Summary
Mentre il trasporto delle proteine di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell'amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco.
Abstract
Beta-amiloide (A?) È il principale costituente delle placche senili presenti nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer. Ap deriva dalla scissione sequenziale di proteina precursore dell'amiloide (APP) di β-secretasi e γ. Nonostante l'importanza di Ap AD patologia, la localizzazione subcellulare di queste fratture non è ben stabilita. Lavorare nel nostro laboratorio e altri implicano il sistema endosomal / lisosomiale in processamento di APP dopo internalizzazione dalla superficie cellulare. Tuttavia, il traffico intracellulare di APP è relativamente poco studiato.
Mentre le proteine della superficie cellulare sono modificabili a molte tecniche di etichettatura, non ci sono metodi semplici per seguire il traffico di proteine di membrana del Golgi. A tal fine, abbiamo creato costrutti APP che sono stati codificati con foto-attivabile GFP (paGFP) al C-terminale. Dopo la sintesi, paGFP ha bassa fluorescenza basale, ma può essere stimolato con 413 nm luce to produrre un forte, stabile fluorescenza verde. Usando il Golgi marcatore galactosyl transferasi accoppiato ad Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) come un bersaglio, siamo in grado di precisione photoactivate APP nella rete trans-Golgi. Foto-activated APP-paGFP può quindi essere seguita come traffici di scomparti a valle identificati con fluorescente tagged proteine marker vano per la precoce endosoma (Rab5), il compianto endosome (Rab9) e la lisosomi (LAMP1). Inoltre, utilizzando inibitori di processamento di APP tra cui la clorochina o γ-secretasi inibitore L685, 458, siamo in grado di effettuare esperimenti pulse-chase di esaminare il trattamento di APP in singole cellule.
Troviamo che una grande frazione di APP si sposta rapidamente alla lisosomi senza apparire sulla superficie cellulare, e viene quindi eliminato dalla lisosomi da fratture secretasi-like. Questa tecnica dimostra l'utilità della paGFP per seguire il traffico e la trasformazione delle proteine intracellulari from il Golgi compartimenti a valle.
Introduction
Il segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) è la presenza di placche senili e grovigli neurofibrillari (NFTS) nel cervello. Il principale costituente delle placche senili è β-amiloide (A?). Ap è derivato dal suo precursore; proteina precursore dell'amiloide (APP) 1. Il clivaggio amiloidogenica di APP inizia con la rimozione del ectodomain da APP da β-secretasi 2. Il frammento terminale carbossilico 99-residuo che rimane (CTF) può essere scisso da γ-secretasi per produrre Ap 3-7. Mentre molti esperimenti hanno documentato il clivaggio di superficie cellulare APP dopo interiorizzazione dalla superficie cellulare nel sistema endosomal / lisosomiale, numerosi studi recenti hanno suggerito che il traffico intracellulare di APP è anche importante nel regolare la sua lavorazione 8-11.
Ci sono stati un certo numero di tentativi di modulare i livelli di Ap con inibitori gamma-secretasi e A? Immunotherapies. Tuttavia, recenti studi clinici con queste terapie hanno mostrato alcun beneficio, e, in alcuni casi, ha causato danni 12. Una strategia inutilizzato ai modulare la produzione Ap è di alterare la localizzazione sub-cellulare di APP e interazione γ-secretasi. Golgi, membrana plasmatica, e endosomi / lisosomi sono stati suggeriti come possibili locali per γ-taglio di APP. Una ricerca dal nostro laboratorio suggeriscono che APP e la γ-secretasi sono proteine residenti della membrana lisosomiale 13. Inoltre, abbiamo trovato che la lisosomiali γ-secretasi ha un pH ottimale acido 13. Inoltre, alcalinizzazione del sistema endosomal / lisosomiale con clorochina o NH 4 Cl, ha dimostrato di diminuire la produzione di Ap 14. gamma-secretasi inibizione o knockout o Presenilina porta all'accumulo APP-CTFs nei lisosomi 15-17. Inoltre, interrompendo APP endocitosi abbassa produzione Ap 18-20.
