Summary
Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum.
Abstract
Beta-Amyloid (Aß) ist der Hauptbestandteil von senilen Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten gefunden. Aß wird aus der sequentiellen Spaltung des Amyloid-Vorläuferprotein (APP), die durch β und γ-Sekretasen abgeleitet. Trotz der Bedeutung von Aß zu AD-Pathologie ist die subzelluläre Lokalisation dieser Spaltungen nicht gut etabliert. Arbeiten in unserem Labor und andere implizieren die endosomale / lysosomale System in APP-Prozessierung nach der Internalisierung von der Zelloberfläche. Allerdings ist die intrazellulären Transport von APP relativ wenig unter.
Während Zelloberflächenproteine sind abänderbar viele Markierungstechniken, es gibt keine einfachen Methoden zum Folgen des Handels mit Membranproteinen vom Golgi. Zu diesem Zweck haben wir APP-Konstrukte, die mit photoaktivierbaren GFP (paGFP) gekennzeichnet wurden, am C-Terminus hergestellt. Nach der Synthese hat paGFP niedrigen Grundfluoreszenz, aber es kann mit 413-nm-Licht t stimuliert werdeno erzeugen eine starke, stabile grüne Fluoreszenz. Mithilfe der Golgi Marker Galactosyltransferase zu Cyan Fluorescent Protein (GalT-GFP) als Ziel verbunden ist, sind wir in der Lage, genau zu photoaktivieren APP in dem Trans-Golgi-Netzwerk. Photo-aktivierte APP-paGFP kann dann verfolgt werden, wie es Verkehre an nachgeschaltete Fächer mit fluoreszenz identifiziert getaggt Fach Markerproteine für die frühe Endosomen (Rab5), den späten Endosomen (Rab9) und Lysosom (LAMP1). Außerdem wurde unter Verwendung Inhibitoren APP Verarbeitung einschließlich Chloroquin oder der γ-Sekretase-Inhibitor-L685, 458, können wir die Pulse-Chase-Experimente durchzuführen, um die Verarbeitung von APP in einzelnen Zellen zu untersuchen.
Wir finden, dass ein großer Anteil von APP schnell bewegt zum Lysosom, ohne an der Zelloberfläche erscheinen, und wird dann aus dem Lysosom durch Sekretase-ähnliche Spaltungen gelöscht. Diese Technik zeigt die Nützlichkeit paGFP zum Folgen des Menschenhandels und die Verarbeitung von intrazellulären Proteinen herm die Golgi an nachgeschaltete Kammern.
Introduction
Das Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) ist die Anwesenheit von senilen Plaques und neurofibrillären Tangles (NFT) im Gehirn. Der Hauptbestandteil der senilen Plaques darstellt β-Amyloid (Aß). Aß wird aus seinem Vorläufer abgeleitet ist; Amyloid-Vorläuferprotein (APP) 1. Das amyloidogene Spaltung von APP beginnt mit der Entfernung von der Ektodomäne von APP durch β-Sekretase-2. Die restlichen 99-Rückstand carboxyterminale Fragment (CTF) durch γ-Sekretase gespalten werden, um Aß 3-7 herzustellen. Während viele Experimente haben die Spaltung der Zelloberflächen-APP nach Internalisierung von der Zelloberfläche in das endosomale / lysosomale System dokumentiert, wurde eine Anzahl von jüngsten Studien vorgeschlagen, den intrazellulären Transport von APP ist auch bei der Regulierung der Verarbeitung 8-11 wichtig.
Es gab eine Reihe von Versuchen bei der Modulation der Niveaus von Aß mit γ-Sekretase-Inhibitoren und Aß immun gewesenotherapies. Allerdings haben neuere klinische Studien mit diesen Therapien zeigten keinen Vorteil, und in einigen Fällen eine Erhöhung der Schaden 12. Ein ungenutztes Strategie Aß Produktion modulieren, um die subzelluläre Lokalisation von APP und γ-Sekretase-Wechselwirkung verändern. Die Golgi, Plasmamembran und Endosomen / Lysosomen wurden alle als mögliche Schauplätze für γ-Spaltung von APP wurde vorgeschlagen. Forschung aus unserem Labor legt nahe, dass APP und die γ-Sekretase ansässig sind Proteine der lysosomalen Membran 13. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die lysosomale γ-Sekretase einen sauren pH-Optimum 13. Zusätzlich Alkalisierung der endosomalen / lysosomalen System mit Chloroquin oder NH 4 Cl, wurde gezeigt, dass die Produktion von A & bgr; 14 zu verringern. y-Sekretase Inhibition oder Knockout oder Presenilin führt zu APP-CTFs Ansammlung im Lysosom 15-17. Darüber hinaus stören APP Endozytose senkt Aß Produktion 18-20.
