Summary
細胞表面タンパク質の輸送を比較的容易に研究されているが、細胞内タンパク質の輸送を可視化することははるかに困難です。ここでは、光活性化GFPを組み込んだコンストラクトを使用して、正確にダウンストリームの区画にゴルジ体からのアミロイド前駆体タンパク質に従い、その隙間に従うようにする方法を実証します。
Abstract
β-アミロイド（Aβ）は、アルツハイマー病患者の脳に見られる老人斑の主要構成成分です。 Aβは、βおよびγセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の連続的切断に由来します。 AD病理へのAβの重要性にもかかわらず、これらの切断の細胞内局在は、十分に確立されていません。我々の研究室での作業などが細胞表面から内部移行した後のAPP処理にエンドソーム/リソソーム系を巻き込みます。しかし、APPの細胞内輸送は比較的understudiedです。
細胞表面タンパク質は、多くの標識技術に修正可能であるが、ゴルジ体からの膜タンパク質の輸送を以下のための単純な方法は存在しません。この目的のために、我々はC末端に光活性化GFP（paGFP）でタグ付けされたAPPコンストラクトを作成しました。合成後、paGFPは低い基底蛍光を有するが、413 nmの光Tで刺激することができO強く、安定した緑色の蛍光を生じます。ターゲットとしてシアン蛍光タンパク質（GalTの-CFP）に結合されたゴルジマーカーガラクトシルトランスフェラーゼを使用することにより、我々はトランスゴルジネットワーク内の正確光活性化するAPPすることができます。それは蛍光で識別下流区画にトラフィック早期エンドソーム（Rab5の）、後期エンドソーム（Rab9）およびリソソーム（LAMP1）のためのコンパートメントマーカータンパク質をタグ付けとして光活性化APP-paGFPは、その後に続くことができます。さらに、クロロキンまたはγセクレターゼ阻害剤L685、458を含むAPP処理に阻害剤を使用して、我々は、単一の細胞内でAPPのプロセシングを調べるために、パルスチェイス実験を実行することができます。
我々は、APPの大部分は、細胞表面に現れることなく、リソソームに迅速に移動し、その後セクレターゼ様の切断によってリソソームから除去されることがわかります。この技術はあちこち細胞内タンパク質の輸送と処理を以下のためpaGFPの有用性を実証下流の区画にゴルジ体をメートル。
Introduction
アルツハイマー病（AD）の特徴は、脳における老人斑および神経原線維変化（NFT）の存在です。老人斑の主要構成成分はβアミロイド（Aβ）です。 Aβは、その前駆体から誘導されます。アミロイド前駆体タンパク質（APP）1。 APPのアミロイド形成性切断がβセクレターゼ2によるAPPの細胞外ドメインの除去から始まります。残りの99残基のカルボキシル末端フラグメント（CTF）は、Aβ3-7を生成するために γセクレターゼによって切断され得ます。多くの実験は、細胞表面からエンドソーム/リソソーム系に内在化した後、細胞表面APPの切断を記録しているが、最近の多くの研究は、APPの細胞内輸送は、その処理8-11の調節においても重要であることを示唆しています。
γセクレターゼ阻害剤とのAβIMMUNとAβのレベルを調節で多くの試みがなされていますotherapies。しかしながら、これらの治療法との最近の臨床試験は全く効果を示さなかった、そして、いくつかのケースでは、12害を引き起こしました 。 Aβ産生を調節する未開発の戦略は、APPの細胞内局在およびγセクレターゼの相互作用を変化させることです。ゴルジ、形質膜、およびエンドソーム/リソソームは、すべてのAPPのγ切断の可能なロケールとして提案されています。我々の研究室からの研究は、APPおよびγセクレターゼは、リソソーム膜13の常駐タンパク質であることを示唆しています。さらに、我々は、リソソームγセクレターゼは、酸性至適pH 13を有していることを見出しました。さらに、クロロキンまたはNH 4 Clでエンドソーム/リソソーム系のアルカリ、Aβ14の産生を減少させることが示されています。 γセクレターゼ阻害またはノックアウトまたはプレセニリンは、リソソーム15-17におけるAPP-CTFSの蓄積につながります。また、APPのエンドサイトーシスを中断すると、Aβ産生18-20を低下させます。
エンドソーム/リソソーム系からリサイクル新生タンパク質およびタンパク質のための仕分け局としてゴルジ体の重要性にもかかわらず、APPの細胞内輸送を詳細21で検討されていません。最近の研究は、APPはレトロマー複合体との相互作用を介してトランスゴルジネットワーク（TGN）に再循環させることができることを示しています。レトロマー複合体のダウンレギュレーションは、Aβ産生8,22-24を減少させます。しかし、ゴルジ体からのAPPの出力は十分に研究されていません。