Nonostante l'importanza del Golgi come stazione di smistamento per le proteine nascenti e le proteine riciclati dal sistema endosomal / lisosomiale, il traffico intracellulare di APP non è stato studiato in dettaglio 21. Studi recenti hanno dimostrato che l'APP può essere riciclato alla rete trans-Golgi (TGN) attraverso l'interazione con il complesso retromer. Regolazione Giù del complesso retromer diminuisce la produzione Ap 8,22-24. Tuttavia, l'uscita di APP dal Golgi non è stato ben studiato.
Pur seguendo l'endocitosi delle proteine di superficie cellulare, quali il recettore della transferrina, sono facilmente etichettato e seguita, dopo il traffico di proteine intracellulari è più impegnativo. In realtà, poche proteine hanno avuto il loro traffico intracellulare ripreso. L'avvento di tag proteina fluorescente, come foto-attivabili-GFP (paGFP), ha fornito nuovi strumenti per esaminare il traffico intracellulare. Foto-attivabili-GFP è una forma di GFP che è quasi invisibile dopo la sintesi, ma sviluppa forte verde (GFP) fluorescenza dopo l'attivazione da 413 nm di luce laser e questo segnale è stabile per giorni 25,26. I costrutti che utilizzano paGFP sono stati utilizzati per dimostrare il traffico intralysosomal della proteina Lysosomal proteine di membrana 1 (LAMP1) 25, la consegna superficie cellulare della stomatite virus vescicolare glicoproteina (VSVG, un marker di via secretoria) 27, e il fatturato dei perossisomi 28 e 29 autofagosomi.
Per visualizzare lo smistamento di APP dal TGN in cellule vive, abbiamo progettato plasmide esprimente ultimi 112 amminoacidi di APP accoppiati a foto-attivabile (paGFP) sul terminale C (denominato βAPP-paGFP) 30. Abbiamo anche eseguito questi esperimenti con lunghezza APP e ha raggiunto risultati simili; il costrutto ΒAPP è usata qui perché fornisce immagini più luminose. Abbiamo poi photo disattivare &# 946; APP-paGFP solo nel TGN, come delimitate dalla TGN marcatore galattosiltransferasi (GalT). Nonostante APP è stato taggato con paGFP di visualizzare un rapido trasporto assonale di APP e la clearance della regione perinucleare, questa è la prima dimostrazione di traffico di APP da un compartimento accuratamente definito ad un altro 11,31,32. Qui, dimostriamo accurata foto-attivazione entro il TGN e la fuoriuscita di APP in compartimenti a valle e la successiva scissione e liquidazione di lisosomi 30. L'accurata fotoattivazione all'interno del Golgi è ampiamente applicabile ad altri sistemi proteici.
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Protocol
1. cella di placcatura e trasfezione
- In una cappa di coltura cellulare, piatto ~ 300.000 ~ 500.000 SN56 cellule (un gentile dono del Dr. Jane Rylett) su un piatto di confocale fondo di vetro a 35 mm e coprire con i media pre-trasfezione (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM, integrato con 10% FBS).
- Incubare le cellule notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% a proliferare.
Nota: Le cellule devono essere circa il 50% -70% confluenti prima trasfezione. - In una cappa di coltura cellulare, le cellule trasfezione con plasmidi che esprimono una proteina fluorescente taggati TGN marcatore (galactosyl transferasi accoppiato ad Cyan Fluorescent Protein, GalT-PCP), una proteina fluorescente tag marcatore vano (qui, lisosomi associato membrana proteina 1, LAMP1, con etichetta MRFP), e la proteina di interesse taggati con paGFP (βAPP-paGFP). (Questi costrutti sono stati precedentemente descritti 30)
- Incubare le cellule con il reagente di trasfezione e plasmide DNA fo 24 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Utilizzare un rapporto di ~ 2 mg di DNA a 5 ml di agente trasfezione (ad es Lipofectamine 2000) al meglio citotossicità equilibrio ed efficienza di trasfezione. Le concentrazioni reali possono avere bisogno di essere ottimizzato per diverse plasmidi. Negli esperimenti qui descritti, utilizzare 1 mg / piatto confocale di βAPP-paGFP, 0.3 mg / piatto confocale di LAMPADA1-MRFP, e 0,2 mg / piatto confocale di Galt-PCP.
