Summary
Mens transport av celleoverflateproteiner som er forholdsvis lett studert, visualisering handel med intracellulære proteiner er mye vanskeligere. Her bruker vi konstruerer innlemme photoactivatable GFP og vise en metode for å nøyaktig følge amyloidforløperprotein fra Golgi-apparatet til nedstrøms avdelinger og følge sin klarering.
Abstract
Beta-amyloid (Ap) er den viktigste bestanddel av senile plakk som finnes i hjernen til Alzheimers sykdom pasienter. Ap er avledet fra sekvensiell spalting av amyloidforløperprotein (APP) med β og y-secretases. På tross av betydningen av Ap til AD patologi, er den subcellulære lokalisering av disse skillelinjer ikke er godt etablert. Arbeid i vårt laboratorium og andre implisere den endosomale / lysosomale system i APP prosessering etter internalisering fra celleoverflaten. Imidlertid er den intracellulære smugling av APP relativt studerte.
Selv om celle-overflateproteiner er foranderlig for mange merkingsteknikker, er det ingen enkle metoder for å følge handel med membranproteiner fra Golgi. For å oppnå dette, har vi opprettet APP konstruksjoner som ble tagget med fotoaktiverbar GFP (paGFP) på C-terminalen. Etter syntese, har paGFP lav basal fluorescens, men det kan stimuleres med 413 nm lys to lage en sterk, stabil grønn fluorescens. Ved hjelp av Golgi markør galaktosyl transferase koblet til Cyan Fluorescent Protein (Galt-CFP) som et mål, er vi i stand til å nøyaktig photoactivate APP i trans-Golgi nettverk. Photo-aktivert APP-paGFP kan deretter bli fulgt som det traffics til nedstrøms avdelinger identifisert med fluorescently tagget kupé markørproteiner for tidlig endosomet (Rab5), avdøde endosomet (Rab9) og lysosomet (LAMP1). Videre, ved hjelp av inhibitorer for å APP prosessering, inkludert klorokin eller γ-sekretase inhibitor L685, 458, er vi i stand til å utføre puls-chase eksperimenter for å undersøke prosessering av APP i enkeltceller.
Vi finner at en stor andel av APP beveger seg hurtig til lysosomet uten å virke på celleoverflaten, og er da fjernet fra lysosomet ved sekretaselignende spaltinger. Denne teknikken demonstrerer nytten av paGFP for å følge menneskehandel og behandling av intracellulære proteiner from Golgi til nedstrøms avdelinger.
Introduction
Kjennetegnet av Alzheimers sykdom (AD) er tilstedeværelsen av senile plakk og nevrofibrillære floker (NFTs) i hjernen. Hovedbestanddelen av senile plakk er β-amyloid (AP). Ap er avledet fra dets forløper; amyloid forløper protein (APP) 1. Den amyloidogene spalting av APP begynner med fjerning av ectodomain fra APP av β-secretase to. Den gjenværende 99 rest-karboksyl-terminalt fragment (CTF) kan spaltes ved γ-sekretase å produsere Ap 3-7. Mens mange forsøk har dokumentert spalting av celleoverflaten APP etter intern fra celleoverflaten inn i endosomale / lysosomal system, har en rekke nyere studier antydet at intracellulær trafficking av APP er også viktig i å regulere sin behandling 8-11.
Det har vært en rekke forsøk på å modulere nivåene av Ap med y-sekretaselignende inhibitorer og Ap Immunotherapies. Men nyere kliniske forsøk med disse behandlinger viste ingen fordel, og i noen tilfeller, forårsaket skade 12. En uutnyttet strategi for å modulere produksjon av Ap er å endre den sub-cellulære lokalisering av APP og γ-sekretase interaksjon. Golgi, plasma membran og endosomer / lysosomer har alle blitt foreslått som mulige steder for γ-spalting av APP. Forskning fra vårt laboratorium tyder på at APP og γ-secretase er bosatt proteiner av lysosomal membran 13. Videre har vi funnet at det lysosomale γ-sekretase har en sur optimal pH 13. I tillegg, alkalisering av den endosomale / lysosomale system med klorokin eller NH4CI, har vist seg å redusere produksjonen av Ap 14. y-sekretase hemming eller utstansing eller presenilin fører til APP-CTFs akkumulering i lysosomet 15-17. Videre forstyrre APP endocytose senker Ap produksjons 18-20.
