Summary
В то время как транспортировка белков клеточной поверхности относительно легко изучены, визуализации оборота внутриклеточных белков намного сложнее. Здесь мы используем конструкции, включающие Фотоактивируемые GFP и продемонстрировать метод, чтобы точно следовать белка-предшественника амилоида из Гольджи вниз по течению отсеков и следить за его оформление.
Abstract
Бета-амилоид (Ар) является основным компонентом сенильных бляшек в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Ар вытекает из последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (АРР) по р и у-секретазами. Несмотря на важность Ар к AD патологии, субклеточная локализация этих расколов не установлена. Работа в нашей лаборатории и другие вовлечь систему эндосом / лизосом в обработке APP после интернализации с клеточной поверхности. Тем не менее, внутриклеточный торговля APP относительно изученной.
В то время как поверхности клеток белки исправимо многих методов маркировки, нет простых методов для следующих торговлю мембранных белков из Гольджи. Для этого мы создали APP конструкции, которые были помечены с фото-активируемый GFP (paGFP) на С-конце. После синтеза paGFP имеет низкую базальную флуоресценции, но он может быть стимулированы 413 нм света тО производят сильное, стабильное зеленую флуоресценцию. При использовании Гольджи маркер галактозил трансферазы соединен с голубой флуоресцентный белок (GalT-CFP) в качестве цели, мы можем точно photoactivate АЭС в транс-Гольджи сеть. Фото-активированный АПП-paGFP то можно проследить, как это трафиков для последующих отсеках выявленных с флуоресцентно помечены отсек белки-маркеры для раннего эндосомы (Rab5), покойный ядрышко (Rab9) и лизосом (LAMP1). Кроме того, с помощью ингибиторов обработки АРР, включая хлорохин или γ-секретазы ингибитор L685, 458, мы в состоянии выполнить импульса погони эксперименты, чтобы изучить обработку АРР в одиночных камерах.
Мы считаем, что большая доля АЭС быстро движется к лизосом без появления на поверхности клеток, а затем удаляются из лизосом с секретазой, как расколов. Эта методика демонстрирует полезность paGFP для следующих торговлю и обработку внутриклеточных белков сюдам Гольджи к выходу отсеков.
Introduction
Отличительным признаком болезни Альцгеймера (AD) является наличие сенильных бляшек и нейрофибриллярных клубков (NFTs) в головном мозге. Основным компонентом сенильных бляшек является β-амилоида (Ар). Ар вытекает из ее предшественника; амилоидного белка-предшественника (АРР) 1. Амилоидогенного Расщепление АРР начинается с удаления эктодомена от АРР бета-секретазы 2. Остальные 99-остаток карбоксильной концевой фрагмент (CTF) может быть расщеплен гамма-секретазы, чтобы произвести Ар 3-7. В то время как многие эксперименты документально расщепление клеточной поверхности APP после интернализации с клеточной поверхности в системе эндосом / лизосом, ряд недавних исследований показали, что внутриклеточный торговля APP также важную роль в регуляции его обработку 8-11.
Там было несколько попыток модуляции уровней Ар с гамма-секретазы ингибиторов и Ар Immunotherapies. Однако недавние клинические испытания с этих методов не показали никакой пользы, и, в некоторых случаях, причинение вреда 12. Неиспользованными стратегия модулировать Ар производство является изменение субклеточные локализацию АРР и Г-секретазы взаимодействия. Гольджи, плазматической мембраны, и эндосомы / лизосомы все были предложены в качестве возможных местах для гамма-расщепления APP. Исследования, проведенные в нашей лаборатории предполагает, что приложение и γ-секретазы являются резиденты белки лизосом мембраны 13. Кроме того, мы обнаружили, что лизосомальные γ-секретазы имеет кислотную оптимальный рН 13. Кроме того, подщелачивание эндосом / лизосом системы с хлорохин или NH 4 Cl, как было показано, уменьшают продукцию Ар 14. Г-секретазы ингибирование или нокаут или пресенилин приводит к накоплению АПП-CTFS в лизосом 15-17. Кроме того, нарушая APP эндоцитоз снижает Ар производство 18-20.
Несмотря на важность Гольджи в сортировочной станции для ранних белков и белков переработанных из системы эндосом / лизосом, внутриклеточный торговля APP не изучен в деталях 21. Недавние работы показали, что приложение может быть возвращен в транс-Гольджи сеть (TGN) через взаимодействие с retromer комплекса. Вниз регулирование retromer комплекса снижает продукцию Ар 8,22-24. Тем не менее, выход из приложения с Гольджи не были хорошо изучены.