Nota: La quantità di plasmide usato dipenderà l'efficienza di trasfezione. - Per le linee di cellule neuronali: Dopo il punto 1.4, in una cappa di coltura cellulare, rimuovere i supporti pre-trasfezione e differenziare le cellule SN56 a 2 ml di DMEM integrato con 0,1% di penicillina / streptomicina con 1 mM dibutirril AMP ciclico (dbcAMP) per 24 ore.
2. Microscopio fase di preparazione
- Preriscaldare PBS (PBS) e soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 ° C. Warm-up palco microscopio prima imaging a 37 ° C.
- Lavare le cellule due volte con PBS, per rimuovere i media differenziazione e sostituirli con 2 ml di HBSS a 37 ° C. Cellule posto sul palco microscopio riscaldato a 37 ° C.
Nota: Le cellule sono vitali per circa 1,5-2 ore in HBSS. - Lasciare 5-10 min per la temperatura della piastra confocale per equilibrare con palco microscopio.
3. fotoattivazione di ROI sulla Golgi
- Con l'oculare del microscopio, trovare cellule trasfettate con GalT-CFP, LAMP1-MRFP, e βAPP-paGFP.
- Utilizzare un obiettivo ad immersione in olio con alto ingrandimento (es 63X o 100X). Per la conformazione visiva della fluorescenza, utilizzare un filtro impostato in grado di visualizzare FITC (per PCP e fluorescenza GFP) e rodamina (per MRFP fluorescenza).
- Impostare la fetta confocale per ogni canale a 1 micron. Prendete una immagine a bassa risoluzione.
- Ritaglia immagine solo la cella di interesse.
- Usando la manopola di regolazione, impostare manualmenteil piano focale al centro della cella. Questo è tipicamente la parte della cellula dove il nucleo è il più grande.
- Pareggio 3-5 Regioni circolari di Interesse (ROI) all'interno del TGN (GalT-PCP fluorescenza).
- Per disegnare ROI (cioè nel programma Zeiss LSM), selezionare il pulsante 'Modifica ROI' nella console di comando.
- Selezionare il pulsante ROI circolare.
- Fare clic e trascinare su GalT-CFP regioni positivi della cellula.
Nota: I pacchetti foto-sbiancanti per molti microscopi hanno questa capacità.
- Prendete l'immagine della cella con sovrapposto ROI. Salvare una copia del ROI per riferimento futuro.
- Per salvare il ROI per l'immagine, selezionare il pulsante 'Macro'.
- Premere il pulsante 'Carica' per avviare il 'CopyRoisToOverlay' (percorso del file: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
Nota: Un microscopio confocale dotato di 475-525 nm (PCP) banda passante (BP), un 500-530 nm BP (GFP),e sono tenuti a 560 nm passaggio lungo (LP) set di filtri. È inoltre necessario un laser argon 458 nm e 488 nm di emissione e un laser HeNe per l'emissione a 540 nm.
- Set-up il microscopio per un corso a tempo candeggina.
- Impostare il diodo laser (25 mW 405 nm laser) alla massima potenza.
Attenzione: Eccessiva foto-attivazione potrebbe portare a foto-tossicità o danni alle membrane cellulari. Usare occhiali di protezione per evitare danni alla retina. - Set-up del microscopio per 120 cicli di imaging.
Nota: Un ciclo di imaging consiste di sbiancamento all'interno del ROI e l'imaging di tutta la cellula. Si tratta di un corso a tempo candeggina. - Impostare il microscopio per candeggina (foto disattivare) solo il ROI per 20-30 iterazioni dopo ogni immagine. Il tempo di immagine e candeggina un'immagine varierà. Impostare un tempo di ritardo tra le immagini in modo che ogni ciclo è di circa 30 secondi.