Til tross for viktigheten av Golgi som en sorteringsstasjon for begynnende proteiner og proteiner resirkulert fra endosomale / lysosomal system, har den intracellulære smugling av APP ikke blitt studert i detalj 21. Nyere arbeider har vist at APP kan resirkuleres til den trans-Golgi-nettet (TGN) via interaksjon med retromer komplekset. Nedregulering av retromer komplekse synker Ap produksjon 8,22-24. Imidlertid utslipp av APP fra Golgi har ikke blitt godt undersøkt.
Mens etter endocytose av celleoverflateproteiner, slik som transferrin-reseptoren, er lett merket og etterfulgt, etter omsetning av intracellulære proteiner er mer utfordrende. Faktisk har noen proteiner hatt sine intracellulær trafficking avbildes. Ankomsten av fluorescerende protein koder, slik som fotoaktiverbar-GFP (paGFP), har gitt nye verktøy for å undersøke intracellulær trafficking. Fotoaktiverbar-GFP er en form for GFP som er nesten usynlig etter syntese, men utvikler sterk grønn (GFP) fluorescens etter å ha blitt aktivert ved 413 nm laserlys, og dette signalet er stabilt i flere dager 25,26. Konstruksjoner som bruker paGFP har blitt brukt for å demonstrere den intralysosomal omsetning av det lysosomale protein membranprotein 1 (LAMP1) 25, celleoverflaten levering av vesikulær stomatitt virus glykoprotein (VSVG, en markør for den sekretoriske vei) 27, og omsetningen av peroxisomes 28 og autophagosomes 29.
For å visualisere sortering av APP fra TGN i levende celler, utformet vi plasmid uttrykker de siste 112 aminosyrer av APP koplet til fotoaktiverbar (paGFP) på C-terminal (referert til som βAPP-paGFP) 30. Vi har også utført disse eksperimentene med full lengde APP og oppnådde lignende resultater; den ΒAPP konstruksjonen er brukt her, fordi det gir klarere bilder. Vi så foto-activate &# 946; APP-paGFP bare i TGN, som avgrenses av TGN markør Galactosyltransferase (Galt). Selv APP har blitt tagget med paGFP å visual rask aksonal transport av APP og klaring fra perinukleære regionen, er dette den første demonstrasjonen av APP trafficking fra en nøye definert rommet til en annen 11,31,32. Her viser vi nøyaktig bilde-aktivering i TGN og utslipp av APP til nedstrøms avdelinger og påfølgende spalting og klaring fra lysosomer 30. Den nøyaktige foto-aktivering i Golgi er allment gjeldende for andre proteinsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celleutplating og Transfeksjon
- I en cellekultur hette, plate ~ 300.000 til ~ 500.000 SN56 celler (en slags gave av Dr. Jane Rylett) på en 35 mm glass-bottom confocal tallerken og dekk med pre-transfeksjon media (Dulbeccos Modified Eagle Medium, DMEM, supplert med 10% FBS).
- Inkuber celler over natten ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator å spre seg.
Merk: Cellene bør være ca 50% -70% konfluent før transfeksjon. - I en cellekultur hette, transfektere celler med plasmider som uttrykker et fluorescerende protein tagget TGN markør (galaktosyl transferase koblet til Cyan Fluorescent Protein, Galt-CFP), et fluorescerende protein tagget rommet markør (her, lysosomet forbundet membran protein 1, LAMP1, merket med mRFP), og protein av interesse merket med paGFP (βAPP-paGFP). (Disse konstruksjonene er tidligere blitt beskrevet 30)
- Inkuber celler med transfeksjon reagens og plasmid DNA feller 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Bruker et forhold på ~ 2 pg av DNA til 5 ul transfeksjon middel (f.eks lipofektamin 2000) for å beste balanse cytotoksisitet og transfeksjonseffektivitet. Aktuelle konsentrasjoner kan trenge å bli optimalisert for forskjellige plasmider. I forsøkene som er beskrevet her, kan du bruke en mikrogram / konfokal rett av βAPP-paGFP, 0,3 mikrogram / konfokal rett av LAMP1-mRFP, og 0,2 mikrogram / konfokal rett av Galt-CFP.
