מדידת TCR-pMHC כריכה Published: October 30, 2015 doi: 10.3791/53157

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Markus Axmann¹, Gerhard J. Schütz¹, Johannes B. Huppa²

¹Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, ²Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

Introduction

הבנה בסיסית יותר של איך תאי T מזהים אנטיגנים דורשת מחפשת במקום הנכון, כלומר, בתוך הסינפסה החיסונית נוצרה בין תאי T וAPC. כאן, קינטיקה מחייבת המולקולרית אינן נקבעת רק על ידי המאפיינים ביוכימיים הטבועים של שותפי האינטראקציה מעורבים אך תלויה במידה רבה בפרמטרים סלולריים, הכוללים כוחות סלולריים, ארכיטקטורת קרום ואינטראקציות בין חלבוני קרום לרוחב, כמו גם אילוצים גיאומטריים סינפסה הספציפית ^3. גישות ביוכימיות מוגבלות בפתרון הכח כפי שהם מחייבים את השיבוש של לפחות אחד מהקרומים הסינפטי המעורבים. מסיבה זו מתודולוגיה הדמיה מבוססת סריג פותחה כדי לפקח מחייב של TCR לpMHCs אנטיגני ^2. הנה תאי T מעוצבים עם רקומביננטי ואתר-במיוחד שכותרת בר נוגדני שרשרת אחת TCRβ-reactive (SCF _V) והתעמתו עם תכנית bilayers AR-נתמך זכוכית שומנים (SLBs), שנמל מולקולות MHC בכיתה השני עמוסות פפטיד אנטיגני שכותרתו fluorescently, מולקולות costimulatory וחלבוני הדבקה. Synaptic מחייב בין תוצאות TCR ולצבוע כותרת שכותרתו צבע pMHC בסריג, אשר יכול להיות במעקב בתפזורת ורמת מולקולה בודדת על ידי הקרינה השתקפות הפנימית סה"כ מיקרוסקופיה (TIRF).

במאמר זה מוסבר בפירוט כיצד לנצל SLBs למנסה לאמוד סינפסות T-cell, לוודא תקינותם באמצעות assay סידן שטף T-cell פונקציונלי, התנהגות סריג מדידות בכמויות גדולה וברגישות מולקולה בודדת, ולנתח את הנתונים שנרכשו. המלצות מוצעות לייצור חלבונים תאמו כראוי נדרשים לfunctionalization bilayer. לקבלת מידע ספציפי יותר לגבי היווצרות bilayer והתקנה של מיקרוסקופ TIRF מתאים אנא פנה לפרסום יופיטר נוסף גישה ציבורית שפורסם גב אל גב ^4.

אוהל "> טבע של SLBs

SLBs Functionalizable יכול להיות שנוצר בקלות משלפוחית ​​unilamellar (רכבי שטח) המכילה שני שומנים-2-oleoyl-SN-gylcero-3-phosphocholine 1-palmitoyl (קצר: POPC, 90-99%) וSN 1,2-dioleoyl- - glycero-3 - {[N (5-אמינו-1-carboxypentyl) iminodiacetic חומצה] succinyl} (קצר: DGS נת"ע-ניקל, 1-10%). רכבי שטח התפשטו על שקופיות זכוכית נקיות כדי ליצור bilayer מישוריים רציף ^4. DGS-נת"ע-ניקל משמש לעגן חלבונים מתויג polyhistidine באמצעות מורכבת היווצרות תיווך polyhistidine עם קבוצת הראש (איור 1 א) נת"ע-Ni-המכיל הסינתטי. לעמותה יציבה אחד בדרך כלל מחליף את תחום הילידים הטרנסממברני וזנב cytoplasmic של חלבון ההידבקות ICAM-1 ומולקולת costimulatory B7-1 עם תג אחד המכיל עשר histidines (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (איור 1) . ^K IE השני המולקולה ברמה טעונה פפטיד מכיל שתי שרשרת פוליפפטיד-מוטבע קרום (α β ו)ים. הטרנסממברני / תחומים cytoplasmic של שני הרשתות צריכים להיות מוחלפים עם תג המכיל שש histidines כל ^(k α β _6H -2x6H ^k _6H או IE IE). כחלופה, הארכת α-השרשרת עם עשר histidines ועוזב תחום תאי של β-השרשרת לא מתויג (והוליד ^k IE α β _{0h 12H} או -12H ^k IE) מוליד תוצאות משביעות רצון (איור 1).

תיוג ספציפי לאתר של pMHCs

חשוב לתייג pMHC stoichiometrically ואתר ספציפי כדי להיות מסוגל להמיר תשואות נמדדו סריג לקבועי שיווי משקל מחייב משמעותיים. זו יכולה להיות מושגת על ידי תיוג כימי של פפטיד סינטטי שהוא נטען לתוך שסוע מחייב פפטיד של מתויג היסטידין כיתת MHC רקומביננטי השני מולקולות ^2,5. פפטיד כולל את כל השאריות של epitope תא T כמו Well כמקשר C-מסוף קצר (GGS) ואחריו ציסטאין (למשל בפפטיד ציטוכרום העש ג '(MCC) ANERADLIAYLKQATK- GGSC, מקשר מסומן באותיות מודגשות). ציסטאין זה משמש לתווית פפטיד stoichiometrically עם השימוש בנגזרי maleimide-צבע. בשלב זה טיפול נוסף צריך להיות מוקדש לאימות צבע צימוד כמותיים לפפטיד המכיל ציסטאין. HPLC-טיהור adduct פפטיד-הצבע מומלץ ולהיות מלווה ספקטרוסקופיה מסת יינון electrospray. כל המונים נרשמו מקבילים לeduct פפטיד (ללא צבע) משקפים תיוג שלם. אם זה נכון, פפטיד-מטוהר HPLC צריך להיות נתון לסיבובים רצופים של צבע תיוג עד התיוג נחשב כמותי. שים לב שיש להימנע ספקטרוסקופיה MALDI-TOF המוני כשיטת זו כרוכה קרינת לייזר ליינון מדגם. טיפול זה מתפרק fluorophores רגישה המצורפת לפני המוני פפטיד הוא לקרוא את וכך underrepre מעלות sents של צבע-נטיה.

תיוג עקיף עדיין אתר ספציפי של TCRs מאוגד תא עם השימוש שבברי F _V שרשרת אחת חד ערכי

זה עדיין מאתגר לצרף צבעים לתא החלבונים של תאי חיים הקשורים משטח באופן ספציפי לאתר. כדי להתגבר על מכשול זה לTCRs משטח חשוף, גרסת שרשרת אחת חד ערכי (SCF _V) מהגנים של הנוגדנים חד שבטיים -reactive TCRβ H57-197 ² נבנתה. המבנה הגבישי של נוגדן זה במורכב עם TCR מאפשר לעצב גרסה, שבו שאריות סרין בסמיכות לC-הסופית של פפטיד MHC הקשורים (בי צבע השותף המתאים סריג מצורף) מוחלפת לרציונאליות שאריות ציסטאין. ציסטאין מוטציה אז זה משמש כacceptor לנטיית צבע (איור 2).