そのようなトランスフェリン受容体などの細胞表面タンパク質のエンドサイトーシスに追従して、容易に標識され、続いており、細胞内タンパク質の輸送以下がより困難です。実際には、いくつかのタンパク質は、それらの細胞内輸送が撮像ありました。このような光活性化-GFP（paGFP）などの蛍光タンパク質タグの出現は、細胞内輸送を調べるために新しいツールを提供してきました。光活性化-GFPは、GFの一形態であります合成後、ほとんど目に見えないですが、413 nmのレーザー光によって活性化された後、強い緑色（GFP）の蛍光を開発し、この信号は日25,26のために安定している、P。 paGFPを用いた構築物は、リソソームタンパク質のリソソーム内輸送を実証するために使用されている膜タンパク質1（LAMP1）25、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSVG、分泌経路のマーカー）27の細胞表面の配信、及びペルオキシソームの代謝回転28とオートファゴソーム29。
生細胞にTGNからのAPPのソートを可視化するために、我々は、C末端（βAPP-paGFPという）30上の光活性化（paGFP）に結合されたAPPの最後の112アミノ酸を発現するプラスミドを設計しました。我々はまた、完全長のAPPでこれらの実験を行い、同様の結果を達成しています。それは明るい画像を提供するため、βAPP構築物は、ここで使用されています。我々その後、フォトアクティブ＆＃946;のみTGNにおけるAPP-paGFP、TGNマーカーガラクトシルトランスフェラーゼ（GalTの）によって区画として。 APPは核周辺領域からAPPおよびクリアランスの迅速な軸索 輸送を視覚化するためにpaGFPでタグ付けされているが、これは別の11,31,32に1慎重に定義された区画からのAPP人身売買の最初の実証です。ここでは、正確なTGN内の光活性化と下流の区画およびリソソーム30からの後続の切断や隙間にAPPの出力を示しています。ゴルジ内で正確な光活性化は、他のタンパク質系に広く適用可能です。
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Protocol
1.細胞播種とトランスフェクション
- 細胞培養フードでは、35mmのガラスボトム共焦点ディッシュのプレート〜300,000〜50万SN56細胞（博士ジェーンRylettの親切な贈り物）とを補充したプリトランスフェクション培地（ダルベッコ改変イーグル培地、DMEM、でカバー10％FBS）。
- 増殖する5％CO 2インキュベーター中で37℃で一晩細胞をインキュベートします。
注：細胞を、トランスフェクション前に約50％〜70％コンフルエントにする必要があります。 - 細胞培養フードでは、蛍光タンパク質は、TGNマーカーをタグ付け発現するプラスミドでトランスフェクト細胞（シアン蛍光タンパク質、のGalT-CFPに接続されたガラクトシルトランスフェラーゼ）、蛍光タンパク質は、でタグ付け（ここでは、リソソーム関連膜タンパク質1、LAMP1、コンパートメントマーカーをタグ付けMRFP）、およびpaGFP（βAPP-paGFPでタグ付けされた目的のタンパク質）。 （これらの構築物は、以前30に記載されています ）
- トランスフェクション試薬およびプラスミドDNAのFで細胞をインキュベートまたは5％のCO 2インキュベーター内で37℃で24時間。ベストバランスの細胞毒性およびトランスフェクション効率にトランスフェクション剤を5μl（例えばリポフェクタミン2000）へのDNA〜2μgの比を使用してください。実際の濃度は異なるプラスミドに合わせて最適化する必要があるかもしれません。ここに記載した実験では、1μgの/共焦点βAPP-paGFPの皿、ランプ1-MRFPの0.3μgの/共焦点皿、および0.2μgの/のGalT-CFPの共焦点皿を使用しています。
注：使用したプラスミドの量は、トランスフェクション効率に依存します。 - 神経細胞株のために：ステップ1.4の後、細胞培養フード内で、予めトランスフェクション培地を除去し、1mMの24時間サイクリックAMP（のdbcAMP）をジブチリル0.1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した2mLのDMEM中SN56細胞に分化します。
2.顕微鏡ステージ準備