В то время как после эндоцитоза белков клеточной поверхности, таких как рецептор трансферрина, легко помечены и последующим, после оборота внутриклеточных белков является более сложным. На самом деле, несколько белков были их внутриклеточной торговля образ. Появление флуоресцентный белок тегов, таких как фото-активируемый-GFP (paGFP), предоставило новые инструменты для изучения внутриклеточного транспорта. Фото-активируемый-GFP является формой GFР, что является почти невидимым после синтеза, но и развивает сильный зеленый (GFP) флуоресценции после активации 413 нм лазерного света, и этот сигнал является стабильным в течение нескольких дней 25,26. Конструкции, использующие paGFP были использованы, чтобы продемонстрировать intralysosomal оборотом белка лизосомальных мембранный белок 1 (ЛАМПА1) 25, доставка клеточной поверхности везикулярного стоматита Касперского гликопротеин (VSVG, маркер секреторной пути) 27, а оборот пероксисом 28 и 29 аутофагосом.
Для того, чтобы визуализировать сортировку приложение из TGN в живых клетках, мы разработали плазмиды выражения последние 112 аминокислот АРР, соединенные с фото-активируемый (paGFP) на С-концевой (именуемые βAPP-paGFP) 30. Мы провели также эти эксперименты с полной длины APP и достигли подобных результатов; ΒAPP используется конструкция здесь, потому что он обеспечивает более яркие изображения. Мы тогда фото активировать и# 946; АПП-paGFP только в TGN, демаркированной TGN маркера галактозилтрансферазу (Galt). Хотя приложение было помечено с paGFP визуализировать быстрое аксонов транспорт АРР и разрешение от околоядерной области, это первая демонстрация торговли APP от одного четко определенной отсека в другой 11,31,32. Здесь мы демонстрируем точную фото-активацию в пределах TGN и выход из них APP в последующих отсеках и последующего расщепления и выведения из лизосом 30. Точное фотоактивация в Гольджи широко применимо к другим системам белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сотовый покрытие и Трансфекцию
- В капот культуре клеток, плиты ~ 300000 ~ 500000 SN56 клетки (вид подарка доктора Джейн Rylett) на 35 мм со стеклянным дном конфокальной блюдо и накрыть предварительно трансфекции СМИ (Игла в модификации Дульбекко DMEM, с добавлением 10% FBS).
- Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора размножаться.
Примечание: Клетки должны быть примерно на 50% -70% сливной до трансфекции. - В капот культуре клеток, трансфекции клеток плазмидами, экспрессирующими флуоресцентный белок помечены TGN маркера (галактозил трансферазы, соединенный с голубой флуоресцентный белок, GalT-CFP), флуоресцентный белок помечены отсека маркер (здесь лизосом связано мембранный белок 1, LAMP1, помеченным MRFP), и представляющий интерес белок с тегами paGFP (βAPP-paGFP). (Эти конструкции были описаны ранее 30)
- Инкубируйте клетки с реагента для трансфекции ДНК и плазмиды Fили 24 ч при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе. Использовать соотношение ~ 2 мкг ДНК 5 мкл агентом трансфекции (например Липофектамин 2000), чтобы наилучшим балансом цитотоксичности и эффективности трансфекции. Действительные концентрации возможно, должны быть оптимизированы для различных плазмид. В экспериментах, описанных здесь, используют 1 мкг / конфокальной блюдо βAPP-paGFP, 0,3 мкг / конфокальной блюдо LAMP1-MRFP и 0,2 мкг / конфокальной блюдо GALT-CFP.
Примечание: Количество плазмиды будут зависеть от эффективности трансфекции. - Для нейронных клеточных линий: После этапа 1.4, в капот культуре клеток, предварительно удалить трансфекции носители и дифференцировать SN56 клеток в 2 мл среды DMEM, дополненной 0,1% пенициллина / стрептомицина с 1 мМ дибутирил цАМФ (dbcAMP) в течение 24 ч.
2. Микроскоп Подготовительный этап
- Предварительно теплой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), и Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) до 37 ° С. Разминка столик микроскопа, прежде чем томографовнг до 37 ° С.
- Промывают клетки дважды ЗФР для удаления среде для дифференцировки и заменить 2 мл HBSS при 37 ° С. Место клетки на предметном столике микроскопа нагревают до 37 ° С.