Nota: La parte di imaging di ogni ciclo dura circa 15-30 secondi a seconda della dimensione dell'immagine. Lo sbiancamento per ogni ROI è circa 50 msec. Bleaching dei 4 ROI per 20 iterazioni avrà 4 secondi alla fine di ogni ciclo di candeggiante / immagine.
- Impostare il diodo laser (25 mW 405 nm laser) alla massima potenza.
- Inizia il periodo di tempo di candeggina.
- Spegnere il candeggio dopo 15 min (30 cicli di imaging e sbiancamento), ma continuare ad acquisire foto della cellula.
Nota: Il tempo da 0 a 15 min è il periodo di 'impulso'. - Continuare ad acquisire foto per 45 min (senza sbiancamento), a seguire la clearance di βAPP-paGFP.
Nota: Il tempo 15 a 45 minuti è il periodo di 'caccia'. - Utilizzando il metodo di analisi descritto al punto 6, co-localizzare la proteina di interesse (qui, βAPP-paGFP) con il vano di interesse (qui, LAMP1-MRFP) facendo superfici a ciascun canale.
4. Determinare il Comparto Downstream
- Per determinare se lisosomi (in questi esperimenti) sono compartimento finale, aggiungere inibitori della proteasi di membrana permeabile a causare proteine si accumulano nei lisosomi.
- Per βAPP, utilizzare 0,5 micron L685, 458 (inibitore specifico γ-secretasi) durante la notte o 100 micron clorochina (deacidifies lisosomi) per 30 minuti prima di imaging.
- Trova cellule e photoactivate come nel passaggio 3,1-3,8.
- Immagine della cella per un ulteriore 45 min (senza foto-attivazione) per determinare dove βAPP-paGFP accumula in assenza di scissione.
- Analizzare la consegna di proteine per lisosomi (o altro vano a valle) e successiva liquidazione secondo il metodo descritto al punto 6.
5. assicurare l'accuratezza della foto-attivazione entro il Golgi
- Warm-up HBSS a 37 ° C.
- Preparare una soluzione al 2 ml, per ogni piatto confocale a essere ripreso, di 66 micron nocodazole (trattamento) o DMSO (controllo) in HBSS.
- Per un piatto confocale, pipetta 2 ml di 37 ° C HBSS e aggiungere 7,96 ml di nocodazole da un nocodazole magazzino 16.60 mm.
- Come controllo cosìluzione, pipetta 2 ml di 37 ° C in una provetta HBSS 2 ml e aggiungere 7,96 ml di DMSO.
- Incubare cellule in HBSS con nocodazole o DMSO per 5 minuti prima di imaging.
- Trova le cellule come al punto 3.1.
- Prima fotoattivazione, preparare il microscopio per prendere un Z-stack dopo il periodo di fotoattivazione.
- Fare clic sul pulsante 'Z Stack'. Avviare la scansione utilizzando XY veloce.
- Regolare il piano focale con la manopola di regolazione microscopio per la parte superiore della cella. Premere 'Mark First' per impostare la prima posizione nella pila.
- Regolare il piano focale con la manopola di regolazione del microscopio al fondo (più vicino al vetro) della cella. Premere 'Mark Ultimo' per impostare l'ultima posizione nella pila.
- Nel pannello pila Z, premere il tasto 'Z sezionamento'. Impostare l''intervallo' a 1 micron.
Nota: per una risoluzione spaziale più alta pila un intervallo più piccola pila, ma altre immagini dovrannoadottare allungando il periodo di imaging per lo stack.
- Bleach le cellule, come descritto al punto 3.7-3.8. Foto-activate e immagini da 0 min a 15 min (30 fotogrammi).
- Smettere di imaging dopo 30 fotogrammi. Immediatamente salvare un'immagine del video.
Attenzione: alcuni microscopi possono sovrascrivere primo video se non viene salvato prima di iniziare una seconda sequenza di imaging. - Dopo aver salvato il video, acquisire immediatamente un Z-stack, utilizzando i parametri dal punto 5.5.
- Co-localizzare βAPP-paGFP con GalT-CFP (o altro marcatore Golgi), come descritto al punto 6.