Merk: Mengden plasmid som anvendes vil avhenge av transfeksjonseffektivitet. - For neuronale cellelinjer: Etter trinn 1.4, i en cellekultur hette, fjernes før transfeksjon media og differensiere SN56 cellene i 2 ml DMEM supplert med 0,1% penicillin / streptomycin med 1 mM dibutyryl syklisk AMP (dbcAMP) i 24 timer.
2. Microscope Stage Forberedelse
- Pre-varm fosfatbufret saltløsning (PBS) og Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) til 37 ° C. Warm-up mikroskop scenen før imaging til 37 ° C.
- Vask cellene to ganger med PBS, for å fjerne differensiering media og erstatte med 2 ml HBSS ved 37 ° C. Plasser celler på objektbordet oppvarmet til 37 ° C.
Merk: Cellene er levedyktig i ca 1,5-2 timer i HBSS. - Tillat 5-10 min for konfokal platetemperatur til likevekt med mikroskopet trinnet.
3. Bilde-aktivering av ROIs over Golgi
- Med mikroskop okularet, finne celler transfektert med Galt-CFP, LAMP1-mRFP, og βAPP-paGFP.
- Bruk en olje-nedsenking objektiv med høy forstørrelse (dvs. 63X eller 100X). For visuell bekreftelse av fluorescens, bruke et filter settes i stand til å visualisere FITC (for CFP og GFP fluorescens) og rhodamin (for mRFP fluorescens).
- Still konfokale skive for hver kanal til omkring 1 pm. Ta et bilde med lav oppløsning.
- Beskjær til bilde bare cellen av interesse.
- Bruke innstillingsratt, manuelt sattfokalplanet til midten av cellen. Dette er vanligvis den del av cellen, hvor kjernen er størst.
- Tegn 3-5 sirkulære Regions of Interests (Rois) i TGN (Galt-CFP fluorescens).
- Å trekke ROIs (dvs. i Zeiss LSM program), velg "Edit ROI" -knappen på kommandokonsollen.
- Velg den runde ROI-knappen.
- Klikk og dra over Galt-CFP positive delene av cellen.
Merk: foto-bleking pakker for mange mikroskoper har denne muligheten.
- Ta et bilde av cellen med kledde ROIs. Lagre en kopi av de Rois for senere bruk.
- Hvis du vil lagre Rois til bildet, velg "Macro" -knappen.
- Trykke på "Load" -knappen for å starte 'CopyRoisToOverlay' (filbanen: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
Merk: En konfokal mikroskop utstyrt med 475-525 nm (CFP) band pass (BP), en 500-530 nm BP (GFP),og en 560 nm lang pasning (LP) filter sett er påkrevd. En argon laser for 458 nm og 488 nm utslipp og en HeNe laser for 540 nm utslipp er også nødvendig.
- Set-up mikroskop for et blekemiddel tid kurset.
- Sett laser diode (25 mW 405 nm laser) til maksimal effekt.
ADVARSEL: Kraftig foto-aktivering kan føre til foto-toksisitet eller skade på cellemembraner. Bruk vernebriller for å unngå retinal skade. - Set-up mikroskop for 120 sykluser av bildebehandling.
Merk: En bildesyklus består av bleking innenfor ROIs og avbildning av hele cellen. Dette er et blekemiddel tid kurset. - Sett mikroskop for å bleke (foto-activate) bare ROIs i 20-30 gjentakelser etter hvert bilde. Tiden til bilde og bleike et bilde vil variere. Angi en tidsforsinkelse mellom bilder slik at hver syklus er ca 30 sek.