Примечание: Клетки являются жизнеспособными в течение примерно 1,5-2 ч в HBSS. - Разрешить 5-10 мин для конфокальной температура пластины, чтобы уравновесить с столике микроскопа.
3. Фото-активация трансформирования более Гольджи
- С окуляр микроскопа, найти клетки, трансфицированные GALT-CFP, LAMP1-MRFP и βAPP-paGFP.
- Используйте масло-иммерсионного объектива с большим увеличением (т.е. 63X или 100X). Для визуального конформации флуоресценции, использовать набор фильтров способны визуализировать FITC (для CFP и GFP флуоресценции) и родамин (для флуоресценции MRFP).
- Установка конфокальной кусочек для каждого канала до 1 мкм. Возьмите с низким разрешением изображения.
- Растениеводство к изображению только ячейка интерес.
- Использование ручки регулировки, вручную установитьфокальная плоскость к середине клетки. Это, как правило, часть клетки, где ядро является крупнейшим.
- Нарисуйте 3-5 круговых областях интересов (трансформирования) в TGN (флуоресценция GalT-КФП).
- Чтобы нарисовать трансформирования (т.е. в программе Zeiss LSM), выберите кнопку "Изменить" ROI в командной консоли.
- Выберите круглую кнопку ROI.
- Нажмите и перетащите GALT-CFP положительных регионы клетки.
Примечание: фото-отбеливание пакеты для многих микроскопов имеют такой возможности.
- Возьмите изображение клетки с накладным трансформирования. Сохранить копию трансформирования для дальнейшего использования.
- Чтобы сохранить трансформирования к изображению, нажмите кнопку "Macro".
- Нажмите кнопку "Загрузить", чтобы начать "CopyRoisToOverlay" (путь к файлу C: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
Примечание: конфокальной микроскопии, оснащенный 475-525 нм (CFP) полосовой (BP), A 500-530 нм ВР (GFP)и еще 560 нм длинный пас (ЛП) наборы фильтров не требуется. Аргонового лазера для 458 нм и 488 нм излучения и гелий-неонового лазера для излучения 540 нм также требуется.
- Настройка микроскопа для временного отбеливатель конечно.
- Установите лазерный диод (25 нм лазерный мВт 405) на максимальной мощности.
Внимание: Чрезмерное фото-активации может привести к фото-токсичности или повреждения клеточных мембран. Используйте защиту для глаз, чтобы избежать повреждения сетчатки. - Настройка микроскопа для 120 циклов визуализации.
Примечание: Один цикл состоит из изображений отбеливания в пределах трансформирования и визуализации всей клетки. Это время отбеливателя Конечно. - Установите микроскоп для отбеливания (фото дезактивировать) только трансформирования в течение 20-30 итераций после каждого изображения. Время изображения и отбеливателя изображение будет меняться. Установите время задержки между изображениями, так что каждый цикл примерно 30 сек.
Примечание: часть изображения каждого цикла занимает примерно 15-30 секунд, в зависимости от размера изображения. Отбеливание для каждого ROЯ около 50 мс. Отбеливание всех 4 трансформирования для 20 итераций будет 4 сек в конце каждого цикла отбеливателя / изображения.
- Установите лазерный диод (25 нм лазерный мВт 405) на максимальной мощности.
- Начните времени отбеливатель курс.
- Выключите отбеливание после 15 мин (30 циклов изображений и отбеливания), но по-прежнему захвата изображения клетки.
Примечание: Время от 0 до 15 мин, пульса »период. - Продолжить захвата изображений в течение 45 мин (без отбеливания), следить за оформление βAPP-paGFP.
Примечание: Время 15 до 45 мин является "Погоня" период. - Использование метода анализа, описанного в пункте 6, совместно локализовать интерес белок (здесь, βAPP-paGFP) с отсеком интереса (здесь ЛАМПА1-MRFP) путем окончательного поверхностей каждого канала.
4. Определить Downstream отсек
- Чтобы определить, лизосомы (в этих экспериментах), являются окончательными отсек, добавить мембранные проницаемым ингибиторы протеазы вызывают белки накапливаются в лизосомах.
- Для βAPP, использовать 0,5 мкм L685, 458 (удельный γ-секретазы ингибитор) в течение ночи или 100 мкм хлорохин (deacidifies лизосом) в течение 30 мин до визуализации.