Trotz der Bedeutung der Golgi als Sortierstation für naszierende Proteine und Proteine aus dem endosomalen / lysosomalen System zurückgeführt wird, hat die den intrazellulären Transport von APP nicht ausführlich 21 untersucht. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass APP kann dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) über die Interaktion mit dem Komplex Retromer recycelt werden. Herunterregulierung des Retromer Komplex abnimmt Aß Produktion 8,22-24. Jedoch der Austritt von APP vom Golgi wurde noch nicht ausreichend untersucht.
Beim Folgen der Endozytose von Zelloberflächenproteine, wie Transferrin-Rezeptors sind, leicht markiert und anschließend, nach dem Handel von intrazellulären Proteinen ist schwieriger. In der Tat haben einige Proteine hatten ihre intrazellulären Transport abgebildet. Das Aufkommen von fluoreszierenden Protein-Tags, wie photoaktivierbare-GFP (paGFP), hat neue Tools bereitgestellt, um intrazellulären Transport zu untersuchen. Photoaktivierbare-GFP ist eine Form von GFP, die nach der Synthese nahezu unsichtbar ist, aber entwickelt sich stark grün (GFP) Fluoreszenz, nachdem sie von 413 nm Laserlicht aktiviert, und dieses Signal für die Tage 25,26 stabil ist. Konstrukte mit paGFP wurden verwendet, um die intralysosomalen Handel des lysosomalen Proteins nachweisen membrane protein 1 (LAMP1) 25, die Zelloberfläche Lieferung des vesikulären Stomatitis-Virus-Glykoprotein (VSVG, ein Marker für den sekretorischen Weg) 27, und der Umsatz von Peroxisomen 28 und 29 Autophagosomen.
Um die Sortierung von APP aus dem TGN in lebenden Zellen sichtbar, haben wir Plasmid, die letzten 112 Aminosäuren von APP zu photoaktivierbare (paGFP) auf der C-terminalen 30 verbunden (als & beta; APP-paGFP bezeichnet). Wir haben auch durchgeführt, diese Experimente mit voller Länge APP und erzielte ähnliche Ergebnisse; die & beta; APP-Konstrukt wird hier verwendet, da es ein helleres Bild. Wir haben dann Foto-activate &# 946; APP-paGFP nur in dem TGN, wie durch den TGN Marker Galactosyltransferase (GalT) abgegrenzt. Obwohl APP mit paGFP getaggt worden, um schnellen axonalen Transport von APP und Abstand von der perinukleären Region sichtbar zu machen, ist dies die erste Demonstration von APP Handel von einer sorgfältig definierten Fach zu einem anderen 11,31,32. Hier zeigen wir eine genaue Photoaktivierung im TGN und den Austritt von APP in nachgeschaltete Fächern und anschließende Spaltung und Clearance von Lysosomen 30. Die exakte Photoaktivierung im Golgi ist weit auf anderen Proteinsystemen.
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Protocol
1. Zell Plating und Transfektion
- In einer Zellkultur Kapuze, Platte ~ 300.000 bis ~ 500.000 SN56-Zellen (ein freundliches Geschenk von Dr. Jane Rylett) auf einer 35 mm Glasboden konfokalen Teller geben und mit vorge Transfektionsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, DMEM, ergänzt mit 10% FBS).
- Zellen beimpft und über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator zu vermehren.
Hinweis: Die Zellen sollten ca. 50% -70% konfluent vor der Transfektion werden. - In einem Zellkulturhaube, transfizierenden Zellen mit Plasmiden, ein fluoreszierendes Protein exprimieren, markiert TGN Markierung (Galactosyltransferase zu Cyan Fluorescent Protein gekoppelt ist, GalT-GFP), ein fluoreszierendes Protein markiert Fach Marker (hier Lysosom assoziiertes Membranprotein 1, LAMP1, getaggt mRFP) und das Protein von Interesse mit paGFP (& beta; APP-paGFP markiert). (Diese Konstrukte sind zuvor beschrieben worden, 30)
- Zellen mit Transfektionsreagenz und Plasmid-DNA f inkubierenoder 24 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Verwenden Sie ein Verhältnis von ~ 2 ug DNA zu 5 ul Transfektionsagens (zB Lipofectamin 2000), um ein optimales Gleichgewicht Zytotoxizität und Transfektionseffizienz. Tatsächlichen Konzentrationen eventuell auf unterschiedlichen Plasmiden optimiert werden. In den hier beschriebenen Experimenten verwenden 1 ug / konfokalen Gericht von & bgr; APP-paGFP, 0,3 ug / konfokalen Gericht aus LAMP1-mRFP und 0,2 ug / konfokalen Gericht aus GalT-GFP.