Merk: bilde del av hver syklus tar ca 15-30 sek avhengig av bildestørrelsen. Bleke for hver ROJeg er ca 50 msek. Bleking av alle 4 ROIs for 20 iterasjoner vil ta 4 sek ved slutten av hvert blekemiddel / bilde syklus.
- Sett laser diode (25 mW 405 nm laser) til maksimal effekt.
- Start blekemiddel tidsforløpet.
- Slå av blekingen etter 15 minutter (30 sykluser av avbildning og bleking), men fortsette å ta bilder av cellen.
Merk: Tid 0 til 15 min er "puls" periode. - Fortsett å ta bilder i 45 min (uten bleking), å følge clearance av βAPP-paGFP.
Merk: Tid 15 til 45 min er "jage" periode. - Ved bruk av analysefremgangsmåten beskrevet i trinn 6, co-lokalisering for proteinet av interesse (her, βAPP-paGFP) med kammeret av interesse (her, LAMP1-mRFP) ved å gjøre overflatene til hver kanal.
4. Bestem Nedstrøms Kammer
- For å bestemme om lysosomer (i disse eksperimenter) er den siste kammeret, legge membran-gjennomtrengelige proteasehemmere for å forårsake proteiner til å akkumulere i lysosomet.
- For βAPP, bruke 0,5 uM L685, 458 (spesifikk γ-sekretase inhibitor) over natten, eller 100 pM klorokin (deacidifies lysosomer) i 30 min før avbildning.
- Finn celler og photoactivate som i trinn 3,1 - 3,8.
- Bilde cellen i ytterligere 45 min (uten fotoaktivering) for å bestemme hvor βAPP-paGFP akkumulerer i mangel av spalting.
- Analyser levering av protein til lysosomer (eller annet nedstrøms rommet) og påfølgende klaring i henhold til den metode som er beskrevet i trinn 6.
5. Sørg Nøyaktighet av Photo-aktivering i Golgi
- Warm-up HBSS til 37 ° C.
- Fremstille en 2 ml oppløsning for hver konfokal plate som skal avbildes, for 66 uM nocodazol (behandling) eller DMSO (kontroll) i HBSS.
- For én konfokalt plate, pipette 2 ml 37 ° C HBSS og legge 7,96 mL av nocodazol fra en 16,60 mm nocodazol lager.
- Som en kontroll såning, pipette 2 ml 37 ° C HBSS i en 2 ml tube og legge 7,96 mL av DMSO.
- Inkuber cellene i HBSS med nocodazol eller DMSO i 5 minutter før avbildning.
- Finne celler som i trinn 3.1.
- Før fotoaktivering, forberede mikroskop for å ta en Z-stack etter fotoaktiveringsperioden.
- Klikk på "Z Stack" -knappen. Begynne å skanne ved hjelp av Fast XY.
- Juster fokalplanet med mikroskopet innstillingsknappen til toppen av cellen. Trykk 'Mark First "for å sette den første posisjonen i bunken.
- Juster fokalplanet med mikroskopet justeringsknotten til bunnen (nærmest glass) av cellen. Trykk 'Mark Sist "for å sette den siste plassen i bunken.
- I Z stabelen panelet, trykker du på "Z seksjonering" -knappen. Sett "Intervall" til en mikrometer.
Merk: For en høyere romlig oppløsning stable en mindre bunke intervall, men flere bilder måtas forlenge avbildningstiden for stabelen.
- Bleke cellene, som beskrevet i trinn 3.7 til 3.8. Photo-activate og bilde fra 0 min til 15 min (30 bilder).
- Stopp bilde etter 30 rammer. Umiddelbart lagre et bilde av videoen.
Forsiktig: Noen mikroskoper kan overskrive første videoen hvis det ikke er lagret før du starter en ny bildesekvens. - Etter å ha lagret video, umiddelbart skaffe seg en Z-stack, ved hjelp av parametrene fra trinn 5.5.