- Найти клетки и photoactivate как в шаге 3.1 - 3.8.
- Изображение клетка для дополнительного 45-мин (без фото-активации), чтобы определить, где βAPP-paGFP накапливается в отсутствие расщепления.
- Анализ доставку белка в лизосомах (или другой последующей отсеке) и последующей очистки в соответствии с методом, описанным в пункте 6.
5. Убедитесь, Точность фотоактивация в Гольджи
- Разминка ССРХ до 37 ° C.
- Приготовьте раствор 2 мл, для каждого конфокальной пластина для включения в образ, 66 мкМ нокодазолом (лечение) или ДМСО (контроль) в HBSS.
- С одной конфокальной пластины, пипетки 2 мл 37 ° C HBSS и добавить 7,96 мкл нокодазолом из 16,60 мМ нокодазолом складе.
- В качестве контроля, таклюция, пипетки 2 мл 37 ° C HBSS в 2 мл пробирку и добавляют 7,96 мкл ДМСО.
- Инкубируйте клетки в HBSS с нокодазолом или ДМСО в течение 5 мин перед визуализации.
- Найти клеток, как в шаге 3.1.
- Перед фотоактивации, подготовить микроскоп взять Z-Stack после периода фото-активации.
- Нажмите на кнопку 'Z' Stack. Начните сканирование с помощью быстрого XY.
- Отрегулируйте фокальной плоскости с регулировкой микроскоп ручки к верхней части ячейки. Нажмите 'Марк-первых ", чтобы установить первую позицию в стеке.
- Регулировка фокальной плоскости с регулировкой микроскопа ручки к нижней части (ближайший к стеклу) клетки. Нажмите 'Марк Последняя', чтобы установить последнюю позицию в стеке.
- В Z панели стека, нажмите кнопку "Z" срезов. Установите интервал '' до 1 мкм.
Примечание: Для выше пространственное разрешение стек меньше интервал стека, но больше изображений потребуетсяпринимать удлинение периода формирования изображения для стека.
- Отбеливатель клетки, как описано в стадии 3,7-3,8. Фото активировать и изображения от 0 мин до 15 мин (30 кадров).
- Остановка изображений после 30 кадров. Сразу сохранить изображение видео.
Внимание: Некоторые микроскопы может перезаписать первое видео, если оно не сохраняется перед началом второй последовательности изображений. - После сохранения видео, сразу приобретают Z-Stack, используя параметры, начиная с шага 5.5.
- Совместное локализации βAPP-paGFP с GALT-CFP (или другого маркера Гольджи), как описано в пункте 6.
Примечание: CFP быстро фотоотбеливатели и не может быть виден в конце периода обработки изображений. Колокализации не может быть возможным с GALT-CFP. Если колокализация требуется, используйте MRFP пометить Galt.
6. везикул Фильтрация и колокализации
- Используйте программу анализа (например, Imaris), чтобы сделать поверхности отсека (например, ЛАМПА1-MRFP) и белка Oе интерес (например, βAPP-paGFP).
- Введите раздел "Превзойти" программы анализа, нажав на кнопку превосходят по верхней строке меню.
- Выберите кнопку поверхности мастера в верхней части левого большей панели (5-й кнопка слева).
- Выберите канал для фильтрации везикул (т.е. βAPP-paGFP флуоресценции белка, интерес).
- Выполните вычитание фона, представив диаметр крупнейшего пузырька в поле мастера и нажмите Далее. Программа анализа автоматически выбирает - на основе порогового значения, полученного из крупнейших пузырька в области - область в канале интерес.
- Ручная регулировка порогового фона, чтобы уточнить выбор, если нужно.
- В нижней части экрана выбора порога, флажок «Сплит», касаясь объектов, чтобы отделить сочетании поверхностей.
Примечание: Если много пузырьков тесно сгруппированы вГефер программа анализ группы эти объекты под одной поверхности.- Выберите 10-15 представительства пузырьки и рассчитать средний диаметр пузырьков и введите результат в мастера.
- Уточните выбранных точек семян путем увеличения или уменьшения порога на "качество" (интенсивность канала в середине каждого пятна).
Примечание: Поверхности канала интерес будет создан. Дальнейшее уточнение выбранных поверхностей может быть выполнена в этой точке. Пороговые везикулы, основанные на количестве пикселей в каждом пузырьке. - Маска исходного канала с этой поверхности. Для маскировки, выберите вкладку 4-й слева в мастере создания поверхности (карандаш).