- プレ暖かいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、37°Cにハンクス平衡塩溶液（HBSS）。 imagi前にウォームアップの顕微鏡ステージ37℃にNG。
- 分化培地を除去し、37℃でのHBSS 2mlで置換するために、PBSで細胞を2回洗浄します。顕微鏡ステージの上に置いて細胞を37℃に温めました。
注：細胞をHBSSで約1.5〜2時間のために実行可能です。 - 顕微鏡ステージと平衡する共焦点プレート温度5〜10分を許可します。
ゴルジ体の上にROIの3光活性化
- 顕微鏡の接眼レンズでは、GalTの-CFP、LAMP1-MRFP、およびβAPP-paGFPでトランスフェクトした細胞を見つけます。
- 高倍率（ すなわち 63Xまたは100X）で油浸レンズを使用してください。蛍光の視覚的な立体構造のため、およびローダミン（MRFP蛍光用）（CFPとGFP蛍光について）FITCを可視化することのできるフィルタセットを使用しています。
- 1μmの各チャネルの共焦点スライスを設定します。低解像度画像を撮ります。
- 興味のあるセルのみ画像をトリミング。
- 調整ノブを使用して、手動で設定セルの中央に焦点面。これは、典型的には、核が最大であるセルの一部です。
- TGN（GalTの-CFPの蛍光）内（のROI）興味の3-5の円形領域を描画します。
- （ すなわちツァイスLSMプログラムで）のROIを描画するには、コマンドコンソールの「編集ROI」ボタンを選択します。
- 円形ROIボタンを選択します。
- 細胞のGalTの-CFP陽性領域の上をクリックしてドラッグします。
注意：多くの顕微鏡用光退色パッケージはこの能力を持っています。
- オーバーレイのROIを用いて細胞の画像を取ります。後で参照するためのROIのコピーを保存します。
- 画像へのROIを保存するには、「マクロ」ボタンを選択します。
- 「CopyRoisToOverlay '（C：/AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvbファイルパス）を開始するには、「読み込み」ボタンを押します。
注：475から525ナノメートル（CFP）、バンドパス（BP）を搭載した共焦点顕微鏡、500から530 nmのBP（GFP）、そして、560 nmのロングパス（LP）フィルターセットが必要です。 458 nmおよび488 nmの発光及び540 nmの発光のためのHeNeレーザー、アルゴンレーザーも必要です。
- セットアップ漂白時間経過のための顕微鏡を。
- 最大電力のレーザダイオード（25 mWの405 nmのレーザーを使用）を設定します。
注意：過度の光活性化は、細胞膜への光毒性または損傷につながる可能性があります。網膜の損傷を避けるために、目の保護を使用します。 - セットアップイメージングの120サイクルの顕微鏡を。
注：1つの撮像サイクルは、関心領域内で漂白され、セル全体の画像で構成されています。これは、漂白時間コースです。 - 漂白剤（光活性化）すべての画像の後に20〜30回の反復のための唯一のROIに顕微鏡を設定します。イメージが異なります画像や漂白までの時間。各サイクルは、約30秒であるので、画像間の遅延時間を設定します。
注：各サイクルの撮像部は、画像サイズに応じて約15〜30秒を要します。各RO用漂白私は約50ミリ秒です。 20回の反復のためにすべての4 ROIの漂白は、各漂白/画像サイクルの終わりに4秒かかります。
- 最大電力のレーザダイオード（25 mWの405 nmのレーザーを使用）を設定します。
- 漂白時間経過を開始します。
- 15分（イメージングおよび漂白の30サイクル）後に漂白をオフにするが、細胞の画像を撮影し続けます。
注：15分までの時間0は、「パルス」期間です。 - βAPP-paGFPのクリアランスを追跡するために、45分（漂白なし）用の画像を撮影を続行します。
注意：時間15〜45分は「チェイス」期間です。 - 各チャンネルに表面を作ることによって（ここでLAMP1-MRFP）の工程6に記載の分析方法を使用して、関心のある区画と（ここで、βAPP-paGFP）目的のタンパク質の共局在。
4.ダウンストリームコンパートメントを決定
- （これらの実験において）、リソソームが、最終的なコンパートメントあるかどうかを判断するには、タンパク質がリソソーム内に蓄積させるために膜透過性プロテアーゼ阻害剤を追加します。
- βAPPは、イメージングの前に30分間、0.5μML685、458（特定のγセクレターゼ阻害剤）で一晩または100μMのクロロキン（deacidifiesリソソーム）を使用します。