- Co-lokalisere βAPP-paGFP med Galt-CFP (eller annen Golgi markør), som beskrevet i trinn 6.
Merk: CFP photobleaches raskt og kan ikke være synlig ved utgangen av bildebehandling perioden. Colocalization kan ikke være mulig med Galt-CFP. Hvis colocalization er nødvendig, bruker mRFP å tagge Galt.
6. Vesikkel Filtrering og colocalization
- Bruk et analyseprogram (f.eks Imaris) for å gjøre flatene på rommet (f.eks LAMP1-mRFP) og en protein of interesse (f.eks βAPP-paGFP).
- Gå inn på "overgå" -delen av analyseprogrammet ved å klikke på overgå knappen på menylinjen øverst.
- Velg Surface veiviserknappen øverst til venstre mest panel (5 th knapp fra venstre).
- Velg en kanal for å filtrere vesikler (dvs. βAPP-paGFP fluorescens, protein av interesse).
- Utfør bakgrunn subtraksjon ved å sende diameteren på den største vesikkel i feltet veiviseren og trykk neste til. Analyseprogrammet velger automatisk - basert på en terskelverdi avledet fra den største vesicle i felten - et område i kanalen er av interesse.
- Manuelt justere terskelen bakgrunnen for å avgrense utvalget om nødvendig.
- På bunnen av Threshold valgskjermen, sjekk 'Split rørende gjenstander alternativet for å skille den kombinerte overflater.
Merk: Hvis mange vesikler er tett gruppert tilGether, analyseprogrammet vilje gruppe disse objektene under ett underlag.- Velg 10-15 representative vesikler og beregne gjennomsnittlig vesikkel diameter og skriv inn resultatet i veiviseren.
- Raffinere de valgte spirepunkter ved å øke eller redusere terskelen på "Quality" (intensitet av kanalen i midten av hver flekk).
Merk: Overflater av kanalen av interesse vil bli opprettet. Videreutvikling av de utvalgte flater kan utføres på dette tidspunkt. Terskel vesikler basert på antall piksler i hver vesikkel. - Maskere den opprinnelige kanalen med denne overflaten. Å maskere, velg fjerde fanen fra venstre i overflaten veiviseren (blyant).
- Velg "Mask All '. En ny kanal med vesikler av interesse vil bli opprettet.
Merk: Under masken prosessen, er et alternativ for å kopiere den opprinnelige kanalen tilbys. Velg dette alternativet hvis de opprinnelige dataene må lagres. - Gjenta sTeps 6.1 gjennom 6.7 for den ufiltrerte kanal (dvs. LAMP1 mRFP, rommet).
- På toppen verktøylinjen, velg colocalization verktøyet.
- I den øvre delen, som histogrammer av kanalene som skal colocalized vises, velg den nylig opprettede maskerte kanaler.
- Velge alle tilgjengelige data. Det er mørke piksler som er noen ganger til stede etter analyse. Ikke velg disse pikslene i histogrammet, vil de forskyve resultatene.
- I høyre panel, velg "Build Coloc Channel". Dette skaper en ny kanal som bare inneholder de colocalized piksler. Dataene vil være i samme panel under "Channel Statistikk" -knappen. Dataene kan eksporteres som en CSV-fil.
- Bruk "Prosent av Material colocalized 'statistikk. Dette alternativet tar hensyn til intensiteten av piksler og størrelsen av objektet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske resultater viser βAPP forlater TGN og ser ut til trafikk raskt til LAMP1 (Figur 1a og b). Under fotoaktiveringsperioden, kan vesikler sees avgang Golgi bestemt for lysosomer (Figur 1b). Uten inhibitor behandling, vil paGFP fluorescens være synlig i lysosomer mens det er fotoaktivering i TGN. Etter å ha stoppet fotoaktivering, er βAPP-paGFP raskt fjernet fra lysosomet (sammenlign figur 1a til 1b). Behandling med nocodazol fører til opphopning av APP innenfor Galt-CFP merket avdelinger og forhindrer trafficking til lysosomer (Figur 1c).