- Выберите "Маска Все". Новый канал с везикул интерес будет создан.
Примечание: Во время процесса маски, возможность дублировать исходный канал предлагается. Выберите эту опцию, если нужно исходные данные должны быть сохранены. - Повторите сТЭЦ 6.1 через 6,7 для нефильтрованного канала (т.е. ЛАМПА1 MRFP, в салоне).
- В верхней панели инструментов, выберите инструмент колокализации.
- В верхней панели, а появляются гистограммы каналов для локализуется, выберите недавно созданные в масках каналов.
- Выберите все имеющиеся данные. Есть темные пикселы, которые иногда присутствуют после анализа. Не выбирайте эти пиксели на гистограмме, они будут исказить результаты.
- В далеком правой панели выберите 'Build Coloc канал ". Это создает новый канал, содержащий только локализуется пикселей. Эти данные будут в той же панели под кнопку "Channel Statistics '. Эти данные могут быть экспортированы в CSV-файл.
- Используйте 'Процент Материал локализуется' статистика. Эта опция учитывает интенсивность пикселей и размером объекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные результаты показывают, βAPP оставляя TGn и, кажется, трафик быстро LAMP1 (рис 1а, б). В период фото-активации, пузырьки можно увидеть вылетающих Гольджи, предназначенный для лизосом (рис 1b). Без лечения ингибитором, флуоресценция paGFP будут видны в лизосомах, а есть фото-активации в TGN. После остановки фотоактивацию, то βAPP-paGFP быстро очищается от лизосом (сравните рис 1а к 1b). Лечение нокодазолом приводит к накоплению APP внутри GALT-CFP помечены отсеков и предотвращает торговлей в лизосомы (рис 1c).
Шведская мутация APP (APPsw) увеличивает скорость бета-расщепления в 10 раз 34. При быстром расщеплении βAPPsw-paGFP, флуоресценция paGFP появляется как диффузного сигнала флуоресценции в цитозоле. Предположительно, это яс результатом быстрого βAPP расщепления гамма-секретазы освобождения С-концевой paGFP в в цитоплазму (рисунок 2). В присутствии ингибитора γ-секретазы, βAPP накапливается в лизосомах.
После сдачи βAPP в лизосомы, флуоресценция paGFP быстро очищается. Короткое время резиденция может быть результатом торговли с лизосом в другой отсек. С другой стороны, расщепление βAPP от гамма-секретазы можно было бы ожидать, приведет к диффузии paGFP флуоресценции от лизосом мембраны (3а). Диффузный флуоресценции более трудно обнаружить с помощью конфокальной микроскопии. Чтобы определить, является ли βAPP доставлен к другому отсека или очищена, SN56 клетки обрабатывали специфическим ингибитором против гамма-секретазы (L685, 458) или защелачивающие агента (хлорохин). Добавление или L685, 458 или хлорохин в результате накопления в APP лизосом (
Принято считать, что приложение поставляется с клеточной поверхности, прежде чем эндоцитированный и обрабатываются в эндосомы и лизосомы 35. Тем не менее, в наших необработанных клеток, клеточной поверхности βAPP не мог быть обнаружен с помощью конфокальной микроскопии. Фото-активированный βAPP не может быть сосредоточена в определенной области плазматической мембраны. Вместо этого, может быть диффузное флуоресценции по большой площади поверхности плазматической мембраны. Интересно, что γ-секретазы обработка ингибитором приводит к детектируемой βAPP-paGFP на клеточной поверхности (3б). γ-секретазы обработка ингибитором может маршрутизировать более βAPP к клеточной поверхности, в дополнение к ингибированию фермента функцию. Таким образом, большая площадь поверхности плазматической мембраны распространяется paGFP по большей площади и делает обнаружение трудно, хотя белок продают в отсеке.