- 3.8 - ステップ3.1のように細胞と光活性化するを検索します。
- βAPP-paGFPは、切断の非存在下での蓄積場所を決定するための画像（光活性化なし）さらに45分のためのセル。
- ステップ6に記載の方法に従ってリソソーム（または他の下流の区画）へのタンパク質の送達およびその後のクリアランスを分析します。
5.ゴルジ内で光活性化の精度を確保
- 37°CまでのウォームアップHBSS。
- すべての共焦点プレートをHBSS中の66μMノコダゾール（処理）またはDMSO（コントロール）の、画像化するために、2ミリリットル溶液を調製します。
- 1共焦点板、ピペット2、37℃のHBSS mlの16.60 mMのノコダゾールストックからノコダゾールの7.96μlを添加するために。
- 対照としてそうリューション、ピペット2 2 mlチューブに37℃のHBSS mlのDMSOを7.96μlを添加します。
- イメージングの前に5分間ノコダゾールまたはDMSOをHBSSで細胞をインキュベートします。
- ステップ3.1のように、細胞を探します。
- 光活性化の前に、光活性化期間後のZスタックを取るために顕微鏡を準備します。
- 「Zスタック」ボタンをクリックしてください。高速XYを使用してスキャンを開始します。
- セルの上部に顕微鏡調整ノブで焦点面を調整します。プレス 'マークファースト」は、スタックの最初の位置を設定します。
- セルの下に顕微鏡調整ノブ（ガラスに最も近い）で焦点面を調整します。プレス 'マーク最終」は、スタック内の最後の位置を設定します。
- Zスタックパネルで、「Z切片」ボタンを押してください。 1μmの「間隔」を設定します。
より高い空間分解能が小さいスタック間隔を積み重ねるために、より多くの画像がする必要があります。注意してくださいスタック用の撮像期間を長くとること。
- ステップ3.7から3.8で説明したように、細胞をブリーチ。 0分〜15分（30フレーム）のフォト活性化し、画像。
- 30フレーム後に撮影を停止します。すぐにビデオの画像を保存します。
注意：これは第2の撮像シーケンスを開始する前に、保存されていない場合、一部の顕微鏡は、最初のビデオを上書きする可能性があります。 - ビデオを保存した後、すぐにステップ5.5からのパラメータを使用して、Zスタックを取得します。
- ステップ6で説明したように、GalTの-CFP（または他のゴルジマーカー）とβAPP-paGFPを共局在。
注意：CFPは急速に光退色し、撮像期間の終了までに表示されない場合があります。共局在は、GalTの-CFPとできない場合があります。共局在化が必要な場合は、GalTのにタグをMRFPを使用しています。
6.小胞と共局在フィルタリング
- コンパートメントの表面 （例えばLAMP1-MRFP）とタンパク質のOを行うために解析プログラム（例えばIMARIS）を使用しますF関心（ 例えば βAPP-paGFP）。
- 上部メニューバーの突破のボタンをクリックすることで、解析プログラムの「サーパス」のセクションを入力します。
- 一番左のパネル（左から5 番目のボタン ）の上部の表面ウィザード]ボタンを選択します。
- 小胞（ すなわち βAPP-paGFP蛍光、目的のタンパク質）をフィルタリングするチャンネルを選択します。
- 次のウィザードとプレスの分野で最大の小胞の直径を提出することによって、バックグラウンド減算を実行します。解析プログラムが自動的に選択 - 関心のあるチャネル内の領域 - フィールドで最大の小胞に由来した閾値に基づいて。
- 手動で必要に応じて選択項目を絞り込んで、しきい値の背景を調整します。
- しきい値の選択画面の下部には、組み合わせた表面を分離する「スプリット感動オブジェクトのオプションをチェックします。
注意：多くの小胞が密接にグループ化されている場合GETHER、一面の下でこれらのオブジェクト解析プログラム意志グループ。- 10-15代表小胞を選択し、平均ベシクル径を計算し、ウィザードに結果を入力してください。
- 「品質」（各スポットの途中でチャネルの強度）にしきい値を増加または減少させることによって選択されたシードポイントを絞り込み。
注意：関心のあるチャネルの表面が作成されます。選択された表面の更なる改良は、この時点で行うことができます。各小胞の画素数に基づいて、しきい値の小胞。 - この表面と元のチャネルをマスクします。マスクするには、表面の作成ウィザード（鉛筆）で、左から4番目のタブを選択します。
- 「すべてのマスク」を選択します。興味のある小胞との新しいチャネルが作成されます。
