-matriks yapışmasını arttırır. Bu adım 10 dakikalık inkübasyon süresi ödün vermeden yapılmalıdır.
Tüm kullanılabilecek 120 kDa gibi büyük peptidler, protein alanları, ya da sağlam proteinler: Üçüncü, kinaz deneyi kendisi için birkaç rekombinant substrat seçerken dikkat edilmesi gereken noktalar vardır. Belirli bir fosforilleme alanı biliniyorsa, bir peptit substratı en düz İleri bir yaklaşım olmakla birlikte, tespit etmek için yeterince büyük olması gerekirBir SDS-PAGE jeli üzerinde. Bu durumda, alt-tabakalar peptid> 25 bir MW elde bakterilerden GST'ye birleştirilmiş ve saflaştırılabilir. Büyük proteinler büyük olasılıkla katlanmış ve bunlar hücrede olmak, ama onlar fosforile olması ve deneyde sinyal verebilir ek kalıntılarını içerecektir dezavantaj ile geleceğini onların phosphorylatable kalıntıları ortaya avantajı var. Bizim tercih Bu iki ekrandan aday kinazların doğrulama işler gibi, in vivo olarak fosforile olduğu bilinen ve biyolojik etkinlik düzenleyen bilinen bir çökeltisini çevreleyen 15-20 amino asitten oluşan bir peptit substratı kullanılarak bir ekran çalıştırmaktır in vitro ve in vivo olarak daha hızlı.
Son protein yaklaşımları ideal miktarı ve oyuk başına 1 ug aştığı; Elbette bu substratın MW ile değişir. Kuyu başına daha az protein anlamlı hit verebilir, ancak bu sinyali arttıkça kuralın uygulandığı 'daha iyidir': noise. Degrade jeller kurutma sırasında çok sık çatlak gibi standart olmayan gradyan jeller tavsiye edilir. Jeller kurutulduktan sonra bir Geiger sayacı ile arka plan üzerinde, bir radyoaktif sinyalin tarama deneyinde başarı mükemmel bir göstergesini verir.
Ekran, in vitro olarak ve karmaşıklık ilave seviyeleri, in vivo olarak mevcut olduğu gibi, belirli bir alt-tabaka için bir aday kinaz (ler) hücrelerinde doğrulanması gerekir. Spesifik olarak, ekran ama aynı hücre tipinde ya da alt-tabaka ile aynı hücre altı bölme ifade edilmez, in vitro olarak alt-tabakanın fosforile biyokimyasal kapasiteye sahip bir aile üyesi, tespit edebilir. MARK2 ve MARK3 iki isabet Ser275 ilgili CRTC2 fosforile olabilir kinaz için olan bir şablon ile ise, örneğin, sadece MARK2 hücreleri 14 alt-tabaka ile bir kompleks oluşturulur. Aday kinazın fizyolojik önemi teyit etmek için kullanılabilecek ek bir dizi deney aşağıda verilmiştir. Köknarst aday kinaz birlikte sentezlenmesiyle, aşağıdaki SDS-PAGE üzerinde alt-tabakanın hareket kaymaları bir onay kontrol olarak da kullanılabilir. Uygun kontroller katalitik inaktif kinaz gibi kotransfeksiyon özgüllüğünü teyit edebilirsiniz. İkinci olarak, alt-tabaka, bir katalitik olarak aktif olmayan kinaz vahşi tipli mevcudiyetinde alt-tabaka içine fosfat katılmasını teyit etmek için 32 P-ortofosfat ile inkübe olup edilmiştir ile hücre özütlerinden imüno edilebilir. Üçüncü olarak, bir fosfospesifık antikor, phosphoacceptor sekansına karşı oluşturulan (biliniyorsa) ve kinaz aşırı eksprese edildiği zaman alt-tabaka fosforilasyon bir artış teyit etmek için kullanılabilir. Hedef bölgede olmayan bir phosphorylatable tortu taşıyan mutant bir substrat kullanılarak ikinci bir ekran öncesinde phosphoantibody, daha büyük bir etki ve tam boyda bir protein alt-tabakalar ile, özellikle önemli bir kontrol nesil özgünlüğünü teyit edebilir. Farmakolojik inhibisyonu candi inhibe etmek için yaklaşımlarTarih kinaz da kullanılabilir, ancak dikkatli ilgili kinazlann inhibisyonu olarak icra gereken bir underappreciated gerçektir. Son yapılabilir hücreleri aday kinaz (ler) in susturulması izlenen ve batı lekeleme fosfospesifık bir antikor ile hedef site fosforilasyon kaybı izlemek için RNAi aracılı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma NSERC hibe tarafından desteklenmiştir 386634. Biz yararlı tartışmalar için Screaton Lab üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