Anmerkung: Die Menge des verwendeten Plasmids wird auf die Transfektionseffizienz abhängen. - Für neuronale Zellinien: Nach dem Schritt 1.4, in einem Zellkulturhaube Entfernen vorge Transfektionsmedium und Differenzierung SN56-Zellen in 2 ml DMEM mit 0,1% Penicillin / Streptomycin, ergänzt mit 1 mM Dibutyryl-cyclisches AMP (dbcAMP) für 24 Std.
2. Mikroskop Bühne Vorbereitung
- Vorwärmen phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) bis 37 ° C. Warm-up vor dem Mikroskoptisch Imaging bis 37 ° C.
- Wash Zellen zweimal mit PBS, um die Differenzierung Medien entfernen und ersetzen Sie mit 2 ml HBSS bei 37 ° C. Ortszellen am Mikroskoptisch erwärmt auf 37 ° C.
Hinweis: Zellen lebensfähig für ca. 1,5 bis 2 h in HBSS sind. - Lassen Sie 5-10 Minuten für die konfokale Plattentemperatur mit dem Mikroskoptisch ins Gleichgewicht.
3. Foto-Aktivierung von ROIs über den Golgi
- Mit dem Mikroskop-Okular, finden Sie Zellen mit GalT-CFP, LAMP1-mRFP und & bgr; APP-paGFP transfiziert.
- Verwenden Sie eine Öl-Immersionslinse mit hoher Vergrößerung (dh 63X oder 100X). Zur optischen Konformation der Fluoreszenz, verwenden Sie einen Filter zu setzen in der Lage ist die Visualisierung FITC (für GFP und GFP-Fluoreszenz) und Rhodamin (für mRFP Fluoreszenz).
- Stellen Sie die konfokale Scheibe für jeden Kanal bis 1 um. Nehmen Sie ein Bild mit niedriger Auflösung.
- Crop für Bild nur die Zelle von Interesse.
- Verwenden Sie den Einstellknopf, manuell eingestelltdie Brennebene zu der Mitte der Zelle. Dies ist typischerweise der Teil der Zelle, wo der Kern der größte ist.
- Draw 3-5 kreisförmige Regionen of Interest (ROIs) innerhalb des TGN (GalT-GFP-Fluoreszenz).
- So zeichnen ROIs (dh in der Zeiss LSM-Programm), wählen Sie "Bearbeiten ROI 'Schaltfläche in der Befehlskonsole.
- Wählen Sie das kreisförmige ROI-Taste.
- Klicken und ziehen Sie über GalT-GFP positive Regionen der Zelle.
Hinweis: Die Photobleaching-Pakete für viele Mikroskope haben diese Fähigkeit.
- Nehmen Sie ein Bild von der Zelle mit dem überlagerten ROIs. Speichern Sie eine Kopie der ROIs zur späteren Referenz.
- Um die ROIs auf das Bild zu speichern, wählen Sie den "Makro" -Taste.
- Drücken Sie die Schaltfläche "Laden", um die "CopyRoisToOverlay" (Dateipfad: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb) starten.
Hinweis: ein konfokales Mikroskop mit 475 bis 525 nm (GFP) Bandpass (BP), eine 500 bis 530 nm BP (GFP) ausgestattet,und ein 560 nm langen Pass (LP) Filtersätze sind erforderlich. Ein Argon-Laser für 458 nm und 488 nm Emission und einem HeNe-Laser für 540 nm-Emission ist ebenfalls erforderlich.
- Set-up des Mikroskops für eine Bleichzeitverlauf.
- Stellen Sie die Laserdiode (25 mW 405 nm Laser), um maximale Leistung.
Vorsicht: Übermäßiger Photoaktivierung könnte zu produzieren Foto-Toxizität oder Schäden an Zellmembranen führen. Augenschutz benutzen, um Netzhautschäden zu vermeiden. - Set-up das Mikroskop für 120 Zyklen der Bildgebung.
Hinweis: eine Abbildungszyklus besteht aus Bleich innerhalb der ROIs und Bilderzeugung der gesamten Zelle. Dies ist ein Bleichzeitverlauf. - Stellen Sie das Mikroskop zu bleichen (Foto deaktivieren) nur die ROIs für 20-30 Iterationen nach jedem Bild. Die Zeit, um das Bild und Bleichmittel ein Bild variieren. Festlegen einer Zeitverzögerung zwischen den Bildern, so dass jeder Zyklus etwa 30 Sekunden.
Hinweis: Der Abbildungsteil jedes Zyklus dauert etwa 15-30 sec, je nach Größe des Bildes. Die Bleich für jedes ROI ist etwa 50 msec. Bleich aller 4 ROIs 20 Iterationen 4 Sekunden am Ende jedes Bleichmittel / Bildzyklus zu nehmen.