Nota: CFP photobleaches rapidamente e possono non essere visibili dalla fine del periodo di imaging. Colocalization potrebbe non essere possibile con GalT-PCP. Se è necessaria una co-localizzazione, utilizzare MRFP di tag GalT.
6. Filtraggio vescicole e Colocalizzazione
- Utilizzare un programma di analisi (es Imaris) per rendere le superfici del vano (ad esempio LAMP1-MRFP) e una proteina ointeresse f (ad es βAPP-paGFP).
- Entra nella sezione 'Surpass' del programma di analisi facendo clic sul pulsante Surpass sulla barra dei menu in alto.
- Selezionare il pulsante wizard di superficie nella parte superiore del pannello di sinistra più (5 ° pulsante da sinistra).
- Selezionare il canale da filtrare vescicole (cioè βAPP-paGFP fluorescenza, proteina di interesse).
- Eseguire sfondo sottrazione presentando il diametro del più grande vescicole in campo per la procedura guidata e premere avanti. Il programma di analisi seleziona automaticamente - sulla base di una soglia derivato dal grande vescicole nel campo - un'area nel canale di interesse.
- Regolare manualmente lo sfondo di soglia per rifinire la selezione, se necessario.
- Nella parte inferiore della schermata di selezione della soglia, selezionare l'opzione 'toccare oggetti Split "per separare il combinato superfici.
Nota: Se molti vescicole sono strettamente raggruppati persieme, il programma di analisi volontà gruppo questi oggetti in una superficie.- Scegli 10-15 vescicole rappresentativi e calcolare il diametro medio delle vescicole e inserire il risultato nella procedura guidata.
- Perfezionare i punti seme selezionati aumentando o diminuendo la soglia su 'Quality' (intensità del canale al centro di ogni spot).
Verrà creato superfici del canale di interesse: Nota. Ulteriore affinamento delle superfici selezionate può essere eseguita in questo punto. Vescicole soglia in base al numero di pixel in ciascun vescicole. - Mascherare il canale originale con questa superficie. Per mascherare, selezionare la scheda 4 ° da sinistra nella procedura guidata di creazione di superfici (matita).
- Seleziona 'mascherare tutti'. Verrà creato un nuovo canale con le vescicole di interesse.
Nota: Durante il processo di maschera, la possibilità di duplicare il canale originale viene offerto. Selezionare questa opzione se i dati originali deve essere salvato. - Ripetere steps 6.1 tramite 6.7 per il canale non filtrato (cioè LAMP1 MRFP, vano).
- Alla barra degli strumenti in alto, selezionare lo strumento colocalizzazione.
- Nel pannello superiore, come appaiono gli istogrammi dei canali da colocalized, selezionare i canali mascherati recente creazione.
- Selezionare tutti i dati disponibili. Ci sono pixel scuri che a volte sono presenti dopo l'analisi. Non selezionare questi pixel nell'istogramma, saranno falsare i risultati.
- Nel pannello a destra, selezionare 'Crea Coloc Channel'. Questo crea un nuovo canale che contiene solo i pixel colocalized. I dati saranno nello stesso pannello sotto il pulsante 'Statistiche Channel'. I dati possono essere esportati come file CSV.
- Utilizzare la statistica 'Percentuale di materiale colocalizzava'. Questa opzione tiene conto dell'intensità dei pixel e le dimensioni dell'oggetto.
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Representative Results
I risultati tipici mostrano βAPP lasciando TGN e sembra traffico rapidamente LAMP1 (Figura 1a e b). Durante il periodo di fotoattivazione, vescicole possono essere visti in partenza Golgi destinato lisosomi (Figura 1b). Senza trattamento inibitore, paGFP fluorescenza sarà visibile nei lisosomi, mentre vi è foto-attivazione nella TGN. Dopo l'arresto fotoattivazione, il βAPP-paGFP viene rapidamente eliminato dal lisosomi (confrontare Figura 1a a 1b). Il trattamento con nocodazole porta all'accumulo di APP nel GalT-PCP etichettato scomparti e impedisce al traffico lisosomi (Figura 1C).