注意：マスク処理中に、元のチャンネルを複製するためのオプションが提供されます。元のデータを保存する必要がある場合は、このオプションを選択します。 - 繰り返しのフィルタリングされていないチャネル（ すなわち LAMP1 MRFP、コンパートメント）6.7を介して、TEPS 6.1。
- トップツールバーでは、共局在ツールを選択します。
- トップパネルには、共局在するチャネルのヒストグラムが表示されるように、最近作成したマスクされたチャンネルを選択します。
- 利用可能なデータをすべて選択します。分析後に時々存在する暗いピクセルがあります。ヒストグラムのこれらのピクセルを選択しないでください、彼らは結果を歪曲します。
- 右端のパネルで、「Colocチャンネルを構築」を選択します。これは、共局在のピクセルを含む新しいチャネルを作成します。データは、「チャンネル統計」ボタンの下の同じパネルになります。データは.CSVファイルとしてエクスポートすることができます。
- 「材料の割合は、共局在「統計を使用してください。このオプションは、アカウントにオブジェクトのピクセルと大きさの強度をとります。
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Representative Results
典型的な結果は、βAPPはTGNを残し、ランプ1（ 図1aおよび b）に急速にトラフィックに表示されます表示されます。光活性化期間の間、小胞は、リソソーム（ 図1b）宛ゴルジを逸脱分かります。 TGNで光活性化がある間阻害剤処理なしで、paGFP蛍光はリソソームに表示されます。光活性化を停止した後、βAPP-paGFPは急速に（1bに図1aを比較）リソソームからクリアされます。ノコダゾールでの処理は、コンパートメントのラベルのGalT-CFP内のAPPの蓄積につながり、リソソーム（ 図1c）に人身売買を防止します。
APPのスウェーデン変異（APPsw）は10倍の34で β開裂の速度を増加させます。 βAPPsw-paGFPの急速な切断により、paGFP蛍光はサイトゾル中に拡散蛍光シグナルとして表示されます。おそらく、このI細胞質にC末端paGFPを遊離γセクレターゼ（ 図2）による急速βAPPの切断の結果。 γセクレターゼ阻害剤の存在下では、βAPPは、リソソーム内に蓄積。
リソソームへのβAPPの配信後、paGFP蛍光が急速にクリアされます。短い滞留時間は、別の区画へのリソソームの人身売買の結果である可能性があります。逆に、γセクレターゼによるβAPPの開裂は、リソソーム膜（ 図3a）からpaGFP蛍光の拡散につながることが期待されます。拡散した蛍光は、共焦点顕微鏡により検出することがより困難です。 βAPPが別の区画に配信されるかクリアされているかどうかを判断するには、SN56細胞はγセクレターゼ（L685、458）、またはアルカリ化剤（クロロキン）に対する特異的阻害剤で処理しました。 L685のいずれかの添加は、458またはクロロキンは、（リソソーム内のAPPの蓄積をもたらし
これは、一般的に、APPは、エンドソームおよびリソソーム35にエンドサイトーシスされ、処理される前に、細胞表面に送達されることが認められています。しかし、我々の未処理の細胞において、細胞表面βAPPは、共焦点顕微鏡により検出することができませんでした。光活性化βAPPは、原形質膜の特定の領域に集中することはできません。代わりに、原形質膜の大きな表面積を横切って拡散し、蛍光が存在してもよいです。興味深いことに、γセクレターゼ阻害剤治療が、細胞表面でのβAPP-paGFPを検出可能につながる（ 図3b）。 γセクレターゼ阻害剤処理は、酵素機能を阻害することに加えて、細胞表面にβAPPの経路よりもよいです。したがって、原形質膜の大きな表面積は、より大きな面積にわたってpaGFPを拡散し、タンパク質が区画に輸送されるが、検出が困難になります。
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図1.イメージングリソソームへのAPPの人身売買。SN56細胞がLAMP1-MRFP、GalTの-CFP、およびβAPP-paGFPでトランスフェクションした。a）細胞を正確に白丸で示さゴルジ（ROIの上に配置されたROI内の光活性化されました）。細胞は、代わりにβAPP-paGFP輸送を決定するために15分間光活性化し、画像化しました。挿入図は、ゴルジからリソソームへ核周辺領域内の輸送を示しています。共局在ピクセルは黄色。b）はリソソームにβAPP-paGFPを含む小胞の輸送に表示されます。黄色のピクセルがLAMP1とβAPP-paGFPの共局在を示す。c）の SN56細胞はTGNからβAPP-paGFPの流出を防止するために、イメージング前にノコダゾールで処理しました。代表画像は、光活性化期間の終わりから取られました。右側のパネルで、同じセルのZスタックは、光活性化の直後に撮影しました。目電子のGalT-CFPは、共局在のGalT-CFPとβAPP-paGFPの可視化を改善するために、偽色の赤をしています。黄色のピクセルはGalTの-CFPとβAPP-paGFP間の共局在を示します。スケールバーは5μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