Den svenske mutasjon av APP (APPsw) øker frekvensen av β-spalting av 10-fold 34. Med rask spalting av βAPPsw-paGFP, vises paGFP fluorescens som en diffus fluorescens signal i cytosol. Antagelig dette jegs et resultat av rask spalting av βAPP γ-sekretase frigjøring av den C-terminale paGFP inn i cytoplasma (figur 2). I nærvær av γ-sekretase inhibitor, akkumuleres βAPP i lysosomene.
Etter levering av βAPP til lysosomet er paGFP fluorescens ryddet raskt. Den korte oppholdstiden kan være et resultat av trafficking fra lysosomet til en annen avdeling. Omvendt, vil spalting av βAPP ved γ-sekretase kan forventes å føre til spredning av paGFP fluorescens fra lysosomale membranen (figur 3a). Den diffuse fluorescens er vanskeligere å oppdage ved konfokalmikroskopi. For å avgjøre om βAPP er levert til en annen avdeling eller fjernet, ble SN56 celler behandlet med en spesifikk hemmer mot γ-secretase (L685, 458) eller en alkaliserende middel (klorokin). Tillegg av enten L685, 458 eller klorokin resulterte i APP akkumulering i lysosomet (
Det er allment akseptert at APP leveres til celleoverflaten før de går gjennom endocytose og behandles i endosomer og lysosomer 35. Men i våre ubehandlede celler, celleoverflate βAPP kunne ikke påvises ved konfokal mikroskopi. Foto-aktivert βAPP kan ikke konsentreres i et bestemt område av plasmamembranen. I stedet kan det være en diffus fluorescens over det store overflatearealet av plasmamembranen. Interessant, fører γ-sekretase inhibitor til behandling påvisbar βAPP-paGFP på celleoverflaten (figur 3b). γ-sekretase inhibitor behandling kan rute mer βAPP til celleoverflaten, i tillegg til å hemme enzymfunksjon. Derfor er det store overflatearealet av plasmamembranen sprer paGFP over et større område og blir detekteringen vanskelig, selv om proteinet er til trafikkrommet.
1 "src =" / filer / ftp_upload / 53153 / 53153fig1.jpg "/>
Figur 1. Imaging smugling av APP til lysosomer. SN56 celler ble transfektert med LAMP1-mRFP, Galt-CFP, og βAPP-paGFP. A) Cellen var nøyaktig bilde-aktivert innen ROIs plasseres over Golgi (ROIs merket med hvite sirklene ). Cellen var alternativt bilde-aktivert og avbildes i 15 minutter for å avgjøre βAPP-paGFP trafficking. Inset viser menneskehandel innenfor perinukleære området fra Golgi til lysosomer. Samlokalisert piksler vises gult. B) smugling av en vesikkel som inneholder βAPP-paGFP til lysosomet. Gule piksler betegne LAMP1 og βAPP-paGFP colocalization. C) SN56 celler ble behandlet med nocodazol før bildebehandling for å hindre βAPP-paGFP egress fra TGN. Et representativt bilde som er tatt fra utgangen av fotoaktiveringsperioden. I høyre panel, en Z-stabel med den samme cellen tas like etter fotoaktivering. Th e Galt-CFP har vært falsk farget rødt for å bedre visualisering av colocalized Galt-CFP og βAPP-paGFP. Gule piksler betegne colocalization mellom Galt-CFP og βAPP-paGFP. Skala barer representerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Trafficking of βAPPsw-paGFP. SN56 celler ble transfektert med LAMP1-mRFP, Galt-CFP og βAPPsw-paGFP (βAPP med familiær svenske mutasjon). Den svenske mutasjon øker frekvensen som APP spaltes. Celler ble alternativt innenfor Golgi foto-aktivert og avbildes. En diffus fluorescens kan sees etter paGFP er løsrevet fra det lysosomale membranen til å diffundere inn i cytoplasma. Scale bar representerer fem mikrometer.