La mutazione svedese APP (APPsw) aumenta il tasso di β-scissione da 10 volte 34. Con la rapida scissione di βAPPsw-paGFP, la fluorescenza paGFP appare come un segnale di fluorescenza diffusa nel citoplasma. Presumibilmente questo hos il risultato di un rapido βAPP scissione da γ-secretasi liberare la paGFP C-terminale al citoplasma (Figura 2). In presenza di inibitori γ-secretasi, βAPP si accumula all'interno dei lisosomi.
Dopo la consegna di βAPP al lisosoma, la fluorescenza paGFP è rapidamente eliminato. Il tempo di permanenza breve potrebbe essere il risultato del traffico dal lisosomi ad un altro comparto. Al contrario, scissione di βAPP da γ-secretasi sarebbe dovrebbe portare alla diffusione di paGFP fluorescenza dalla membrana lisosomiale (Figura 3a). La fluorescenza diffusa è più difficile da rilevare mediante microscopia confocale. Per determinare se βAPP è consegnato a un altro comparto o eliminato, le cellule sono state trattate SN56 con un inibitore della specifica contro γ-secretasi (L685, 458) o di un agente alcalinizzante (clorochina). L'aggiunta di uno L685, 458 o clorochina ha provocato l'accumulo di APP in lisosomi (
E 'comunemente accettato che APP è consegnato alla superficie cellulare, prima di essere endocitosi ed elaborate negli endosomi e lisosomi 35. Tuttavia, nelle nostre cellule non trattate, superficie cellulare βAPP potrebbe non essere rilevato mediante microscopia confocale. Foto attivato βAPP non può essere concentrato in una regione specifica della membrana plasmatica. Invece, ci può essere una fluorescenza diffusa attraverso l'ampia superficie della membrana plasmatica. È interessante notare che, γ-secretasi inibitore trattamento porta a rilevabili βAPP-paGFP sulla superficie cellulare (Figura 3b). γ-secretasi trattamento inibitore può instradare più βAPP alla superficie cellulare, oltre alla funzione inibizione enzimatica. Pertanto, l'ampia superficie della membrana plasmatica diffonde paGFP su una superficie maggiore e rende difficile il rilevamento, anche se la proteina è trafficata al vano.
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Figura 1. Imaging il traffico di APP per lisosomi. SN56 cellule sono state trasfettate con LAMP1-MRFP, GalT-CFP, e βAPP-paGFP. A) La cella è stata accuratamente foto-attivati entro ROI posta sopra l'Golgi (ROI indicato con cerchi bianchi ). La cella era alternativamente foto-attivati e ripreso per 15 minuti per determinare il traffico βAPP-paGFP. Inserto mostra il traffico all'interno della zona perinucleare da Golgi a lisosomi. Co-localizzato pixel appaiono giallo. B) La tratta di una vescicola contenente βAPP-paGFP al lisosoma. Giallo pixel denotano LAMP1 e c βAPP-paGFP colocalizzazione.) SN56 cellule sono state trattate con nocodazole prima di imaging per prevenire βAPP-paGFP uscita dal TGN. Una immagine rappresentativa parte dalla fine del periodo di fotoattivazione. Nel pannello di destra, un Z-stack della stessa cella presa immediatamente dopo fotoattivazione. Th e GalT-PCP è stata falso colore rosso per migliorare la visualizzazione di colocalized GalT-CFP e βAPP-paGFP. Giallo pixel denotano colocalizzazione tra GalT-PCP e βAPP-paGFP. Barre di scala rappresentano 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Traffico di cellule βAPPsw-paGFP. SN56 sono state trasfettate con LAMP1-MRFP, GalT-CFP e βAPPsw-paGFP (βAPP con la mutazione Svedese familiare). La mutazione svedese aumenta il tasso che APP viene aperto. Le cellule sono state in alternativa all'interno del Golgi foto-attivo e ripreso. Una fluorescenza diffusa può essere visto dopo paGFP è staccata dalla membrana lisosomiale a diffondere nel citoplasma. Barra della scala rappresenta il 5 micron.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Determinazione del organello terminale. SN56 cellule sono state trasfettate con LAMP1-MRFP, GalT-CFP e βAPP-paGFP. Dopo fotoattivazione, le cellule sono stati seguiti per ulteriori 45 min. I due più a sinistra i pannelli mostrano le celle prima fotoattivazione (più a sinistra) e 15 minuti dopo fotoattivazione (al centro). Il pannello all'estrema destra mostra APP fluorescenza dopo 45 minuti di immagini in totale a) non trattato, b), un inibitore γ-secretasi trattati, oppure c) clorochina trattata. Punte di freccia indicano APP co-localizzato con LAMP1 dopo 45 minuti di imaging. Barre di scala rappresentano 5 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di thè figura.