βAPPsw-paGFP。SN56細胞の図2.人身売買は LAMP1-MRFP、GalTの-CFPとβAPPsw-paGFP（家族スウェーデン変異を持つβAPP）をトランスフェクトしました。 Swedish変異は、APPが切断される速度を増加させます。ゴルジ光活性化し、画像化内の細胞は、代替的でした。 paGFPが細胞質に拡散するリソソーム膜から取り外された後に拡散した蛍光を見ることができます。スケールバーは5μmで表します。53 / 53153fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.ターミナルオルガネラの決定。SN56細胞がLAMP1-MRFP、GalTの-CFPとβAPP-paGFPでトランスフェクションしました。光活性化した後、細胞をさらに45分間行いました。左端の2パネルは、光活性化（中央）の後に光活性化（一番左）前の細胞と15分を示しています。上のパネルは右端）未処理、b）の γセクレターゼ阻害剤の総イメージングの45分は、治療、 または c）クロロキン処理した後のAPP蛍光を示します。矢印は画像の45分後LAMP1と共局在APPを指します。スケールバーは5μmで表しています。 目の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図です。
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Discussion
この技術は、その後の人身売買と切断を可視化するために、TGNにpaGFPでタグ付けされた膜タンパク質の正確な光活性化について説明します。 paGFPは25十年以上前に作成されたが、これは下流のコンパートメントに新生タンパク質の輸送を追跡する正確な光活性化の最初の例です。 APP-paGFPを使用した以前の研究では、光活性化ゴルジ体11であると考えられた細胞の核周囲の領域を構築します。しかし、私たちの顕微鏡写真、リソソーム、初期エンドソームおよび後期エンドソームで明らかとしても（ 図1および30を参照）、この領域で見つけることができます。マウスの神経細胞のトランスフェクション効率は低いが、これらの実験では、HEK293細胞、COS7細胞、神経SN56細胞、SH-SY5Y細胞、マウス神経細胞で正常に実行されています。同様の実験は、最後の112アミノ酸を含む完全長のAPP構築物および短縮構文を使用して行われてきましたAPPの酸は、β-およびγ-切断部位を有する、paGFPに融合。短縮構築物は、トランスフェクトし、より高い蛍光シグナルを提供することが容易であり、これらは添付の図面に示されています。私たちの短縮構築物はまた、未定義の切断やソート信号38を有する N末端 細胞外ドメインを欠きます。これらのN末端 シグナルおよび切断にもかかわらず、私たちは私たちの短縮構築物は、全長APP-paGFP 30、33と同様の局在と人身売買を持っていることがわかります。
そのため、細胞の核周囲領域で多くの細胞小器官の、あらゆる努力は、光活性化の精度を確保しました。撮像期間中は、細胞およびゴルジが移動します。従って、光活性化のROIを慎重に光活性化期間中に監視され、ゴルジ体の上に残るように調整されなければなりません。共焦点顕微鏡は、温度の小さな変化に敏感です。 microscoオーバー例えば、ACまたは加熱通気孔PEは、撮像面の変化をもたらす可能性があります。
実験の間の一貫性を維持するために、我々は、それぞれの光活性化/画像化サイクルの間の時間遅延を設定します。時間は、関心領域と画像セルを漂白するために必要です。 ROIのセルと数の大きさに応じて、1つの画像を漂白し、取る時間が異なります。漂白を含む各画像は、約30秒を必要とするので、画像に画像からの一貫性を維持するために、画像間の時間遅延を設定します。増加した時間分解能は、ビーム整形器（例えばLSM5ライブ検出器）を使用する検出システムを使用することによって達成することができます。第2の解像度を落とさずに、120フレーム/でこれらの顕微鏡は、画像化できます。