- Stellen Sie die Laserdiode (25 mW 405 nm Laser), um maximale Leistung.
- Starten Sie das Bleichzeitverlauf.
- Ausschalten des Bleich nach 15 min (30 Zyklen von Bildgebung und Bleichen), sondern weiterhin die Aufnahme von Bildern der Zelle.
Hinweis: Zeit 0 bis 15 min ist der "Puls" Periode. - Weitere Bilder aufzunehmen für 45 min (ohne Bleichen), um den Abstand von & bgr; APP-paGFP folgen.
Hinweis: Zeit 15 bis 45 Minuten ist die "Jagd" Periode. - Unter Verwendung der in Schritt 6 beschriebenen Analyseverfahren, Co-Lokalisation des Proteins von Interesse (hier ßAPP-paGFP) mit dem Fach von Interesse (hier LAMP1-mRFP), indem sie Flächen für jeden Kanal.
4. Bestimmen Sie die Downstream-Compartments
- Um festzustellen, ob Lysosomen (in diesen Experimenten) sind die letzte Kammer, fügen membranpermeablen Protease-Inhibitoren, um zu bewirken Proteine im Lysosom anreichern.
- Für ßAPP, verwenden Sie 0,5 um L685, 458 (spezifische γ-Sekretase-Hemmer) über Nacht oder 100 uM Chloroquin (entsäuert Lysosomen) 30 Minuten vor der Bildgebung.
- Finden Zellen und photoaktivieren, wie in Schritt 3,1 bis 3,8.
- Bild die Zelle für ein zusätzliches 45-min (ohne Photoaktivierung) zu bestimmen, wo & beta; APP-paGFP sammelt sich in Abwesenheit von Spaltung.
- Analysieren die Lieferung von Protein zu Lysosomen (oder andere stromab gelegene Abteil) und anschließender Abstand entsprechend dem in Schritt 6 beschriebenen Verfahren.
5. Stellen Sie sicher Genauigkeit der Photoaktivierung im Golgi
- Aufwärm HBSS auf 37 ° C.
- Bereiten eine 2 ml Lösung zu jedem konfokalen Platte abgebildet werden, von 66 & mgr; M Nocodazol (Behandlung) oder DMSO (Kontrolle) in HBSS.
- Zum einen konfokalen Platte, Pipette 2 ml 37 ° C HBSS und fügen 7,96 ul Nocodazol aus einem 16,60 mM Nocodazol Lager.
- Als Kontrolle solution, Pipette 2 ml 37 ° C HBSS in ein 2-ml-Tube und füge 7,96 ul DMSO.
- Zellen in HBSS mit Nocodazol oder DMSO Inkubation für 5 min vor der Bildgebung.
- Finden Zellen wie in Schritt 3.1.
- Vor der Photoaktivierung, bereiten Sie das Mikroskop, um eine Z-Stapel nach der Photoaktivierung Zeitraum.
- Klicken Sie auf das "Z-Stapel" Taste. Starten Sie das Scannen unter Verwendung der schnellen XY.
- Stellen Sie die Brennebene mit dem Mikroskop Einstellknopf an die Spitze der Zelle. Drücken Sie 'Mark First', um die erste Position in dem Stapel gesetzt.
- Einstellen der Brennebene der Mikroskop Einstellknopf am Boden (in der Nähe des Glases) der Zelle. Drücken Sie 'Mark Last', um die letzte Position im Stapel gesetzt.
- In der Stapeltafel Z, drücken Sie die "Z Schneiden 'button. Stellen Sie die "Intervall" bis 1 um.
Hinweis: Für eine höhere räumliche Auflösung Stapel einen kleineren Stack Intervall, aber mehr Bilder werden zu müssen,Verlängerung der Frist für die Bildgebung des Stapels genommen werden.
- Bleichen der Zellen, wie in Schritt 3,7-3,8 beschrieben. Foto-activate und Bild von 0 min bis 15 min (30 Bilder).
- Stoppen Bildgebung nach 30 Bildern. Ein Bild des Videos sofort zu speichern.
Achtung: Einige Mikroskope können erste Video zu überschreiben, wenn es nicht vor dem Start eines zweiten Bildsequenz gespeichert. - Nach dem Speichern des Videos sofort erwerben ein Z-Stack, mit den Parametern von Schritt 5.5.
- Kolokalisieren ßAPP-paGFP mit GalT-GFP (oder andere Golgi-Marker), wie in Schritt 6 beschrieben.
Hinweis: CFP Photobleichmittel schneller und möglicherweise nicht sichtbar durch das Ende des bildgebenden Zeitraum. Kolokalisation nicht möglich mit GalT-GFP sein. Wenn Kolokalisation benötigt wird, verwenden, um mRFP GalT taggen.