1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53153 / 53153fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Воображение с торговлей приложение для лизосом. SN56 клетки трансфицировали LAMP1-MRFP, GALT-CFP, и βAPP-paGFP. А) В камере было точно фото-активируется в течение трансформирования помещается на Гольджи (трансформирования, обозначенной белыми кругами ). В камере было альтернативы фото-активированный и отображаемого на 15 мин, чтобы определить, торговлей βAPP-paGFP. Врезка показывает торговлей внутри околоядерной области от Гольджи в лизосомы. Co локализованные пикселей появляются желтые. Б) торговли везикулы, содержащей βAPP-paGFP в лизосомы. Желтые пикселей обозначения LAMP1 и βAPP-paGFP колокализация. C) SN56 клетки обрабатывали нокодазолом, прежде чем изображения, чтобы предотвратить βAPP-paGFP эвакуацию из TGN. Представитель изображение, полученное от конца периода фото-активации. На правой панели, Ъ-стек и той же клетке принимать сразу после фото-активации. Чт е GalT-КФП была ложной цветной красный, чтобы улучшить визуализацию локализуется GALT-CFP и βAPP-paGFP. Желтые пикселей обозначения колокализацию между GALT-CFP и βAPP-paGFP. Масштабные бары представляют 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Торговля βAPPsw-paGFP. Клеток SN56 трансфецировали LAMP1-MRFP, GALT-CFp и βAPPsw-paGFP (βAPP с семейной шведской мутацией). Шведская мутация увеличивает скорость, что АРР расщепляется. Клетки альтернативы в Гольджи фото-активированного и образ. Диффузный флуоресценции можно увидеть после paGFP отсоединяется от лизосом мембраны диффундировать в цитоплазму. Масштабная линейка составляет 5 мкм.53 / 53153fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Определение терминала органеллы. SN56 клетки трансфицировали LAMP1-MRFP, GALT-CFP и βAPP-paGFP. После фото-активации, а затем клетки были еще в течение 45 мин. Два крайних левых панели показывают клетки до фотоактивации (левая) и через 15 мин после фотоактивации (средний). Панель в правой показывает флуоресценцию APP после 45 мин от общего изображений в необработанном), б) γ-секретазы ингибитор лечение, или в) хлорохин лечение. Наконечники указывают на APP колокализуются с LAMP1 после 45 мин визуализации. Масштабные бары представляют 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию гоэто цифра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод описывает точную фото-активацию мембранных белков с меткой paGFP в TGN для визуализации последующее торговлей людьми и расщепление. В то время как paGFP был создан более десяти лет назад 25, это первый пример точного фото-активации следовать торговлей зарождающихся белков ниже по течению отсеков. Предыдущие исследования с использованием APP-paGFP строит фото-активировал пери-ядерного область ячейки, которая была считается Гольджи 11. Однако, как видно, в наших микрофотографий, лизосом, эндосом, первые и поздние эндосомы также могут быть найдены в этой области (рис 1 и опорным 30). Эти эксперименты были успешно работать в клетках НЕК293, COS 7 клеток, нейронных клеток SN56, SH-SY5Y, и нейронов мыши, хотя эффективность трансфекции нейронов мыши низка. Подобные эксперименты были проведены с использованием полной длины APP конструкции и укороченные конструкции, которые включают в последний 112 аминокислоты АРР, с бета- и γ-сайтов расщепления, слитый с paGFP. Укороченные конструкты легче трансфекции и обеспечить более высокий флуоресцентный сигнал, и они показаны на прилагаемых чертежах. Наши укороченные конструкции также не хватает N-терминал эктодомен, который имеет неопределенные раскол и сортировки сигналов 38. Несмотря на эти N-терминал сигналов и расколов, мы обнаружим, что наша конструкция имеет сокращен подобная локализация и торговлей как полной длины АПП-paGFP 30, 33.
Из-за многих органелл в пери-ядерного области клетки, было сделано все возможное, чтобы обеспечить точность фото-активации. В течение периода формирования изображения, клетка и Гольджи будет двигаться. Таким образом, трансформирования фотоактивация должны быть тщательно проверены в течение периода фотоактивация и регулировать, чтобы остаться на верхней части аппарата Гольджи. Конфокальные микроскопы чувствительны к малейшим изменениям в температуре. Например, переменного или нагревательными приборами за microscoПЭ может привести к изменению плоскости изображения.
Для того, чтобы обеспечить согласованность между экспериментов, мы поставили временную задержку между каждой фото-активации цикла / изображения. Требуется время, чтобы отбелить трансформирования и изображения ячейку. В зависимости от размера ячейки и количества трансформирования, время для отбеливания и принимать одно изображение будет меняться. В целях поддержания согласованности от изображения к изображению, установить время задержки между изображениями, так что каждый образ, в том числе отбеливания, требуется примерно 30 секунд. Увеличение временное разрешение может быть достигнуто с помощью системы обнаружения, которые используют Формирователь пучка (например LSM5 Живая детектора). Эти микроскопы могут изображение на 120 кадров / сек без потери в разрешении.
