Mätt TCR-pMHC Bindning Published: October 30, 2015 doi: 10.3791/53157

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Markus Axmann¹, Gerhard J. Schütz¹, Johannes B. Huppa²

¹Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, ²Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

Introduction

En mer grundläggande förståelse för hur T-celler känner igen antigen kräver tittar på rätt ställe, det vill säga inom den immunologiska synapsen bildas mellan T-cellen och APC. Här är molekylära bindande kinetik inte bara bestäms av de inneboende biokemiska egenskaperna hos interaktions inblandade parterna utan beror i stor utsträckning på cellulära parametrar, som omfattar cellulära krafter, membran arkitektur och laterala interaktioner mellan membranproteiner samt synaps specifika geometriska begränsningar ^3. Biokemiska metoder är begränsade i upplösningsförmåga som de nödvändiggör avbrott i åtminstone en av de synaptiska membranen inblandade. Av denna anledning en FRET-baserad avbildning metodik utvecklades för att övervaka bindning av TCR till antigena pMHCs ^2. Här T-celler är inredda med en rekombinant och platsspecifikt märkt TCRβ-reaktivt enkelkedjigt antikroppsfragment (SCF _V) och konfronteras med planen ar glas stöds lipiddubbelskikt (SLBs), som hyser MHC klass Il-molekyler laddade med en fluorescensmärkt antigen peptid, samstimulerande molekyler och vidhäftningsproteiner. Synaptic bindning mellan färgämnesmärkta TCR och färgämnesmärkta pMHC resulterar i FRET, som kan övervakas på en bulk och enda molekyl nivå genom total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi.

I denna artikel förklaras i detalj hur man använder SLBs för analys T-cells synapser, verifiera deras integritet genom en funktionell T-cellskalciumflödesanalys, beteende FRET mätningar i bulk och med enda molekyl känslighet och analysera insamlade data. Rekommendationer erbjuds till att producera riktigt överensstämde proteiner som krävs för dubbelskiktsfunktionalisering. För mer specifik information om dubbelskiktsbildning och inställning av en lämplig TIRF mikroskop hänvisas till en extra allmänhetens tillgång JUPITER publikation publiceras rygg mot rygg ^4.

tält "> Naturen av SLBs

Funktionaliserbara SLBs kan lätt genereras från unilamellära vesiklar (SUV) innehållande de två lipidema 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfokolin (kort: POPC, 90-99%) och 1,2-dioleoyl- sn - glycero-3 - {[N- (5-amino-1-karboxipentyl) iminodiättiksyra] -succinyl} (kort: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV sprids på rena glasskivor för att bilda en sammanhängande plan tvåskiktsmembran ^4. DGS-NTA-Ni tjänar till att förankra polyhistidin-märkta proteiner via polyhistidin medierad komplexbildning med den syntetiska NTA-Ni-haltiga huvudgruppen (Figur 1A). För stabil association ett ersätter typiskt den nativa transmembrandomänen och den cytoplasmiska svansen hos adhesionsproteinet ICAM-1 och den samstimulerande molekylen B7-1 med en tagg som innehåller tolv histidiner (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) (Figur 1B) . Den peptidladdade klass II molekyl IE ^k innehåller två membraninbäddade (α och β) polypeptidkedjans. De trans / cytoplasmadomäner av båda kedjorna måste ersättas med en etikett som innehåller sex histidiner vardera (IE ^k α _6H β _6H eller IE ^k -2x6H). Som ett alternativ, förlängning av α-kedja med tolv histidiner och lämnar den extracellulära domänen av β-kedjan omärkta (ger upphov till IE ^k α _12H β _0H eller IE ^k -12H) ger upphov till tillfredsställande resultat (figur 1B).

Platsspecifik märkning av pMHCs

Det är viktigt att märka pMHC stökiometriskt och platsspecifikt för att kunna omvandla uppmätta FRET avkastningen till meningsfulla jämviktsbindningskonstanter. Detta kan uppnås genom kemisk märkning av en syntetisk peptid som laddas in i peptidbindningsklyftan av rekombinant histidin-taggade MHC klass Il-molekyler ^2,5. Peptiden inkluderar alla rester av T-cellepitop som viktell som en kort C-terminal linker (GGS) följt av cystein (t.ex. i mal cytokrom c (MCC) peptid ANERADLIAYLKQATK- GGSC, linkern är markerad i fet stil). Denna cystein används för att märka peptiden stökiometriskt med användning av maleimid-dye-derivat. Vid det här laget extra omsorg bör ägnas åt att verifiera kvantitativ färg koppling till cystein-peptid. HPLC-rening av peptiden-dye addukten rekommenderas och måste följas av elektrosprayjonisering masspektroskopi. Alla inspelade massa som motsvarar peptiden edukt (utan färg) återspeglar ofullständig märkning. Om detta är sant, bör HPLC-renad peptid underkastas konsekutiva rundor av färgmärkning tills märkningen bedöms kvantitativt. Notera att MALDI-TOF-masspektroskopi bör undvikas eftersom denna metod innefattar laserstrålning för prov jonisering. Denna behandling sönder bifogade känsliga fluoroforer innan peptidmassa utläses och därmed underrepre senterar grader av färgämne-konjugering.