6. Vesicle Filtern und Kolokalisation
- Verwenden Sie ein Analyseprogramm (zB Imaris) auf Oberflächen von dem Fach (zB LAMP1-mRFP) und ein Protein o machenf Interesse (zB & bgr; APP-paGFP).
- Geben Sie im Abschnitt "Surpass" des Analyse-Programm, indem Sie auf die Schaltfläche Übertreffen auf der oberen Menüleiste.
- Wählen Sie die Fläche Assistenten Taste an der Oberseite des äußersten linken Panel (5. Taste von links).
- Wählen Sie einen Kanal, um Vesikel (dh & bgr; APP-paGFP Fluoreszenz Protein von Interesse) filtern.
- Führen Hintergrundsubtraktion durch Vorlage des Durchmessers der größten Vesikel in das Feld mit dem Assistenten ein und klicken Sie auf Weiter. Das Analyseprogramm wählt automatisch - basierend auf einem Schwellenwert von der größten Vesikel im Bereich abgeleitet - ein Bereich, in dem interessierenden Kanal.
- Manuelle Einstellung der Schwelle Hintergrund, um die Auswahl zu verfeinern, wenn nötig.
- An der Unterseite des Threshold-Auswahlbildschirm, überprüfen Option 'Split berührende Objekte', um den kombinierten Oberflächen zu trennen.
Hinweis: Wenn viele Vesikel sind eng gruppiertzusammen, die Analyse-Programm-Gruppe diese Objekte unter einer Oberfläche.- Wählen 10-15 repräsentativen Vesikel und die Berechnung der durchschnittliche Vesikeldurchmesser und geben Sie das Ergebnis in den Assistenten.
- Verfeinern Sie die ausgewählten Saatpunkte durch Erhöhen oder Verringern der Schwelle auf "Qualität" (Intensität des Kanals in der Mitte jeder Ort).
Hinweis: Die Oberflächen des Kanals von Interesse erzeugt. Eine weitere Verfeinerung der ausgewählten Flächen kann an dieser Stelle durchgeführt werden. Schwelle Vesikel auf Basis der Anzahl der Pixel in jedem Vesikel. - Maske der ursprünglichen Kanal mit dieser Oberfläche. Zu maskieren, wählen Sie die Registerkarte 4. von links in der Oberflächenerstellungsassistenten (Bleistift).
- Wählen Sie 'Mask All'. Ein neuer Kanal mit den Vesikeln von Interesse erzeugt.
Hinweis: Während des Maskenprozess, ist eine Option, um den ursprünglichen Kanal zu duplizieren angeboten. Wählen Sie diese Option, wenn die Originaldaten gespeichert werden muss. - Wiederholungen sTEPs 6.1 bis 6.7 für das ungefilterte Kanal (dh LAMP1 mRFP, Fach).
- An der oberen Werkzeugleiste, wählen Sie die Kolokalisation Werkzeug.
- In der oberen Platte, wie die Histogramme der Kanäle zu kolokalisiert zu sein scheinen, wählen Sie die zuletzt erstellten maskierten Kanäle.
- Wählen Sie alle verfügbaren Daten. Es gibt dunkle Pixel, die manchmal nach der Analyse vorhanden sind. Diese Pixel im Histogramm Wählen Sie nicht, werden sie die Ergebnisse verfälschen.
- In der rechten Panel, wählen Sie "Build Coloc Kanal '. Dadurch wird ein neuer Kanal, der nur die colokalisiert Pixel. Die Daten werden in der gleichen Blende unter der "Channel Statistiken" Knopf sein. Die Daten können als CSV-Datei exportiert werden.
- Verwenden Sie die "Percent of Material kolokalisiert" Statistik. Diese Option berücksichtigt die Intensität der Pixel und die Größe des Objekts.
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Representative Results
Typische Ergebnisse zeigen ßAPP Verlassen des TGN und scheint Verkehr schnell auf LAMP1 (Abbildung 1a und b). Während der Photoaktivierung Zeit können Vesikel gesehen Verlassen der Golgi für Lysosomen (Abbildung 1b) bestimmt werden. Ohne Inhibitor Behandlung wird paGFP Fluoreszenz in Lysosomen sichtbar sein, während es Photoaktivierung im TGN. Nach dem Anhalten der Photoaktivierung wird der & bgr; APP-paGFP schnell aus dem Lysosom gelöscht (vergleiche Abbildung 1a bis 1b). Behandlung mit Nocodazol führt zur Akkumulation von APP in der GalT-CFP markiert Kammern und verhindert Handel Lysosomen (Figur 1c).