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Bestemme terminalen organeller. SN56 celler ble transfektert med LAMP1-mRFP, Galt-CFP og βAPP-paGFP. Etter foto-aktivering ble cellene fulgt i ytterligere 45 min. De to venstre-mest panelene viser cellene før fotoaktivering (lengst til venstre) og 15 min etter fotoaktivering (i midten). Panelet på helt til høyre viser APP fluorescens etter 45 min av total bildebehandling i a) ubehandlet, b) γ-secretase inhibitor behandlet, eller c) klorokin behandlet. Pilspisser peke på APP samlokalisert med LAMP1 etter 45 min av bildebehandling. Skala barer representerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av ther figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken beskriver nøyaktig bilde-aktivering av membran proteiner merket med paGFP i TGN å visualisere påfølgende trafficking og cleavage. Mens paGFP ble skapt over et tiår siden 25, er dette det første eksempelet på nøyaktig fotoaktivering å følge smugling av begynnende proteiner til nedstrøms avdelinger. Tidligere studier med APP-konstruksjoner paGFP foto-aktivert en peri-atom region av cellen, som ble ansett for å være den 11 Golgi. Men så tydelig i våre mikrografer, lysosomer, tidlige endosomer og sene endosomer også bli funnet i denne regionen (figur 1 og referanse 30). Disse eksperimenter har blitt kjørt med hell i HEK293 celler, COS7-celler, nerveceller, SN56 SH-SY5Y-celler og mus nerveceller, selv om transfeksjonseffektiviteten muse neuroner er lav. Lignende forsøk har blitt utført ved hjelp av full lengde APP konstruerer og forkortede konstruksjoner, som inkluderer siste 112 aminosyrer av APP, med p- og γ-spaltningsseter, smeltet til paGFP. Den forkortede konstruksjoner er lettere å transfektere og gi en høyere fluorescerende signal, og disse er vist i de medfølgende figurer. Våre forkortede konstruerer også mangler N-terminal ectodomain, som har udefinerte skillelinjer og sorteringssignaler 38. Til tross for disse N-terminal signaler og konfliktlinjer, finner vi at vår forkortet konstruksjonen har lignende lokalisering og smugling som en full-lengde APP-paGFP 30, 33.
På grunn av de mange organeller i peri-kjernefysiske området av cellen, ble vårt ytterste for å sikre nøyaktigheten av foto-aktivering. Under bildebehandling perioden, vil cellen og Golgi flytte. Derfor må de foto-aktiverings ROIs følges nøye under foto-aktiveringsperioden og justeres for å holde seg på toppen av Golgi. Konfokale mikroskoper er følsomme for små endringer i temperaturen. For eksempel, AC eller oppvarming vents over mikroskop,pe kan føre til en endring av bildeplanet.
For å opprettholde konsistens mellom eksperimenter, setter vi en tidsforsinkelse mellom hvert bilde-aktivering / bildesyklus. Tid er nødvendig å bleke de Rois og bilde cellen. Avhengig av størrelsen på cellen og antallet ROIs, til tidspunktet bleke og ta ett bilde vil variere. For å opprettholde konsistens fra bilde til bilde, sette en tidsforsinkelse mellom bildene slik at hvert bilde, inkludert bleking, krever omtrent 30 sekunder. Økt tidsmessig oppløsning kan oppnås ved bruk av deteksjonssystemer som benytter en bjelke shaper (f.eks LSM5 Live-detektor). Disse mikroskoper kan bildet med 120 bilder / sekund med noe tap i oppløsning.
For å bekrefte nøyaktigheten av foto-aktivering, er det viktig å utføre en nocodazol kontroll. Ved å blokkere transport ut av Golgi under fotoaktivering, sikrer dette at paGFP ikke blir signifikant aktivert i de andre kamrene.CFP foto-blekemidler raskt med gjentatt bildebehandling og bleking og kan gjøre colocalization med Galt-CFP vanskelig. Hvis mesteparten av paGFP fluorescens forblir i Golgi-området, kan dette også indikere nøyaktig bilde-aktivering. Alternativt kan Galt merkes med mRFP, som er mer stabil enn foto-CFP i disse forsøkene.