מתודולוגיות להקליט סריג

NT "> ערכי סריג גורף הם מתאימים ביותר כדי לאמת את הקשר בין מרחקים בין-צבע שבחר וסריג יעילות נמדדת בTCR-pMHC זו מחייבת מערכת ^2. בנוסף, מדידות סריג תפזורת לחשוף הבדלים איכותיים וכמותיים בזיקות TCR-pMHC הסינפטי ( ראה להלן וסעיף 3.2 פרוטוקול). גישות שונות לכימות יעילות סריג הוכנס בספרות ^6. בסריג מאמר זה נרשם באמצעות

(א) התאוששות תורם לאחר הלבנת acceptor, ובאמצעות

(ב) רגיש פליטת acceptor סריג.

השיטה הראשונה (א) דורשת שימוש בacceptor סריג שניתן photobleached בקלות, ותורם, שהוא לא photostable. בנוסף חשוב להבטיח שacceptor photobleached הוא כבר לא מסוגל מרווה הקרינה התורם. כאותו ערוץ זיהוי (תורם) משמש לכימות, אין תיקון גורמיםד אין סטיות כרומטי צריכים להיחשב, אשר הופכת פשוט מתודולוגיה זו ואמינה. עם זאת, לא ניתן לחזור מדידות כמותיות על אותה נקודת הדגימה ושינויים בסריג לא ניתן נרשמו לאורך זמן. כדי למנוע תופעות שנגרמו על ידי דיפוזיה מולקולרית או תנועתיות סלולריות צעד הלבנה מהיר צריך להיות מכוון ל, שמצמצם את הזמן שעובר בין התורם הראשון סריג (לפני הלבנת acceptor) והרכישה השנייה תורם סריג התמונה (לאחר הלבנת acceptor סריג). הוא ממליץ להעסיק מקור אור הלייזר רב עוצמה של סריג acceptor עירור הגל כדי למזער פעמים תאורה והלבנה.

לעומת זאת, בגישה של מדידת פליטת סריג רגיש (ב) תורם סריג הוא נרגש והפליטה של ​​acceptor סריג נצפתה בערוץ acceptor סריג. שינויים באות acceptor סריג ניתן להקליט במשך זמן, אבל פליטה של ​​תורם סריג לערוץ acceptor אדום העביר (termed bleedthrough) וסריג עירור צולב acceptor באמצעות עירור תורם צריכים להיקבע באופן מדויק ונוכו מערוץ acceptor סריג נרשם. לזה תמונות acceptor המקבילות תורם סריג וסריג צריכים להיות מיושרות מרחבית.

זיהוי של מולקולה בודדת (ס"מ) סריג אירועים

עם השימוש בלייזר כמקור עירור, מצלמה רגישה ומיקרוסקופיה TIRF-נחלש רעש הקרינה של fluorophores בודדת ניתן לייחס בקלות לאורך זמן. דומה נכון לאיתור אירועי smFRET מולקולאריים. עם זאת, סיבוכים עלולים להיגרם על ידי bleedthrough תורם סריג ועירור צולב של acceptor סריג, וטיפול ובכך גדול יש לקחת בעת כוונון צפיפויות fluorophore בניסוי smFRET.

בפרוטוקול המפורט להלן (סעיף פרוטוקול 4) TCR נבחר כתורם סריג בשפע גבוה וpMHC כacceptor סריג בשפע נמוך. כדי להחליש FR תורם ET bleedthrough מספיק, לקשט 10-30% מTCRs עם _V SCF ניאון ו90-70% מTCRs עם _V SCF לא פלורסנט. הנה ערוץ acceptor סריג נבחר כערוץ מולקולה בודד כי זה confocal עם המולקולה בודדת סריג ערוץ. זה עוזר ליישר אירועי smFRET עם מולקולה בודדת סריג acceptors, אשר מהווה את הבסיס של אימות smFRET.

חילוץ הסינפטי מחוץ לשיעורים דרך מדידות smFRET

Photobleaching של שני סריג תורם וסריג יש acceptor יטופל כאשר חילוץ מחצית החיים של אינטראקציות ממולקולה בודדת סריג עקבות. מספר סריג-אותות נצפים בתחילת ההופעה שלהם כזוג acceptor התורם יחיד N (0) מצטמצם לאורך זמן על ידי שני לא מחייב של photobleaching המורכב והקולט-ליגנד. מספר שרד מתחמים בזמן נתון N (t) יכול לבוא לידי ביטוי מתמטי כדלקמן:

s = "jove_content">

בExp טווח photobleaching (-t / τ _{אקונומיקה)} לא הזמן מתואר על ידי המוצר של מספר תצפיות n וזמן t התאורה _החולה בגלל מצב התצפית שאינה רציף, הבדיד (כלומר, הלבנת מתרחש רק בתאורה ). בתוך exp- הטווח הקינטית (t / τ _כבוי) הזמן t הוא התוצר של מספר תצפיות n _{והפיגור} לא הזמן להתבוננות סריג יחיד (כלומר, לא מחייבים הקינטית קורה ברציפות). משוואת 1 יכול לבוא לידי ביטוי כ:

_{אקונומיקה} / τ τ הטווח des _החולהcribes מספר התצפיות עד הלבנה מתרחשת ומוגדרת כערך הציפייה <n _{להלבין>} של הפונקציה מעריכית שלה. משוואה 2 ניתן לפשט באופן הבא:

ערך הציפייה <n _(פיגור t)> של מספר מסגרות N (t) עם סריג-אירועים נצפים לאחר הזמן t נקבע ישירות מהניסוי. זה תלוי בזמן settable בין התצפיות _(פיגור t) נבחרו בניסוי והערכים לא ידועים לτ _את (ההופכי של מחוץ לשיעור k _כבוי) ו< n _{להלבין>,} ערך הציפייה של מספר התצפיות לפני ההלבנה מתרחשת .

לפיכך, חישוב ערך הציפייה <n _(פיגור t)> לפחות שני ערכים של t <n _{להלבין>} וτ _את.

חילוץ ערכי 2D-K _D הסינפטי באמצעות מדידות מבוססות סריג

מדידת TCR התפוסה, כלומר, היחס בין TCRs הכפות וTCRs הכולל, הוא מרכזי לקביעת ערכי 2D-K _D הסינפטי. על פי משוואה 4 מונח זה הוא ביחס ישר לנמדד סריג להניב עוד TCRs משמש כתורמי סריג וpMHCs כסריג acceptors.

עם התפוסה = TCR, C = גורם המרה

C הוא קבוע, אשר תלוי במערכת סריג וfluorophores בשימוש. זה יכול להיקבע באופן ניסיוני, כפי שמוצג להלן. ניתן להמיר את 2D-K _D על פי משוואה 5 כאשרצפיפות ראשונית של ligands TCR לפני תוספת של תאי T לbilayer ידועה. סיבה לכך הוא הניידות הגבוהה של חלבונים מצורפים-SLB וגם בגלל SLBs לספק מאגר כמעט בלתי נדלה של ligands ^2.

עם _{[ראשוני} pMHC] = צפיפות ראשונית של pMHC לפני התוספת של תאי T

עם משוואות 4 ו -5 אחד יכולים עכשיו בקלות לקבוע את הסינפטי 2D-K _D בין TCR וpMHC. הדבר נעשה באופן מהימן ביותר עם מדידות סריג המבוסס על התאוששות תורם לאחר הלבנת acceptor (ראה סעיף 3.1 פרוטוקול).