Чтобы подтвердить достоверность фото-активации, это необходимо, чтобы выполнить нокодазол контроль. Блокируя транспорт из Гольджи в ходе фото-активации, это гарантирует, что paGFP не будучи значительно активизировались в других отсеках.CFP фото-отбеливатели быстро при повторном изображений и отбеливание и может сделать совместную локализацию с GALT-CFP трудно. Если основная часть флуоресценции paGFP остается в области Гольджи, это также может указывать точную фото-активации. Кроме того, GalT могут быть помечены MRFP, что более фотографического стабильным, чем CFP в этих экспериментах.
Улучшенная активации в аппарате Гольджи также может быть достигнуто с многофотонной микроскопом в. В то время как конфокальной плоскости отображения в этих экспериментах, как правило, ломтик 1 мкм, лазер для обработки изображений и фото-активации будет проходить через всей клетки. Многофотонной лазер может быть использован для этих экспериментов, и может повысить точность всех трех измерений 35. Однако, как показали здесь, традиционный 405 нм лазерный диод достаточно точно фото активировать βAPP-paGFP в TGN.
В качестве контроля, мы провели аналогичные опыты по флуоресценции VSVG-paGFP. VSVG-paGFP, чтоконституитивно доставлены в клеточной поверхности 27,37, визуализировали доставляется конкретных субрегионов мембраны плазмы 30. Это гарантирует, что транспорт внутриклеточных не вызвана сверхэкспрессии или при наличии тега paGFP.
Диффузный флуоресценции paGFP может быть трудно локализовать конфокальной микроскопией. По нашему опыту, приложение быстро расщепляется и, кажется, имеют короткий срок службы в качестве полноразмерного белка в лизосом мембраны. Эта проблема усугубляется шведской ФАД мутации, что ускоряет скорость расщепления APP 34. Применять технику для быстрого расщепленных белков, ингибитор имеет решающее значение для определения окончательного вниз по течению отсек. Ингибирование гамма-секретазы с L685, 458 или хлорохин приводят к значительному накоплению в лизосомах APP; даже со шведской мутацией.
Если используется слишком много ингибитора, это может привести к внутриклеточной переменного токакумуляции βAPP-paGFP, и может привести к белковых включений. Накопленный paGFP в включений приводит люминесцентных paGFP включений в клетке до запуска эксперимента (наши неопубликованные наблюдения, т.е. лечения в течение ночи с 40 мкМ хлорохин). Концентрацию ингибитора, который предотвращает расщепление белка, представляющего интерес, но не приводит к образованию включений должен быть использован. За-трансфекции клеток с paGFP также может вызвать очевидные включения paGFP, которые и будут светиться без фото-активации. Недавно фото активирована paGFP будет преимущественно трафик этих включений и вмешиваться в интерпретации результатов. При поиске клеток к изображению, во избежание клетки с очевидными paGFP включений. В нашем опыте с βAPP-paGFP, есть очень слабый зеленый флуоресцентный в клетках, которые экспрессируют βAPP-paGFP на соответствующем уровне. Это слабый флуоресценции, как правило, не могут быть отображены, и можно увидеть только через окуляр.
(т.е. мембране) может быть трудно обнаружить. Это может быть потому, что флуоресцентный сигнал, распространяется на большой площади, разбавляют или потому, что профиль мембраны в поперечном сечении ниже разрешением конфокальной микроскопии. Это может быть возможным, чтобы обойти эту проблему, с помощью визуализации эпифлуоресцентной микроскопа. Тем не менее, это значительно уменьшить пространственное разрешение метода.
Преимущество этого метода является его применимость к другим мембранных белков. Хотя этот метод зависит от более экспрессии некоторых белков, кажется, что торговля белок не открыто нарушается, как это было продемонстрировано с VSVG-paGFP и βAPP-paGFP 30. В дополнение к лизосом, другие маркеры эндосом / лизосом системы также были успешно использованы. Они включают в себя Rab5-MRFP для раннего концаosome и rab9-mchFP (вишня флуоресцентный белок) для поздних эндосом. Это мощная техника микроскопия может быть продлен следовать оборота других белков из TGN. Это может быть в равной степени применяются следовать торговлей между дискретными отсеков, предусмотренных четко определенные отсек маркеры доступны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы или конфликта интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