Indirekt men sätesspecifik märkning av cellbundna TCR med användning av monovalenta enkelkedjiga _Fv-fragment

Det är fortfarande en utmaning att fästa färgämnen för att cellyte-associerade proteiner av levande celler i ett ställesspecifikt sätt. För att övervinna detta hinder för ytexponerade TCR har en monovalent enkelkedjigt version _(scFv) från generna enligt TCRβ -reactive monoklonala antikroppen H57-197 ² konstruerats. Kristallstrukturen för denna antikropp i komplex med TCR tillåter att rationellt utforma en version, i vilken en serinrest i omedelbar närhet till C-terminalen av MHC associerad peptid (där motsvarande FRET partnern färgämne är fäst) substitueras för en cysteinrest. Denna mutant cystein fungerar sedan som en acceptor för färg konjugering (Figur 2).

Metoder för att spela FRET

nt "> Bulk FRET värden är bäst lämpade för att kontrollera förhållandet mellan valda mellan färg avstånd och FRET effektivitet mäts i denna TCR-pMHC bindande system ^2. Dessutom bulkmätningar FRET avslöja kvalitativa och kvantitativa skillnader i synaptiska TCR-pMHC tillhörighet ( se nedan och protokoll avsnitt 3.2). Olika metoder för att kvantifiera FRET effektivitet har införts i litteraturen ^6. I den här artikeln FRET registreras via

(a) donator återhämtning efter acceptor blekning, och via

(b) strålningskänsliga FRET acceptor utsläpp.

Den första metoden (a) kräver användning av ett FRET-acceptor som lätt kan photobleached, och en givare, som är ganska fotostabila. Dessutom är det viktigt att se till att photobleached acceptorn är inte längre kan släcka donatorfluorescensen. Eftersom samma detekteringskanalen (donator) används för kvantifiering, faktorer ingen korrigering end inga kromatisk aberration måste beaktas, vilket gör denna metod enkel och tillförlitlig. Däremot kan kvantitativa mätningar inte upprepas på samma prov plats och förändringar i FRET kan inte spelas in under tiden. För att undvika effekter orsakade av molekylär diffusion eller cellulär motilitet snabb blekningssteg bör eftersträvas, vilket minimerar tiden passerar mellan första FRET donator (före acceptor blekning) och den andra FRET donator bild förvärv (efter FRET acceptor blekning). Det är rekommendera att använda en kraftfull laser ljuskälla av den FRET-acceptom excitationsvåglängden för att minimera dekoration och blekningstider.

I motsats, i tillvägagångssättet sensibiliserade mätning FRET utsläpp (b) FRET donatorn är glada och utsläpp av FRET mottagaren observeras i FRET acceptkanalen. Förändringar i FRET acceptor signal kan spelas in med tiden, men utsläpp av FRET donatorn i rödskiftade acceptor kanal (termed genomblödning) och FRET acceptor tvär excitation via givarexcite måste noggrant bestämmas och subtraheras från den inspelade FRET acceptor kanal. För detta motsvarande FRET donator och FRET-acceptor-bilder måste spatialt inriktade.

Detektion av en enda molekyl (sm) FRET händelser

Med användning av laser som exciteringskälla, en känslig kamera och buller-försvagade TIRF mikroskopi fluorescensen av enstaka fluoroforer lätt kan spåras över tiden. Liknande gäller för detektion av intermolekylära smFRET händelser. Dock kan komplikationer orsakas av FRET donator genomblödning och korsexcitering av FRET mottagaren, och därmed stor försiktighet måste iakttas vid justering av fluoroforenhetema tätheter i smFRET experimentet.