Forbedret aktivering i Golgi kan også oppnås med en multi-foton mikroskop. Mens det konfokale avbildningsplanet i disse forsøkene er typisk et 1 um skive, laseren for avbildning og fotoaktivering vil passere gjennom hele cellen. En multi-foton laser kan anvendes for disse forsøk, og kan forbedre nøyaktigheten i alle tre dimensjoner 35. Men som vist her, er en tradisjonell 405 nm laser diode tilstrekkelig til nøyaktig foto aktivere βAPP-paGFP i TGN.
Som en kontroll, har vi utført lignende forsøk for VSVG-paGFP fluorescens. VSVG-paGFP, som erkonstitutivt levert til celleoverflaten 27,37, ble visualisert blir levert til bestemte underregioner i plasmamembranen 30. Dette sikrer at transporten til intracellulære ikke er utløst av over-ekspresjon eller tilstedeværelsen av paGFP tag.
Diffuse paGFP fluorescens kan være vanskelige å lokalisere med konfokal mikroskopi. Etter vår erfaring er APP raskt spaltes og ser ut til å ha en kort levetid som en full-lengde protein på lysosomal membran. Dette problemet forsterkes av den svenske FAD mutasjon som akselererer frekvensen av APP cleavage 34. Å benytte teknikken for hurtig spaltede proteiner, er en inhibitor viktig for å bestemme den endelige nedstrømsrommet. Hemming av γ-secretase av L685, 458 eller klorokin føre til betydelig opphopning av APP i lysosomer; selv med den svenske mutasjon.
Hvis for mye inhibitor brukes, kan dette føre til intracellulære ackumulasjon βAPP-paGFP, og kan føre til proteinslutninger. Akkumulert paGFP i inneslutninger resultater i fluorescerende paGFP slutninger i cellen før forsøket har startet (våre upubliserte observasjoner, dvs. behandling over natten med 40 mikrometer klorokin). En inhibitor-konsentrasjon som hindrer spalting av proteinet av interesse, men fører ikke til inklusjon dannelse bør brukes. Over-transfeksjon av celler med paGFP kan også medføre åpenbare inneslutninger av paGFP, som fluorescerer uten fotoaktivering. Nylig foto-aktivert paGFP vil fortrinnsvis trafikk til disse inneslutninger og forstyrre tolkningen av resultatene. Når vi leter etter celler til bilde, unngå celler med åpen paGFP slutninger. I vår erfaring med βAPP-paGFP, det er en veldig svak grønn fluorescens i celler som uttrykker βAPP-paGFP på riktig nivå. Dette svak fluorescens vanligvis ikke kan avbildes og kan bare ses gjennom okularet.
(dvs. plasmamembranen) kan være vanskelig å oppdage. Dette kan være fordi den fluorescerende signal, som blir spredt over et stort område, er fortynnet eller fordi membranen profilen i tverrsnitt er under oppløsningen av det konfokale mikroskop. Det kan være mulig å omgå dette problemet ved å avbilde ved hjelp av et mikroskop epifluorescens. Imidlertid vil dette redusere den romlige oppløsningen av teknikken.
En fordel med denne teknikken er dens anvendbarhet til andre membranproteiner. Selv om denne teknikken avhenger over uttrykk for flere proteiner, ser det ut til at protein trafficking ikke er åpenlyst forstyrret, som har blitt demonstrert med VSVG-paGFP og βAPP-paGFP 30. I tillegg til lysosomet har andre markører for den endosomale / lysosomale systemet også vært brukt med hell. Disse inkluderer rab5-mRFP for tidlig sluttOSOME og rab9-mchFP (kirsebær fluorescerende protein) for sent endosomet. Denne kraftige mikroskopi teknikk kan utvides til å følge smugling av andre proteiner fra TGN. Det kunne like gjerne brukt til å følge trafficking mellom diskrete avdelinger følger veldefinerte kupé markører er tilgjengelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al.
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