עם זאת, כדי למדוד את הקשר בין C עוצמת סריג אני _סריג (תוקן לרקע, bleedthrough תורם סריג וסריג acceptor עירור צולב) ותפוסת TCR יש שייקבעו. לשם כך,צריך לדעת את R היחס בין עוצמת הקרינה הממוצעת של fluorophores אחת קשור-TCR סריג תורם (למשל Cy3 או AF555) SM אני _{סריג תורם} והעוצמה הממוצעת של מולקולה בודדת סריג אירועי SM אני _סריג. R תלוי במערכת סריג בשאלה, מסנני פליטה ומצלמה המשמשת לגילוי הקרינה.

TCR תפוסה אז ניתן לקבוע ישירות על פי משוואה 6.

עם R = SM אני _{סריג תורם} / מ"ר אני _סריג

R נקבע כ1.45 למערכת H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 מוביל ל:

= תפזורת אני _סריג / אני _TCR-Cy3 תפזורת • 1.45

מערכת היחסים בין תפוסת TCR ותשואת סריג יכולים להיקבע על ידי תורם סריג להתאוששy לאחר הלבנת acceptor. לשם כך שני הפרמטרים הם זממו נגד אחד אחר למספר microclusters TCR כפי שמוצגים באיור 4 א מדרון .the של הכושר ליניארי מציין C מקדם המרה (ממשוואה 4).

כפי שמודגם באיור 4 א, ​​ג מסתכם ל() _V H57 SCF - Cy3 מערכת סריג pMHC-Cy5 / ו (ב) לתצורת מערכת מיקרוסקופ להחיל 1.995. TCR תפוסה ניתן להסיק בקלות כדלקמן:

תפוסת TCR = סריג להניב • 1.995

Protocol

הפקת 1. חלבון

1.1. חלבוני bilayer-התושב: B7-1, ICAM-1, pMHC (למשל, ^K / פפטיד IE)

1. -12H B7-1, ICAM-1-12H
   1. B7-1-12H Express ובונה ICAM-1-12H בכמויות גבוהות כמו חלבונים מופרשים מקומיים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus.
   2. לטהר חלבונים מsupernatants התרבות באמצעות כרומטוגרפיה זיקת Ni-נת"ע, ואחריו כרומטוגרפיה אניוני MonoQ וכרומטוגרפיה הדרת גודל S200.
   3. תווית aliquot אחד של החלבון המטוהר עם צבעים האמינים-reactive כגון הכנות succinimidyl-אסתר NHS של אלקסה פלואוריד 488 (או FITC), אלקסה פלואוריד 555 (או Cy3), אלקסה פלואוריד 647 (או Cy5).
   4. לאחר כרומטוגרפיה הדרת גודל S200 לקבוע את מידת התיוג של חלבוני monomeric על פי המפרט של הצבע-היצרן על ידי השוואת קליטת החלבון ב 280 ננומטר וקליטת הצבע ב 488 ננומטר (אלקסה פלואוריד 488, FITC), 555 או 552 ננומטר(אלקסה פלואוריד 555 או Cy3) או 647 ננומטר (אלקסה פלואוריד 647 או Cy5).
      הערה: יחס זה יהיה צורך מאוחר יותר כדי לקבוע את צפיפות החלבון על SLB מאותות הקרינה התפזורת של החלבון שכותרתו הצבע.
   5. אחסן את החלבונים ללא תווית ושכותרתו fluorophore ב -20 ° C בPBS בתוספת 50% גליצרול.
2. pMHC (כאן: -2x6H ^k IE או -12H ^k IE)
   1. לקפל כיתת MHC II מגופי הכללת ביטוי בE.coli בנוכחות תחליף הרבה יותר זול UV-cleavable פפטיד, שמאוחר יותר ניתן להחליף כמותית עם פפטיד fluorophore מצומדות של בחירה ^{5, 7.}
   2. לטהר מתחמי pMHC קפלו על ידי טכניקות סטנדרטית (כרומטוגרפיה Ni-נת"ע-זיקה, כרומטוגרפיה אניון מטבע MonoQ, סינון ג'ל S200).
   3. להחליף את הפפטיד cleavable UV עם פפטיד ^{5 הניאון, 7.}
   4. לטהר ניאון monomeric pMHC קומפלקסי Finally על ידי סינון ג'ל S200. Chromatogram נציג מוצג באיור 3.
   5. ודא טעינת פפטיד כמותית על ידי spectrophotometry.
   6. חלבוני חנות ב -20 ° C בגליצרול / 50% PBS.

1.2. דור של שברי שרשרת אחת נוגדן (ים _V SCF), הקדמה של cysteines לתיוג ספציפי לאתר

1. לקפל SCF _V של מגופי הכללת ביטוי בE.coli. הנה פרוטוקול שהומצא על ידי Tsumoto ועמיתים ⁸ אחרי שבגופי ההכללה פרשו ראשון ב 6 M כלוריד guanidinium, הופחתו במלואו ולאחר מכן קפלו במהלך שבוע על ידי בהדרגה הפחתת הריכוז של כלוריד guanidinium התגלגלות-חלבון.
2. להתרכז _V SCF מקופל כראוי באמצעות יחידות מסנן מולקולריות עם הפסקת מולקולרית של 10 kDa.
3. לטהר את התרכיז על ידי סינון ג'ל S200.
4. תווית SCF monomeric (TCEP) עם אלקסה פלואוריד 647 מייד לאחר טיהור. בצע את תגובת התיוג הטוב ביותר ביחס טוחנת של חלבון: צבע של לא יותר מ 1: 2 על RT לא יותר מ -2 שעות.
   הערה: TCEP הוא סוכן הפחתת phosphorous- מבוסס ואינו מגיב עם maleimides בריכוזים אלה ^9. זה יכול מכאן להיות נוכח במהלך תגובת התיוג כדי לשמור על קבוצת sulfhydryl מזווג המופחתת עד שמגיב עם נגזר הצבע-maleimide.
5. לטהר כותרת monomeric SCF _V לבסוף באמצעות סינון ג'ל S75. Chromatogram נציג מוצג באיור 3.
6. לקבוע את הצבע: spectrophotometrically יחס חלבון.
7. חלבוני חנות ב -20 ° C בגליצרול / 50% PBS.