光活性化の精度を確認するために、ノコダゾール制御を行うことが不可欠です。光活性化の際にゴルジのうち輸送をブロックすることで、これはpaGFPが大幅に他の区画で活性化されていないことを保証します。CFPフォト漂白剤は急速でイメージングおよび漂白を繰り返し、難しいのGalT-CFPと共局在することができます。 paGFP蛍光の大部分は、ゴルジ領域にとどまるような場合は、これも正確な光活性化を示すことができます。また、GalTのは、以上の光安定CFPよりもこれらの実験であるMRFP、でタグ付けすることができます。
ゴルジ内の改善された活性化はまた、多光子顕微鏡を用いて達成することができます。これらの実験における共焦点撮像面は、典型的には1μm切片であるが、イメージングおよび光活性化のためのレーザは、全セルを通過します。多光子レーザーは、これらの実験のために使用することができ、すべての立体35の精度を向上させることができます。ここに示されているようしかし、従来の405nmのレーザダイオードを正確TGN内βAPP-paGFPを光活性化するのに十分です。
対照として、我々は、VSVG-paGFP蛍光について同様の実験を行いました。あるVSVG-paGFP、構成的細胞表面27,37に送ら、原形質膜30の特定のサブ領域に送達されて可視化しました。これは、細胞内区画への輸送が過剰発現またはpaGFPタグの存在によってトリガされていないことを保証します。
拡散paGFP蛍光は共焦点顕微鏡により局在化することが困難であり得ます。我々の経験では、APPは急速に切断され、リソソーム膜で完全長タンパク質として短い寿命を持つように表示されます。この問題は、APP切断34の速度を加速スウェーデンFAD変異によって悪化します。急速に切断されたタンパク質のための技術を使用するには、阻害剤は、最終的な下流の区画を決定することが重要です。 L685、458またはリソソームにおけるAPPの有意な蓄積にクロロキンリード、γセクレターゼの阻害;でも、スウェーデン変異を有します。
あまりにも多くの阻害剤が使用される場合、これは、細胞内の交流につながる可能性βAPP-paGFPの累積、およびタンパク質含有物につながる可能性があります。実験開始前に、細胞内の蛍光paGFP介在物中の介在結果にpaGFP累計（未発表の観察は、40μMのクロロキンで一晩処理IE）。関心対象のタンパク質の切断を防止するが、封入体形成をもたらさない阻害剤濃度を使用すべきです。 paGFPによる細胞の過剰トランスフェクションはまた、光活性化することなく、蛍光を発するpaGFPの明らかな介在物が発生する可能性があります。新たに光活性化paGFPは、優先的にこれらの介在物へのトラフィックおよび結果の解釈が妨害されます。画像への細胞を探しているときには、明らかなpaGFP介在物で細胞を避けます。 βAPP-paGFPの経験では、適切なレベルでβAPP-paGFPを発現する細胞中で非常にかすかな緑色の蛍光があります。このかすかな蛍光は、一般的に画像化することができず、唯一の接眼レンズを通して見ることができます。
すなわち、細胞膜）に輸送タンパク質を検出することが困難であり得ることです。これは、蛍光信号から、大面積にわたって拡散され、希釈されてもよいし、断面における膜特性は、共焦点顕微鏡の分解能以下であるからです。これは、落射蛍光顕微鏡を用いて撮像することにより、この問題を回避することが可能です。しかし、これはかなりの技術の空間分解能を低下させます。
この手法の利点は、他の膜タンパク質への適用です。この技術はいくつかのタンパク質の過剰発現に依存するが、それはVSVG-paGFPとβAPP-paGFP 30で実証されたように、タンパク質輸送があからさまに、中断されないことが表示されます。リソソームに加えて、エンドソーム/リソソーム系の他のマーカーもまた、首尾よく使用されています。これらは、早期終了のためのRab5-MRFPを含みます後期エンドソームのためosomeとrab9-mchFP（チェリー蛍光タンパク質）。この強力な顕微鏡検査技術は、TGNから他のタンパク質の輸送を追跡するために拡張することができます。それは同様に利用可能である明確に定義された区画のマーカーを提供した個別のコンパートメント間の売買を追跡するために適用することができます。
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Disclosures
著者は全く競合する金融利害や利害の衝突を持っていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
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