Die schwedische Mutation von APP (APPsw) erhöht die Geschwindigkeit der β-Spaltung durch 10-fache 34. Mit schnellen Spaltung βAPPsw-paGFP, erscheint das paGFP Fluoreszenz als diffuses Fluoreszenzsignal im Cytosol. Vermutlich is das Ergebnis des schnellen ßAPP Spaltung durch γ-Sekretase-Freisetzung der C-terminalen paGFP in das Zytoplasma (Abbildung 2). In Gegenwart von γ-Sekretase-Inhibitor, & beta; APP akkumuliert in Lysosomen.
Nach Lieferung der ßAPP zum Lysosom wird das paGFP Fluoreszenz schnell gelöscht. Die kurze Verweilzeit könnte das Ergebnis von Menschenhandel aus dem Lysosom zu einem anderen Fach zu sein. Umgekehrt wäre die Spaltung von & beta; APP-γ-Sekretase zu erwarten, um die Diffusion paGFP Fluoreszenz von lysosomalen Membran (3a) führt. Die diffuse Fluoreszenz ist schwieriger, durch konfokale Mikroskopie zu detektieren. Um festzustellen, ob ßAPP ist mit einem anderen Fach geliefert oder gelöscht wurden SN56-Zellen mit einem spezifischen Inhibitor gegen γ-Sekretase (L685, 458) oder ein Alkalisierungsmittel (Chloroquin) behandelt. Die Zugabe von entweder L685, 458 oder Chloroquin Folge APP Anreicherung in den Lysosomen (
Es ist allgemein anerkannt, dass APP an die Zelloberfläche vor der Endozytose angeliefert und in den Endosomen und Lysosomen 35 verarbeitet. Jedoch im unbehandelten Zellen, Zelloberflächen ßAPP konnte nicht durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden. Photoaktivierten ßAPP kann nicht in einem bestimmten Bereich der Plasmamembran konzentriert werden. Stattdessen kann es eine diffuse Fluoreszenz auf der großen Oberfläche der Plasmamembran ist. Interessanterweise führt γ-Sekretase-Hemmer, um & beta; APP-paGFP an der Zelloberfläche nachweisbar (Abbildung 3b). γ-Sekretase-Hemmer Behandlung kann Route mehr ßAPP an die Zelloberfläche, zusätzlich zur Hemmung der Enzymfunktion. Daher breitet sich die große Oberfläche der Plasmamembran paGFP über einen größeren Bereich und stellt Detektion schwierig, auch wenn das Protein in die Kammer verschleppt.
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Abbildung 1. Abbilden der Menschenhandel von APP zu den Lysosomen. SN56-Zellen wurden mit LAMP1-mRFP, GalT-CFP und & bgr; APP-paGFP transfiziert. A) Die Zelle war innerhalb von ROIs genau photoaktivierten über den Golgi (ROIs durch weiße Kreise bezeichnet platziert ). Die Zelle war alternativ photo aktiviert und für 15 min auf & beta; APP-abgebildeten paGFP Handels bestimmen. Einschub zeigt Handel in den perinukleären Bereich vom Golgi zum Lysosomen. Co-lokalisiert Pixel erscheinen gelb b) des Handels mit einem Vesikel enthalten ßAPP-paGFP zum Lysosom.. Yellow Pixel bezeichnen LAMP1 und & bgr; APP-paGFP Kolokalisation. C) SN56-Zellen wurden mit Nocodazol vor Bildgebung beta; APP-paGFP Austritt aus dem TGN zu verhindern behandelt. Ein repräsentatives Bild aus dem Ende des Photoaktivierungsperiode gemacht. In der rechten Seite, ein Z-Stapel von der gleichen Zelle unmittelbar nach der Photoaktivierung übernommen. Th e GalT-CFP falsche rot gefärbt gewesen, Visualisierung colokalisiert GalT-CFP und & bgr; APP-paGFP verbessern. Yellow Pixel bezeichnen Kolokalisation zwischen GalT-CFP und & bgr; APP-paGFP. Skala Balken stellen 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Handel βAPPsw-paGFP. SN56-Zellen wurden mit LAMP1-mRFP, GalT-GFP und βAPPsw-paGFP (ßAPP mit der familial schwedische Mutation) transfiziert. Die schwedische Mutation erhöht die Rate, die APP gespalten. Zellen wurden alternativ innerhalb des Golgi photoaktivierten und abgebildet. Eine diffuse Fluoreszenz ist zu erkennen, nachdem paGFP vom lysosomalen Membran abgenommen, um in das Cytoplasma zu diffundieren. Maßstabsleiste stellt 5 um.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Ermittlung der Terminalorganelle. SN56-Zellen wurden mit LAMP1-mRFP, GalT-CFP und & bgr; APP-paGFP transfiziert. Nach Photoaktivierung wurden die Zellen für weitere 45 min gefolgt. Die zwei am weitesten links stehenden Tafeln zeigen die Zellen vor der Photoaktivierung (am weitesten links) und 15 Minuten nach der Photoaktivierung (mittel). Das Panel auf der rechten Seite zeigt APP Fluoreszenz nach 45 Minuten der gesamten Imaging-in) behandelt wird, b) γ-Sekretase-Hemmer behandelt wurden, oder c) Chloroquin behandelt. Pfeilspitzen zeigen auf APP co-lokalisiert mit LAMP1 nach 45 min der Bildgebung. Skala Balken stellen 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thist Figur.