2. מדידות סידן שטף

1. קח בקבוקון טרי המכיל 50 מיקרוגרם פורע-2-AM ולפזר אותו ב -50 DMSO ללא מים μl.
2. ספין למטה 10 ⁶ תאים T בצינור עגול תחתון-5 מיליליטר פוליפרופילן 2 דקות ב250-400 גר '.
3. Resuspend תאי T במדיום הדמיה 200 μl מכילים פתרון של האנק מאוזן מלח בתוספת סידן / מגנזיום וovalbumin 1% ב RT, להוסיף μl 1 של פתרון הפורע-2-AM המניות (1: 200 דילול), לערבב את ההשעיה תא דגירה ב RT למשך 30 דקות.
4. לשטוף את תאי T פעם במאגר הדמיה. לשם כך, למלא את הצינור המכיל את התאים עם חיץ הדמיה ב RT וגלולת התאים כפי שמתואר בשלב 2. הסירו את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 200 חיץ ההדמיה μl (כלומר, בצפיפות תאים סופית של 5 x 10 ⁶ מיליליטר תאים ^-1). ניתן להשתמש בתאים באופן מיידי למדידות סידן או מאוחסנים על קרח עד 3 שעות.
5. תאי מקום בSLB פונקציונליות במאגר הדמיה (37 מעלות צלזיוס). ברגע שתאי T להתחיל ליצור קשר עם SLB, לרכוש הסט של תמונות הבאות כל 15 עד 30 שניות למשך 30 דקות:
   excitatיון ב340 +/- 5 ננומטר, זיהוי פליטה ב 510 ננומטר +/- 40
   עירור ב 380 +/- 5 ננומטר, זיהוי פליטה ב 510 ננומטר +/- 40
   דסק"ש (אופציונאלי)
   הערה: זמני חשיפה המתאימים תלויים בעוצמת מקור אור העירור. תוצאות משביעות רצון מתקבלות כאשר עוצמות פיקסל של 340 ננומטר (380 ננומטר) סכום ערוץ לכרבע (מחצית) של ערך העצמה מקסימאלי האפשרי. זכור כי ערכי פורע-2 נרגשים ב340 ננומטר יגדלו ואלה נרגשים ב380 ננומטר יקטנו על הפעלת תאי T.
6. 20-25 דקות לריצה, להוסיף 50-100 μl של הנוגדן מראש חימם אנטי-pMHC חסימה בריכוז סופי של 20-50 מיקרוגרם מיליליטר ^-1. הנוגדן מרווה כל pMHCs וכתוצאה מכך תאי T יחדלו להכיר אנטיגן ולהפסיק fluxing סידן. המשך הקלטת תמונות לעוד 5 -. 10 דקות לרכוש קו הבסיס של ריכוז סידן תוך תאי, אשר תואם את המצב מופעל אינו של תאי T < / Li>
7. לקבוע את אות הקרינה רקע הממוצעת ב340 ננומטר ו 380 ננומטר עירור בתוך אזור של עניין של לפחות 1,000 פיקסלים, אשר אינו מכיל תאים. רקע-לחסר כל פורעה 2-התמונות נמדדו נרגשות ב340 ננומטר ו 380 ננומטר ולחשב 340 ננומטר / 380 יחסי עצמת ננומטר של תאים בודדים או קבוצה של תאים. לנרמל יחסי עוצמה על ידי חלוקת כל היחסים דרך היחס של מסגרות הזמן האחרון חמש (כלומר, עם נוגדן-מצור מוחלט של pMHC).
8. עלילה מנורמל-פורעה 2 יחסים נגד זמן. הערה: כאשר תאים וbilayers נמצאות במצב טוב, ננומטר / 380 יחסי עצמת ננומטר פורע-2 340 לאמץ בדרך כלל ערכים בין 2 ו -5, 15-45 שניות לאחר התאים יצרו קשר עם bilayer. יחסים לאחר מכן ירידה לערך בין 1.6 ו -2 שבו הם נשארים קבועים לפחות 20 דקות או יותר. ערכים צריכים לרדת ל 1 רק לאחר התוספת של נוגדנים נגד pMHC. דוגמא טיפוסית מוצגת באיור 5.

"> 3. גורף סריג מדידות

3.1. קישוט TCR עם H57scF _V

1. ספין למטה 10 ⁶ תאים T בצינור עגול תחתון-5 מיליליטר פוליפרופילן 2 דקות ב250-400 גר '.
2. למזוג תקשורת, קפיצי תא גלולה בעדינות ולהוסיף 0.3 μl של SCF _V (ריכוז ~ 1 מ"ג / מיליליטר) להשעית התא. לתפזורת סריג מדידות להעסיק צבען שכותרתו רק scFv. למולקולה בודדת סריג מדידות להשתמש בשילוב של scFv ללא תווית (5 עד 9 חלקים, אינו מכיל ציסטאין מזווג) וצבע שכותרת scFv (חלק 1, מכיל ציסטאין מצמידים צבע מזווג אחד).
3. דגירה התאים על קרח במשך 15 דקות ולשטוף את התאים פעמיים באמצעות צנטריפוגה רצופה באמצעות חיץ הדמיה קר כקרח.
   הערה: ניתן לאחסן בתאים על קרח ללא אובדן משמעותי של כבול SCF _V (t _1/2 של ניתוק _V SCF ב 0 ° C ~ 4 שעות ^2). טוהר של T-תאים ראשוניים נבעו מTCR-מהונדס (ולחלופין גם כישופים1/2 עכברים חסרים) ומגורה במבחנה הוא גבוה יותר מאשר 98% מאז תאי T הם התאים רק מתרבים (עד 7 חלוקות תא) בתגובה לפפטיד, שנוסף לגירוי לתרבות תאי T. B-התאים עוברים אפופטוזיס והם כבר לא בחיים לאחר 7-10 ימים של טיפוח. כמה תאים דנדריטים לשרוד עדיין יכולים להיות מופלים בקלות נגד לא רק בגלל המורפולוגיה הייחודית שלהם, אלא גם משום שהם לא יחייבו את בר scFv אנטי TCR בטא H57.

3.2. סריג מדידה באמצעות שחזור תורם לאחר הלבנת acceptor

הערה: זכור כי זמן מחצית החיים של מתחמי _V TCR-H57 SCF מסתכמים 4 שעות על קרח, עד 50 דקות ב22.5 מעלות צלזיוס ועד 6.8 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (וכ -4 שעות על קרח) ^2. כל עוד H57 SCF _V משמש כתורם סריג, סריג תשואות שנמדדו אינן רגישות לניתוק _V H57 SCF, עם זאת, את האות לעליות יחס רעשעם ניתוק H57 מוגבר.

1. הכן AF647 מכיל pMHCs SLB / כותרת Cy5 כמו גם ICAM-1 ללא תווית וB7 לפי Axmann et al. ^4.
2. להחליף PBS של חדר ההדמיה עם מדיום הדמיה המכיל סידן בתוספת ovalbumin הפתרון / מגנזיום ו -1% של האנק מאוזן מלח. לμl זה pipet 400 של חיץ הדמיה לתוך הבאר, לערבב בזהירות ולהסיר 400 μl מהבאר. חזור על תהליך זה 3-4 פעמים. אל תחשוף את SLB לאוויר בכל עת.
3. מניחים את חדר ההדמיה לבמה מיקרוסקופ ולהתאים את המיקוד עד הניאון (AF647, Cy5) SLB מגיע לתצוגה ברורה.
4. הגדר את תאורת TIRF ידי תרגום מקביל קרן הממוקדת לציר האופטי לפריפריה של מטוס המוקד של המטרה באמצעות ההעברה של שלב translational של פריסקופ.
5. כדי לכוונן קרן לייזר עירור במצב TIRF, להוסיף תאי T מעוטרים AF555 / Cy3 שכותרתו SCF _V
6. לרכוש את שש התמונות הבאות, לפי סדר שצוין וברצף מהיר (איור 6):
   (I1, אופציונאלי) אור לבן, לקחת תמונה של התא,
   (I2, אופציונאלי) עירור 647 ננומטר (צריכת חשמל נמוכה) לקחת תמונה של acceptor סריג (pMHC) לפני דופק אקונומיקה,
   עירור 514 ננומטר (צריכת חשמל נמוכה) (i3) לקחת תמונה של תורם סריג (TCR) לפני דופק אקונומיקה,
   (I4) 647 עירור ננומטר (מתח גבוה) לתמונה-אקונומיקה acceptor סריג, /> עירור 514 ננומטר (צריכת חשמל נמוכה) לקחת תמונה של תורם סריג (TCR) הבאים דופק אקונומיקה (i5),
   עירור 647 ננומטר (צריכת חשמל נמוכה) (I6) כדי לוודא הלבנת acceptor סריג שלמה.
7. שמור את הזמן עבר בין תמונות (i3) ו- (i5) הקצר ככל האפשר על מנת שתוכל לתאם את התמונות לניתוח מאוחר יותר. שמור הלבנת תורם סריג במינימום על ידי שימוש בעירור ברמה הנמוכה ביותר האפשרית הכח, שעדיין מאפשרת להדמיה תקינה של תאי T.
8. בחר אזור של העניין (ROI), למשל, כל סינפסה או microcluster TCR בודד, לקבוע העצמה הממוצעת שלה ב( i3) (= אני ₍₃₎₎ וב( i5) (= אני _(5)). לחיסור רקע, להרים את ההחזר על ההשקעה של אותו הממד שמחוץ למקום התאורה ב( 3) או (5) ולקבוע העצמה הממוצעת שלה (אני _(ברקע)). כדי לקבוע את תשואת סריג לבצע את הפעולה הבאה:
   ז "/> (משוואה 7)
   הערה: יש לציין כי ביחס לרמת סריג המוחלטת, זה יכול להיות נחוץ כדי לתקן הלבנת תורם בין תמונות (i5) ו- (i3).