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Discussion
Questa tecnica descrive l'esatto foto-attivazione delle proteine di membrana taggati con paGFP nel TGN di visualizzare la successiva tratta e scissione. Mentre paGFP è stato creato oltre dieci anni fa 25, questo è il primo esempio di accurata foto-attivazione per seguire il traffico di proteine nascenti ai compartimenti a valle. Studi precedenti utilizzando APP-paGFP costruisce foto-attivata una regione peri-nucleare della cellula, che è stato considerato il Golgi 11. Tuttavia, come evidente nelle nostre micrografie, lisosomi, endosomi precoci e endosomi tardivi si possono trovare anche in questa regione (Figura 1 e riferimento 30). Questi esperimenti sono stati eseguiti con successo in cellule HEK293, cellule, cellule COS7 SN56 neuronali, cellule SH-SY5Y, e neuroni di topo, anche se l'efficienza di trasfezione di neuroni di topo è basso. Esperimenti simili sono stati condotti utilizzando pieni costrutti lunghezza APP e costrutti abbreviati, tra cui l'ultimo 112 aminoacidi di APP, con i siti P- e γ-scissione, fusa a paGFP. I costrutti abbreviati sono più facili da trasfettare e fornire un segnale fluorescente alto, e questi sono mostrati nelle figure allegate. I nostri costrutti abbreviati mancano anche il ectodomain N-terminale, che ha spaccature indefiniti e segnali di smistamento 38. Nonostante questi segnali N-terminale e spaccature, troviamo che il nostro costrutto accorciato ha localizzazione simile e la tratta come un full-length APP-paGFP 30, 33.
A causa dei numerosi organelli nella zona peri-nucleare della cellula, è stato fatto ogni sforzo per garantire la precisione di fotoattivazione. Durante il periodo di imaging, la cella e il Golgi si muoverà. Pertanto, le ROI foto-attivazione devono essere attentamente monitorati durante il periodo di attivazione foto e regolati a rimanere in cima alle Golgi. Microscopi confocali sono sensibili alle piccole variazioni di temperatura. Ad esempio, AC o riscaldamento aperture sulla microscope potrebbe risultare in un cambiamento del piano di imaging.
Al fine di mantenere la coerenza tra esperimenti, abbiamo impostato un ritardo tra ogni ciclo / immagini foto-attivazione. Il tempo è necessario per sbiancare i ROI e l'immagine della cellula. A seconda delle dimensioni della cella e il numero di ROI, il tempo per candeggiare e prendere una immagine varierà. Al fine di mantenere la coerenza da un'immagine all'altra, impostare un intervallo di tempo tra le immagini in modo che ogni immagine, compreso lo sbiancamento, richiede circa 30 secondi. Maggiore risoluzione temporale può essere ottenuto utilizzando sistemi di rilevamento che impiegano un sagomatore (es LSM5 rilevatore Live). Questi microscopi possono immagine a 120 fotogrammi / secondo con senza perdita di risoluzione.
Per confermare l'esattezza di foto-attivazione, è indispensabile eseguire un controllo nocodazole. Bloccando il trasporto fuori dal Golgi durante fotoattivazione, questo assicura che paGFP non viene significativamente attivata in altri compartimenti.CFP foto-sbiancanti rapidamente con ripetuti imaging e sbiancamento e può fare colocalizzazione con GalT-CFP difficile. Se il grosso paGFP fluorescenza rimane nell'area Golgi, anche questo può indicare accurate fotoattivazione. In alternativa, può essere GalT etichettato con MRFP, che è più stabile di quella foto PCP in questi esperimenti.