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Discussion
Diese Technik beschreibt die genaue Photoaktivierung von Membranproteinen mit paGFP getaggt im TGN, um nachfolgende Handel und Spaltung zu visualisieren. Während paGFP wurde vor über einem Jahrzehnt 25 erstellt, ist dies das erste Beispiel für eine genaue Photoaktivierung zur Verhinderung des Handels mit freiwerdenden Proteine an nachgeschaltete Kammern folgen. Frühere Studien mit APP-paGFP Konstrukte photoaktivierten eine peri-Kernbereich der Zelle, die als auf der Golgi 11 sein. Jedoch, wie deutlich in unserer Mikrographien, Lysosomen, Endosomen frühen und späten Endosomen kann auch in diesem Bereich (Figur 1 und Referenz 30) gefunden werden. Diese Experimente wurden erfolgreich in HEK293 Zellen, COS-7-Zellen, neuronale Zellen, SN56, SH-SY5Y-Zellen und Maus-Neuronen führen, obwohl die Transfektionseffizienz von Maus-Neuronen ist gering. Ähnliche Experimente wurden durchgeführt, mit voller Länge APP Konstrukte und verkürzten Konstrukte, die die letzten 112 Aminosäuren umfassenSäuren von APP, die β- und γ-Spaltstellen, um paGFP fusioniert. Die verkürzten Konstrukte sind leichter zu transfizieren und ein höheres Fluoreszenzsignal, und diese sind in den beiliegenden Figuren gezeigt. Unsere verkürzten Konstrukte fehlt auch die N-terminale Ektodomäne, die undefined Spaltungen und Sortiersignale 38 hat. Trotz dieser N-terminalen Signale und Spaltungen, so finden wir, dass unsere verkürzten Konstrukt hat ähnliche Lokalisation und Menschenhandel als eine full-length APP-paGFP 30, 33.
Wegen der vielen Organellen in der peri-Kernbereich der Zelle wurde kein Aufwand gescheut, um die Genauigkeit der Photoaktivierung zu gewährleisten. Während der bildgebenden Zeitraums, wird die Zelle und der Golgi zu bewegen. Daher müssen die Photoaktivierung ROIs sorgfältig während der Photoaktivierungsperiode überwacht und eingestellt, um auf der Oberseite der Golgi verbleiben. Konfokale Mikroskope sind empfindlich gegenüber kleinen Temperaturveränderungen. Zum Beispiel, AC oder Heizungsdüsen über den microscope könnte zu einer Änderung der Bildebene führen.
Um die Kohärenz zwischen den Experimenten zu halten, setzen wir eine Zeitverzögerung zwischen jedem Photoaktivierung / Abbildungszyklus. Die Zeit wird benötigt, um die ROIs und Bild bleichen die Zelle. Abhängig von der Größe der Zelle und die Anzahl von ROIs, die Zeit zu bleichen und nehmen ein Bild variieren. Um die Konsistenz von Bild zu Bild zu erhalten, setzen Sie eine Zeitverzögerung zwischen den Bildern so jedes Bild, einschließlich Bleichen, erfordert etwa 30 Sekunden. Erhöhte zeitliche Auflösung kann durch Verwendung Detektionssysteme, die eine Strahlformer (zB LSM5 Live-Detektor) beschäftigen erreicht werden. Diese Mikroskope können ein Image mit 120 Bildern / Sekunde ohne Verlust an Auflösung.
Um die Genauigkeit der Photoaktivierung zu bestätigen, ist es unerlässlich, eine Nocodazol Steuerung durchzuführen. Durch die Blockade Transport aus dem Golgi während der Photoaktivierung sichergestellt, dass paGFP wird nicht deutlich in den anderen Fächern aktiviert.CFP Photobleichmittel schnell mit wiederholter Bildgebung und Bleichen und kann Kolokalisation mit GalT-CFP erschweren. Wenn der Großteil paGFP Fluoreszenz bleibt im Golgi-Bereich, kann dies auch an, präzise Photoaktivierung. Alternativ können GalT mit mRFP, die photostabil mehr als GFP in diesen Experimenten ist markiert.