3.3. סריג מדידה באמצעות פליטה רגיש

1. בצע תורם במרחב וביישור ערוץ acceptor עם השימוש של חרוזים בשלל צבעים, שלזרוח בכל ערוצי הפליטה. השינוי המרחבי בין שני הערוצים בשל סטייה כרומטית יכול להיקבע על ידי חרוזים בודדים מיצוב-העל ולהיות מיושם לתיקונו של אחד משני ערוצים לכל דימוי הזוגות 2-הצבע הבא ^10.
2. לקבוע את מידת bleedthrough תורם עם השימוש בSLB מכיל fluorophore תורם סריג לבד. זה גם אפשרי להשתמש תאי T שכותרתו סריג-תורם על bilayer שומנים עם pMHC ללא תווית. רקע נקבע תחילה מחוץ לשדה המואר מבט וחסר משני הערוצים. בדרך זו ba הממוצע עוצמות המתוקנות ckground של שתי מקבילות ROIs _{(ערוץ תורם} אני ואני _{acceptor ערוץ)} נקבעות. לחשב את מקדם bleedthrough (BTC) כדלקמן:
   (משוואה 8)
   הערה: זה BTC הוא קבוע לצבע מסוים והגדרת שילוב מסנן.
3. לחשב את תמונת bleedthrough תורם סריג כדלקמן:
   (משוואה 9)
4. לקבוע acceptor עירור בין-ידי מרגש SLB מכיל fluorophore acceptor סריג לבד (למשל, ^k IE / MCC-אלקסה פלואוריד 647) ראשון עם אור עירור תורם סריג (למשל., 514 ננומטר) ולאחר מכן עם אור עירור acceptor (למשל, 647 ננומטר). השתמש בתמונות מופחתות רקע בערוץ acceptor סריג כדי לחשב את מקדם העירור הצולב (CEC) כדלקמן:
   ftp_upload / 53,157 / 53157eq10.jpg "/> (משוואה 10)
5. כועדת הבחירות המרכזית תלויות בעוצמת הלייזר המשמשת לעירור תורם, לקבוע אותו בכל יום מדידה. השתמש בועדת הבחירות המרכזית וכתוצאה מכך כדי לחשב את התמונה שנוצרה אך ורק באמצעות עירור צולב.
   (משוואה 11)
6. לחשב את תמונת סריג המתוקנת לbleedthrough ועירור צולב כדלקמן:
   (משוואה 12)
   הערה: אות מוחלטת סריג (אך לא את תשואת סריג היחסית) היא רגישה לניתוק של H57 SCF _V מTCR הקרום הנכנס T-cell. כדי להימנע מאובדן מוגזם של חללית TCR-סריג, שואף לבצע מדידות על 37 מעלות צלזיוס בתוך 2 דקות הראשונות לאחר התוספת של תאי T לbilayer. מדידות עם (≥ 95%) תיוג כמותיים TCR הן אפשריות רק בבית או מתחת 22.5 מעלות צלזיוס בתוך 3 דקות הראשונות לאחרתוספת של תאי T לbilayer.