Migliorata attivazione entro il Golgi può essere ottenuto anche con un microscopio multi-fotone. Mentre il piano di imaging confocale in questi esperimenti è tipicamente un 1 micron fetta, il laser per l'imaging e fotoattivazione passerà attraverso l'intera cella. Un laser multi-photon potrebbe essere utilizzato per questi esperimenti, e può migliorare la precisione nelle tre dimensioni 35. Tuttavia, come dimostrato qui, un tradizionale laser a diodo 405 nm è sufficiente precisione foto disattivare βAPP-paGFP all'interno del TGN.
Come controllo, abbiamo eseguito esperimenti simili per VSVG-paGFP fluorescenza. VSVG-paGFP, che ècostitutivamente espresso sulla superficie cellulare 27,37, è stata visualizzata essere consegnato al subregioni specifici della membrana plasmatica 30. Questo assicura che il trasporto di compartimenti intracellulari non è attivato da sovra-espressione o la presenza del tag paGFP.
Diffuse paGFP fluorescenza può essere difficile da localizzare mediante microscopia confocale. Nella nostra esperienza, APP è rapidamente scissa e sembra avere una vita breve come proteina intera lunghezza nella membrana lisosomiale. Questo problema è aggravato dalla mutazione FAD svedese che accelera il tasso di APP scissione 34. Per impiegare la tecnica per proteine rapidamente spaccati, un inibitore è cruciale per determinare il vano valle finale. L'inibizione della γ-secretasi da L685, 458 o clorochina portare a un significativo accumulo di APP nei lisosomi; anche con la mutazione Swedish.
Se si usa troppo inibitore, questo potrebbe portare a ac intracellularecumulo di βAPP-paGFP, e può portare a inclusioni proteiche. Accumulato paGFP in inclusioni risultati in inclusioni paGFP fluorescenti nella cella prima che l'esperimento è iniziato (nostre osservazioni non pubblicate, vale a dire il trattamento durante la notte con 40 micron clorochina). Una concentrazione inibitore che impedisce di clivaggio della proteina di interesse, ma non porta alla formazione di inserimento deve essere utilizzato. Over-trasfezione di cellule con paGFP può anche causare evidenti inclusioni di paGFP, che fluorescenza senza foto-attivazione. Recentemente foto-attivati paGFP sarà preferenzialmente il traffico verso queste inclusioni e interferire con l'interpretazione dei risultati. Quando alla ricerca di cellule di immagine, evitare di cellule con evidenti inclusioni paGFP. Nella nostra esperienza con βAPP-paGFP, c'è una fluorescenza verde molto debole nelle cellule che esprimono βAPP-paGFP al livello appropriato. Questo debole fluorescenza in genere non può essere ripreso e può essere visto solo attraverso l'oculare.
(cioè membrana plasmatica) può essere difficile da rilevare. Questo può essere perché il segnale fluorescente, distribuito su una vasta area, diluito o che il profilo in sezione trasversale della membrana è inferiore alla risoluzione del microscopio confocale. Può essere possibile aggirare questo problema l'imaging utilizzando un microscopio a epifluorescenza. Tuttavia, questo ridurrà significativamente la risoluzione spaziale della tecnica.
Un vantaggio di questa tecnica è la sua applicabilità ad altre proteine di membrana. Mentre questa tecnica dipende oltre espressione di diverse proteine, sembra che il traffico di proteina non è apertamente interrotto, come è stato dimostrato con VSVG-paGFP e βAPP-paGFP 30. Oltre al lisosoma, altri marcatori di sistema endosomal / lisosomiale sono stati utilizzati con successo. Questi includono Rab5-MRFP per i primi fineosome e rab9-mchFP (proteina fluorescente ciliegia) per la fine del endosome. Questo potente tecnica di microscopia può essere estesa a seguire il traffico di altre proteine del TGN. Si potrebbe ugualmente essere applicato a seguire il traffico tra i compartimenti discreti forniti marcatori vano ben definiti sono disponibili.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione o conflitti di interesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
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