Verbesserte Aktivierung im Golgi kann auch mit einem Multi-Photonen-Mikroskop erreicht werden. Während die konfokale Abbildungsebene in diesen Experimenten ist typischerweise eine 1 & mgr; m in Scheiben schneiden, der Laser zur Bildgebung und Photoaktivierung wird durch die gesamte Zelle zu führen. Für diese Experimente konnte ein Multi-Photonen-Laser verwendet werden, und kann die Genauigkeit in allen drei Dimensionen 35 zu verbessern. Wie hier gezeigt, ist jedoch eine herkömmliche 405-nm-Laserdiode ausreichend genau Photo aktivieren ßAPP-paGFP im TGN.
Als Kontrolle haben wir ähnliche Experimente für VSVG-paGFP Fluoreszenz durchgeführt. VSVG-paGFP, das istkonstitutiv an die Zelloberfläche 27,37 geliefert wurde visualisiert an bestimmte Teilbereiche der Plasmamembran 30 geliefert. Dies stellt sicher, dass der Verkehr zu intrazellulären Kompartimenten wird nicht ausgelöst durch Überexpression oder der Anwesenheit des paGFP Tag.
Diffuse paGFP Fluoreszenz kann schwierig, durch konfokale Mikroskopie zu lokalisieren. Nach unserer Erfahrung ist APP schnell gespalten und scheint eine kurze Lebensdauer als ein Protein voller Länge an der lysosomalen Membran. Dieses Problem wird von der schwedischen FAD-Mutation, die die Geschwindigkeit der APP-Spaltung beschleunigt 34 verstärkt. Die Technik für die rasch gespalten Proteine zu verwenden, ist ein Inhibitor von entscheidender Bedeutung, um die endgültige auslassseitige Kammer bestimmen. Die Hemmung der γ-Sekretase von L685, 458 oder Chloroquin führen zu signifikanten Akkumulation von APP in den Lysosomen; auch mit der schwedischen Mutation.
Wenn zu viel Inhibitor verwendet wird, könnte dies zu intrazellulären ac führenKumulierung von & bgr; APP-paGFP und kann die Proteineinschlüsse führen. Kumulierte paGFP in Einschlüssen führt zu Fluoreszenz paGFP Einschlüsse in der Zelle, bevor das Experiment begonnen hat (unsere unveröffentlichte Beobachtungen, dh über Nacht die Behandlung mit 40 & mgr; M Chloroquin). Inhibitor-Konzentration, die Spaltung des Proteins von Interesse verhindert, aber nicht zur Aufnahme Bildung führen sollte verwendet werden. Über Transfektion von Zellen mit paGFP kann auch dazu führen offensichtlichen Einschlüsse von paGFP, die ohne Photoaktivierung fluoresziert. Neu photoaktivierten paGFP wird vorzugsweise Besucher auf dieser Einschlüsse und stören die Interpretation der Ergebnisse. Bei der Suche nach Zellen, die dem Bild, zu vermeiden Zellen mit der Hand paGFP Einschlüsse. Nach unserer Erfahrung mit & bgr; APP-paGFP, gibt es eine sehr schwache grüne Fluoreszenz in Zellen, die & bgr; APP-paGFP Ausdruck auf der entsprechenden Ebene. Diese schwache Fluoreszenz typischerweise nicht abgebildet werden und kann nur durch das Okular gesehen werden.
(dh Plasmamembran) befahrenen möglicherweise schwer zu erkennen. Dies kann sein, weil das Fluoreszenzsignal, wobei über eine große Fläche verteilt, verdünnt wird oder weil das Membranprofil im Querschnitt unterhalb der Auflösung des konfokalen Mikroskops. Es kann möglich sein, dieses Problem durch Imaging mit dem Epifluoreszenzmikroskop umgehen. Dies wird jedoch deutlich reduzieren die räumliche Auflösung der Technik.
Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Anwendbarkeit auf andere Membranproteine. Während diese Technik hängt über Expression mehrerer Proteine scheint es, daß den Proteintransport ist nicht offensichtlich gestört ist, wie dies bei VSVG-paGFP und & beta; APP-paGFP 30 gezeigt. Zusätzlich zu den Lysosomen wurden andere Marker der endosomalen / lysosomalen System auch erfolgreich verwendet. Dazu gehören Rab5-mRFP für die frühe EndeOsome und rab9-mchFP (Kirsche fluoreszierendes Protein) für die späte Endosomen. Diese leistungsstarke Mikroskopietechnik kann erweitert werden, um den Handel mit anderen Proteinen aus der TGN zu folgen. Es könnte ebenso angewendet werden, um Menschenhandel zwischen diskreten Kammern vorgesehen wohldefinierten Fach Marker zur Verfügung zu folgen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
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