4. מדידות מולקולה בודדת סריג

1. התאם את הכח של שני הלייזרים ללהצמיח עוצמת 1-5 קילוואט / מיקרומטר ² בדגימה. לקבלת מידע נוסף אנא פנה אל Axmann et al. ^4.
2. תווית תאי T כפי שתואר לעיל עם שילוב של תווית SCF _V (5-9 חלקים) וCy3 / כותרת AF555 SCF _V (חלק 1). שים לב: בדרך זו רק חלק קטן מTCRs מסומן בסריג-התורם. פעולה זו מפחיתה את מספר האינטראקציות לזיהוי, אך רעש שנוצר מbleedthrough התורם גם ירד באופן משמעותי (בכ 5 ^1/2 עד 10 ^1/2), שהוא קריטי כאשר פתרון מולקולה בודדת בודדת סריג אירועים.
   הערה: הניתוק של חללית H57 scFv מTCR אינו משפיע על המדידות, כפי שמתרחש בטווח זמן גדול בהרבה (דקות עד שעות) מאשר הניתוק של TCR מpMHC (תת-שני קשורה-SLB לשנייהטווח).
3. הנח SLB כולל pMHCs כותרת AF647 כמו גם ICAM וB7 על הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את המיקוד כך שbilayer מגיע לתצוגה ברורה.
4. אופציונאלי: הכנס צמצם חריץ למסלול העירור (כפי שמוצג בAxmann et al ^4.) כדי להסוות את רוב תחום התאורה מלבד סינפסה. בדרך זו ^k / MCC (C) -Alexa פלואוריד 647 מולקולות acceptor סריג מולבנים IE יכולות לעבור לאזור של תאורה.
5. להוסיף H57 SCF _V T-תאים מעוצבים לbilayer (עם חיץ הדמיה), ולחכות עד סינפסות מופיעה בשדה הראייה.
6. קח ברצף מהיר רצף של 10 עד 20 סטי תמונה באמצעות זיהוי 2-צבע:
   עירור i1) 514 ננומטר
   עירור I2) 647 ננומטר
7. לחשוף תמונות ל1 עד 5 אלפית שניים ולרכוש כסט של תמונות.
8. כדי להעריך את הזהות של מולקולה בודדת סריג אירועים, להחיל את אותו התיקון לגבי bleedthrough התורם acceptor מבתר את תמונות הפולרויד צולבתtion. יתר על כן, מולקולה בודדת סריג אירועים צריכים ליישר עם מולקולות acceptor אחת ואמורים להופיע ולהיעלם בשלב אחד (ראה גם באיור 7).
9. Off-שיעור נחישות
   1. שיא עקבות של מולקולה בודדת סריג אירועים לכמה מסגרות זמן רכישה.
      הערה: בדוגמא זו (בכתב נטוי) מחוץ לשער בין 5c.c7 TCR ו- ^k / K3 IE נמדד 25 מעלות צלזיוס עם ארבע פעמים שונות עיכוב (42 אלפיות שני, 490 אלפיות שני, 1,007 אלפיות שני, 1,989 אלפיות שני).
   2. רשימת סריג עקבות לפי אורכי עקבותיהם כפי שמוצג בטבלה 1.
   3. המרת טבלת 1 לפונקצית ריקבון מצטברת הפוכה (טבלה 2) כפי שמוצגים (מספרים צבעוניים לקוחים מטבלה 1).
   4. לנרמל את פונקצית דעיכה וכתוצאה מכך, לחלק את מספר העקבות של טבלה 2 בסכום של כל העקבות בקבוצה מסוימת. עלילה הערכים מנורמלים נגד מספר מסגרות זמן. כאשר השמטת מסגרת הזמן האחרונה, המכילה אפס, ניתן לקרוא הדועךily מצויד בפונקציה מעריכית יחידה (איור 8 א).
   5. כפי שניתן לראות באיור 8B, העלילה ערך הציפייה <n _(פיגור t)>, כלומר, הפוך השלילית של המעריך של פונקצית הדעיכה נקבעה לעיל נגד _הפיגור לא זמן השהיה המועסק (בדוגמא זו: _פיגור x = t = 0.042 ים ו- y = <n _(פיגור t)> = 1 / .662 = 1.511, x = 0.49 S ו- y = 1 / .902 = 1.101, x = 1.007 ים ו- y = 1 / 1.131 = .884, x = 1.989 ים וy = 1 / 1,591 = 0,629).
   6. τ _את Fit ו- <n _{להלבין>} מבוססים על משוואת 3. ניתן לעשות זאת באמצעות פונקציה מתאימה שאינו ליניארי של תכנית ניתוח נתונים מדעית כגון מקור.
      הערה: בכושר הטוב ביותר שמוצג בדוגמא זו מניב τ _הנחה של 2.12 +/- 0.23 של ו< n _{להלבין>} של 1.53 +/- 0.06 שניות.
   7. לחשב את האלחיים F של האינטראקציה לא _{1/2 מעם} לא _{1/2 מ=} τ _את • ln (2) (בדוגמא זו: 1.47 ים).
10. נחישות 2D-K _D
    1. לקבוע את C מקדם המרה לזוג צבע סריג מועסק בשימוש במשוואה 6 וכפי שתואר לעיל (איור 4 א).
    2. לקבוע את תשואות סריג לmicroclusters TCR בודד או סינפסות כל (3B דמויות ו -5).
    3. שימוש במשוואה 4 להמיר את כל התשואות בודדות סריג לתפוסות TCR (איור 4C).
    4. החל משוואה 11 להמיר את כל תפוסות TCR ל2D-K _D של. כפי שעולה בהמשך, הסינפטי המחייב הוא הומוגניות. מדד משמעותי לK הסינפטי _D שלו החציון (מסומן באדום) של כל microclusters נמדד (איור 4D).
11. חישוב 2D-K _על ים
    1. חישוב k _בחוק של פעולה המונית עם k _ב= k _את / K _D וk נקבע באופן ניסיוני _את וערכי K _D.
       הערה: k הסינפטי _{יצא לניסוי} שמוצג באיור 4 ^(יא IE / MCC אינטראקציה עם 5c.c7 TCR של 25 מעלות צלזיוס) היא 0.41 s ^-1. מכאן עלילת K _D (איור 4D) ניתן להמיר את ak _על עלילה כפי שמוצגת באיור 4E.

Representative Results

ההקלטה של סידן תוך תאי באמצעות צבע סידן פורע-2, כמו גם הניתוח הסלולרי שלאחר מכן כדי לאמת את עצמת גירוי ולכן הפונקציונליות של SLBs מוצג באיור 4. כמתבררת, רמות סידן לעלות בתאי T (מבוטאות 340nm 380nm יחס מנורמל פורע-2 / עם בסיס להיות 1) מייד ברגע שהם מתיישבים על SLBs גירוי. רמות סידן לחזור לרמות בסיס זמן קצר לאחר התוספת של נוגדנים אשר חוסם pMHCs מאירוסי TCR ואשר מסתיים הפעלת תאי T.

איור 6 מתאר ניסוי טיפוסי מעורב התאוששות תורם סריג לאחר הלבנת acceptor, אשר מועסקת למדוד תשואות סריג ואשר משמשת לחישוב ערכי 2D-K _D (שמוצג באיור 4). שים לב העלייה בעוצמת תורם סריג, המייצגת TCR שכותרתו באמצעות AF555, לאחר אבלציה המהירה והמלאה של סריגמיני cceptor (כאן: AF647 הקשורים pMHCs). ניכר גם היא הירידה החזקה בערוץ סריג, כלומר, ערוץ סריג-acceptor תחת עירור תורם סריג, לאחר הלבנת acceptor סריג. האות שנותרה בקושי נראית מתאימה לסריג bleedthrough תורם. תשואות סריג בתוך microclusters TCR הבודד או כל סינפסות מחושבות על בסיס הערכים שצוינו בעוצמה הנמדדת (איור 6).

איור 7 מתאר לשגות מסלול והזמן של מולקולת אירוע סריג אחת גלוי בשתי מסגרות זמן. כפי שתואר לעיל במבוא התנהגות כזו נגרמת על ידי שני הריקבון של TCR-pMHC הסינפטי המחייבים וphotobleaching. להפלות בין שתי התרומות הללו, המסגרות הניסיוניות זמן רכישה צריכה להיות מגוונות בזמן: בעוד photobleaching נשאר קבוע, שינויים באורך מסלול אירוע סריג נגרמים רק על ידי קינטיקה המחייבות. כימות של tracelengths, w hich מהווה את הבסיס לחישוב מחוץ לשיעורים והלבנה מוצגים באיור 7, מסופקים בשולחנות 1 עד 3.

קביעת 2D-K _D של דורשת הקלטה של תפזורת סריג תשואות לTCRs כותרת סריג-תורם. עם השימוש של C להסיק בניסוי הקבוע (איור 4), תשואת סריג נמדדה microcluster TCR או כל סינפסה ניתן להמיר את TCR תפוסה, כלומר, היחס של TCRs pMHC-עוסק וכולל (איור 4C) . עם צפיפות pMHC ידועה כיום על SLB לפני תוספת של T-cell, ניתן ליישם את הערכים כדי לקבוע ערכים הסינפטי 2D-K _D (איור 4D). על-שיעורים ניתן לחשב עם החוק של פעולה המונית (2D-k _ב= 2D-K _את / 2D-K _D) מהסינפטי נקבע מחוץ לשער וערכי 2D-KD.

1 "src =" / קבצים / ftp_upload / 53,157 / 53157fig1.jpg "/>
איור 1. מתווה סכמטי של bilayer שומנים מישוריים המערכת נתמכת זכוכית (SLB). SLBs () מורכב מPOPC (90-99%) והשומנים סינטטיים DGS Ni-נת"ע (1-10%) וליצור באופן ספונטני כאשר משטחי זכוכית נקיים נזקפים עם שלפוחית ​​unilamellar הקטנה (רכבי שטח) בהיקף של השומנים המקביל. (ב) לאחר שנוצר, יכול להיות פונקציונליות SLBs כזה עם חלקים מסיסים-מתויג polyhistidine תאיים נגזרים מpMHCs, costimulatory B7-1 חלבונים וחלבוני הדבקה ICAM-1, שישמש כנגמ"שים לתאי T. לקבלת מידע נוסף על הכנת SLBs מתייחס לAxmann et al. ^4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figu מחדש 2. פורסטר תהודת אנרגיה מבוסס ההעברה assay לכמת TCR-pMHC מחייב באתר. (א) מבנה מורכב של TCR ומורכב עם בר שרשרת אחת H57 עוסק pMHC ממחישה את הגישה מבוססת סריג המתואר במסמך זה. שים לב למרחק הקצר של כ 41 א מפריד בין שני fluorophores המקביל עובר סריג. אתרי acceptor לfluorophore-maleimides מסומנים בירוק ואדום. (ב) עיקרון גילוי אינטראקציות TCR-pMHC באתר מאויר. רק SCF _V -decorated TCRs וpMHCs (כאן ^k IE), המהווים מתחמים ספציפיים, להצמיח אות סריג מדידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"/>
איור 3. chromatograms של עליית שלב סינון ג'ל נותנת הסופית ^לk -2x6H מולקולות IE monomeric של SCF _V והטעון פפטיד. X-צירים מייצגים שימור נפח במ"ל, Y-צירים מצביעים הספיגה ב 280 ננומטר ביחידות שרירותיות (AU) . (א) אתר-במיוחד H57 SCF _V מסומן בmaleimide אלקסה פלואוריד 555 היה נתון לכרומטוגרפיה S75 להפריד צבע unreacted מהחלבון (שלב 1.2.5). שברים המתאימים למרווח שמירה 14 מיליליטר עד 15 (קווים מקווקווים) מייצגים כותרת _V H57 SCF monomeric. מולקולות (ב) IE ^k -2x6H ומורכבים עם פפטיד בעל ANP-חלל UV-cleavable הייתה מוקרן UV, מודגרות עם אלכס אתר-במיוחד 647 פפטיד שכותרת maleimide ולבסוף נתון לכרומטוגרפיה S200 להפריד את החלבון מפפטיד בחינם (שלב 1.1.2.4). המרווח בין הקווים מקווקווים מכיל מקופל כראוי וpMHCs monomeric. (A, B) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. קביעת _D של 2D-K ו2D-K _על ים. () המתאם בין תשואת סריג כפי שנקבע על ידי התאוששות תורם לאחר הלבנת acceptor ותפוסת TCR נמדדו בניסוי. תפוסת TCR ניתן לקבוע לmicroclusters TCR פרט כפי שהוסברה בסעיף 4.2. נכון ליניארית של הנתונים המוצגים על ידי הקו, המדרון שבם הוא שווה ל- C היחס בין TCRהתפוסה ותשואת סריג. C הוא ספציפי קבוע למערכת סריג וfluorophores (כאן Cy3 ו Cy5) מועסקות. בדוגמא זו הניבה 1.988. (ב) סריג נתוני תשואה נקבעו לmicroclusters TCR הבודד (N = 187, טמפרטורה = 24 ° C) דרך התאוששות תורם של הלבנת acceptor. מספרים מתחת ברים היסטוגרמה לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. המרה (C) של הנתונים המוצגים ב( ב ') על ידי הכפלה נמדד סריג תשואות עם הקבוע C שנקבע ב(). מספרים מתחת ברים לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. היסטוגרמה (ד) (חצי-לוגריתמים, בסיס = 4) המתאר את חלוקת 2D-K _D של נמדדה microclusters TCR הבודד. 2D-K _D החציון מצויינים בכחול. מספרים מתחת ברים לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. (E) היסטוגרמה מוצגת ב( ד) הוסב intOA 2D-K _על -histogram (חצי-לוגריתמים, בסיס = 4) העסקת k הסינפטי _{לסירוגין} במשך 24 ° C (0.41 s ^-1). 2D-k החציון נקבע _על ערך מצויינים בכחול. הנתונים פורסמו במקור חופה et al. ² והם דמיינו כאן בפורמט חדש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. אימות פונקציונלית של SLBs מועסק לגירוי תא T והדמיה. תקיעות T-cell () TCR-מהונדסים עמוסות פורע-2 התעמתו עם SLB גירוי מחסה pMHCs אנטיגני, ICAM-1 ו- B-7. פורע-2 פליטה סלולרית נרגשת ב340 ננומטר ו 380 ננומטר, כמו גם תמונות דסק"ש נרשמו. כפי שצוין, ערכי יחס של עוצמות הפליטה נרגשות על 340 ו 380 ננומטר מוצג בפנל הימני. תוספת של pMHC חסימת נוגדנים 14 דקות לניסוי הריצה הביאה לירידה ברמות סידן תוך תאי דומים לזה של מנוחה תאי T. (ב) פרופיל זמני טיפוסי של יחסי פורע-2 ממוצע בתאי T הפנייה SLBs גירוי מאופיין על ידי עלייה ראשונית בסידן תוך תאי שהוא 2 עד 4 פעמים גבוהות יותר בהשוואה לזו של תאי T שאינו מופעלים או תאי T נשללו אנטיגן לאחר מצור בתיווך נוגדנים. עיגולים ירוקים מצביעים נקודות זמן מאוירות ב(). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

גורף 6. איור סריג תשואות כפי שנמדד באמצעות שחזור תורם סריג לאחר הלבנת acceptor סריג. et al ^4). הקו שמוצג בתמונה דסק"ש עזבה מציין את הגבול של סינפסה T-cell. שים לב להפסד בעוצמה בתוך ערוץ acceptor סריג גם היא העלייה בעוצמת בערוץ תורם סריג לאחר הלבנת acceptor סריג (שלב 4). (ב) סריג ניתן לכמת את היעילות כפי שצוין לאזורים הסינפטי בודדים או לכל סינפסות. לבדיקה, תמונות לפני ואחרי הלבנת acceptor סריג מוצגות עם השימוש בשני שולחנות בדיקה (luts, ירוק ופיסיקה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. מולקולה בודדת סריג אירועים מופיעים ונעלמים צעדי insingle ומיושרים באופן מושלם עם fluorophore acceptor סריג יחיד. לשגות של המולקולה בודדת אירוע סריג הזמן מוצג. תמונות נרכשו באמצעות מצלמה EMCCD-אחורית מואר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8. קביעת τ _את = 1 / k _מן מסלולי smFRET נמדדו. (א) הסכומים המצטברים מנורמלים של אותות סריג לצפייה (הנגזרים מH57 SCF _V -AF555 מעוצב 5c.c7 תקיעות T-cell מהונדס TCR הכרת IE <sup> k / K3-AF647 ב 24 מעלות צלזיוס) במשך ארבעה פיגורים שונים זמן (42 אלפיות שניים, 490 אלפיות שניים, 1,007 אלפיות שני, 1,989 אלפיות שני) היו זמם כפונקציה של המספר הכולל של תצפיות. פונקציות בכושר מונו מעריכי להצמיח מקביל ההפוך השלילית של ערכי הציפייה <n _(פיגור t)>. ערכים (ב) ציפייה היו זממו נגד _פיגור t עיכובים ומצוידים באמצעות משוואה <n _(פיגור t)> = τ _את / {(Τ _את / <n _{להלבין>)} + _פיגור t} להניב τ _את ו< n _{להלבין>.} אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מדידת אינטראקציות בין חלבונים באתרו היא רצויה מאוד במיוחד כאשר התמודדות עם אינטראקציות זיקה נמוכות כגון TCR-pMHC מחייב ^11. סיבה לכך הוא על-השיעור, כמו גם את היציבות של אינטראקציות אלה השפיעו באופן משמעותי על ידי נסיבות מסוימות שבהם מחייבים מתרחשים. גישות הדמיה מבוססת סריג מינימאלי פולשנית ולכן הם באופן עקרוני בצורה מושלמת המתאימים למשימות כגון, עדיין כרוכות במספר המכשולים שצריכים להתגבר ראשון. רעש שנוצר על ידי autofluorescence הסלולרי מגביל את הרגישות של המדידות ולכן צריך להיות כל הזמן במינימום. מיקרוסקופיה TIRF משרתת את הצורך הזה גם ¹² מאוד אבל דורשת functionalization זכוכית שקופיות, באופן אידיאלי בצורה של bilayer שומנים מישוריים נתמך זכוכית מעוטרת עם חלבונים של הבחירה ^13-15. יתרון נוסף של גישת reconstitutive חלקית הוא ששותפי סריג bilayer תושב רקומביננטי יכולים להיות הרבה מ 'עפרות שכותרתו בקלות באופן כמותי, באתר ספציפי והגיוני עם fluorophores קטנה יותר ובהירה יותר יהיה אפשרי עם חלבונים הביעו פני תא. TCRs מתויג עם SCF רקומביננטי _V של, שאינו משפיע על הכרת תא T, כפי שנבדק בעבר ^2. יתר על כן, הרכב החלבון של SLB, למשל הצפיפות של pMHCs והבחירה של גורמי אבזר יכולים להיות מותאם לצרכים של אחד ספציפיים. אנחנו ביצענו בעבר ניסויים עם משתנה צפיפות של pMHCs גירוי, אך לא זוהו הבדלים משמעותיים ב2D-K _את ו2D-K _D ^2.

עד כה כאן ההכרה של מולקולות MHC II כיתה כבר עסקה רק, בעיקר בגלל האופי של שסע פפטיד מחייב, אשר פתוח בשני הקצוות וכך להכיל פפטידים גדולים כוללים מקשר לקובץ מצורף fluorophore. במקרים מסוימים גישה כזו עלולה גם לעבוד עבור CLA MHC תיוגss אני מולקולות ¹⁶ אבל יש לנקוט זהירות רבה כדי לוודא את השימוש בם בניסויים. הרגישות של תאי T כלפי אנטיגנים, שניתן למדוד באמצעות מבחני התפשטות תאי T, כמו גם pMHC-TCR מחייב קינטיקה כפי שנמדדו במבחנה על ידי תהודת plasmon פני השטח לא צריך להיות מושפעת על ידי התוספת של מקשר וfluorophore ל פפטיד. לחלופין, מעמד MHC אני מולקולות עצמן יכול להיות מתויג באופן ספציפי לאתר עם ההקדמה של ציסטאין מזווג בתוך הרצף של השרשרת הכבדה (תצפיות לא פורסמו).

עם השימוש בבדיקות מולקולריות מתאימות כל אינטראקציה בין חלבונים סינפטיים יכולה בעיקרון להיות למדה באופן מתואר במסמך זה. בדיקות כאלה, למשל, של SCF _V או חלבונים עוצב Ankyrin חזרו (DARPins) ^17, צריכה להיות חד ערכי וצריך לקשור היעד שלהם ביציבות מבלי להשפיע על האינטראקציה של עניין. כמובן, informatio המבניn רצוי מאוד לעיצוב בדיקה רציונלים אבל לא חובה מוחלטת. בעת הקמת זוג שותפי סריג חדש, מומלץ להקליט ולנתח סריג בכמויות הגדולה הראשונה. אתרים של קובץ מצורף תווית עשויים להיות מגוונים במידה ניכרת על מנת למקסם את אות סריג וגם כדי לוודא שתשואות שנמדדו סריג להשתנות בהתאם למרחק בין הצבע. ברגע שהמערכת מותאמת, מולקולה בודדת סריג אותות עשויים להיות מוקלטים על ידי הגבלת התיוג של שותף סריג שפע הגבוה ל10-30% והלבנת שותף סריג שפע הנמוך עד מולקולות בודדות הן פתירות בתחום התאורה.

אחרון חביב יש לציין כי SLBs משוער כמה אבל לא את כל ההיבטים של קרום פלזמה פיסיולוגי. תכונות כגון עקמומיות קרום וגמישות, מידור תחום, שחלופי cytoskeletal ותנועתיות תא, כמו גם מגוון גבוה של חלבונים בממברנה-הביע משטח אינן מיוצגות על ידי SLBs אבל עשוי להשפיע לאהוא לעבד תחת חקירה. הרבה מאמץ צריך להיות מושקע להקים שיטות הדמיה המאפשרות ניטור אינטראקציות חלבון-חלבון עם רזולוציה מולקולה בודדת בסינפסות הפיזיולוגית, שאינן נגישים להדמית TIRF.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Sf900 II	Life Technologies	10227402	insect cell media for baculo virus production
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)	Fisher Scientific	10564038	insect cell media for baculo virus expression
Sf9 cells	Life Technologies	11496-015	cells for virus production and expansion
High Five Cells	Life Technologies	B855-02	cells for potein expression
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Centramate System	Pall		protein concentartion from large volumes
Centramate cassette 10kDa cutoff	Pall	OS010T12	protein concentartion from large volumes
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC900308	protein concentartion
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC800308	protein concentartion
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL	EMD Millipore	5123	protein concentartion
Äkta pure 25L	GE Healthcare	29-0182-24	protein purification
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17-5175-01	protein purification
Superdex 75 10/300 GL	GE Healthcare	17-5174-01	protein purification
Mono Q 5/50GL	GE Healthcare	17-5166-01	protein purification
Ni Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-01	protein purification
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Cy3 maleimide	GE Healthcare	PA23031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Cy5 maleimide	GE Healthcare	PA25031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20347	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Fura-2, AM, cell permeant	Life Technologies	F-1221	calcium-sensitive dye for cell labeling
dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	151874	for dissolving fura-2 am
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium	Fisher Scientific	10225362	imaging buffer
PBS	Life Technologies	14190-136
Bovine Serum Albumin lyophilized powder	Sigma Aldrich	A2153	supplement for imaging buffer
14-4-4S antibody	affimetrix eBioscience	14-5980-81	blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)
5 ml polypropylene round-bottom tube	Becton Dickinson	FALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit	EMD Millipore	UFC30GV0S
Syringe filter 0.2µm	Millipore	GVWP04700
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Life technologies	T-7279
Microscope for fura-2-based calcium measurements	LEICA	DMI4000B
Microscope for (single molecule) FRET measurements	LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS	for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
planar supported lipid bilayers		for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
RPMI 1640, with L-Glutamine	Life Technologies	11554416	T-cell media
non-essential amino acid 100X	Hyclone	SH30238.01	T-cell media supplement
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x	Life Technologies	12000226	T-cell media supplement
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	T-cell media supplement
mouse interleukin-2 recombinant protein	BPS Bioscience	90185-B	T-cell media supplement
Research Grade Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160.03	T-cell media supplement
Origin (analysis program)	OrigenLab	http://www.originlab.com/	non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])