I protokollet nedan (protokoll avsnitt 4) TCR valdes FRET givare i hög förekomst och pMHC som FRET acceptor i begränsad omfattning. Att dämpa FRET donator genomblödning tillräckligt, dekorera 10-30% av TCR med fluorescerande _scFv och 90-70% av TCR med icke-fluorescerande _scFv. Här FRET acceptkanalen valdes som enda molekyl kanal eftersom det är konfokal med enda molekyl FRET kanal. Detta bidrar till att rikta smFRET händelser med enda molekyl FRET-acceptorer, som är grunden för smFRET validering.

Utvinna synaptiska off-hastigheter genom smFRET mätningar

Fotoblekning av både FRET givare och FRET acceptor måste redovisas vid extrahering halveringstiden interaktioner från enda molekyl FRET spår. Antalet observerbara FRET-signaler i början av sitt utseende som en enda donator-acceptor par N (0) minskas med tiden genom både ej bindande för receptor-ligandkomplex och fotoblekning. Antalet överlevande komplex vid en given tidpunkt N (t) kan matematiskt uttryckas på följande sätt:

I fotoblekning termen exp (-t / τ _blekmedel) tiden t beskrivs av produkten av antalet observationer n och belysningstiden t _{sjuk på grund} av den icke-kontinuerliga, diskreta observationsmod (dvs., blekning endast sker under belysning ). Inom den kinetiska termen exp- (t / τ _av) tiden t är produkten av antalet observationer n och tiden t _{fördröjningen} för en enstaka FRET iakttagelse (dvs, händer kinetisk ej bindande kontinuerligt). Ekvation 1 kan uttryckas som:

Termen τ _blekmedel / τ _sjuk describes antalet observationer tills blekning inträffar och definieras som väntevärdet <n _bleka> sin exponentiell funktion. Ekvation 2 kan förenklas enligt följande:

Väntevärdet <n (t _{eftersläpning)>} av antalet bildrutor N (t) med observerbara FRET-händelser efter tiden t direkt bestäms från experimentet. Det beror på den inställbara tiden mellan observationer (t _LAG) väljs i försöket och de okända värdena för τ _off (inversen av off-rate k _off) och <n _bleka>, det förväntade värdet av antalet observationer innan blekningen sker .

Således, beräkning av väntevärdet <n (t _{eftersläpning)>} under åtminstone två värden på t <n _bleka> och t _bort.

Extrahera synaptiska 2D-K _D-värden genom FRET baserade mätningar

Mätning TCR beläggning a, det vill säga förhållandet mellan bundna TCR och totala TCR, är centralt för att avgöra synaptiska 2D-K _D-värden. Enligt ekvation 4 denna term är direkt proportionell mot den uppmätta FRET erhållande så länge TCR tjänar som FRET givare och pMHCs som FRET-acceptorer.

med a = TCR beläggning, C = omvandlingsfaktor

C är en konstant, som beror av FRET-systemet och fluoroforerna som används. Det kan bestämmas experimentellt, såsom visas nedan. en kan omvandlas till en _2D-Kd enligt ekvation 5, närinitial densitet av TCR-ligander före tillsats av T-celler till dubbelskiktet är känd. Detta är på grund av den höga mobiliteten hos SLB lösa proteiner och även eftersom SLBs ger en nästan outtömlig reservoar av ligander ^2.

med [pMHC _initial] = initial densitet av pMHC före tillsatsen av T-celler

Med ekvationerna 4 och 5 kan man nu enkelt bestämma den synaptiska 2D-K _D mellan TCR och pMHC. Detta är mest tillförlitligt sker med FRET mätningar baserade på givar återhämtning efter acceptor blekning (se protokoll avsnitt 3.1).

Men för att mäta C förhållandet mellan FRET-intensiteten I _FRET (korrigerat för bakgrunds, FRET-givare genomblödning och FRET acceptor tvär excitation) och TCR beläggning en måste bestämmas. För detta, enbehöver veta förhållandet R mellan den genomsnittliga fluorescensintensiteten av enstaka TCR-associerade FRET givar fluoroforer (t ex Cy3 eller AF555) sm jag _{FRET givare} och den genomsnittliga intensitet enda molekyl FRET händelser sm jag _FRET. R beror på FRET-systemet i fråga, emissionsfilter och kamera som används för fluorescensdetektering.

TCR inflyttning en kan då direkt bestämmas enligt ekvation 6.

med R = sm jag _{FRET donator} / sm jag _FRET

R bestämdes som 1,45 för H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 systemet leder till:

a = bulk jag _FRET / bulk jag _TCR-Cy3 • 1,45

Förhållandet mellan TCR beläggning en och FRET utbytet kan bestämmas genom FRET donator återvinnay efter acceptor blekning. För detta båda parametrarna är avsatta mot en annan för ett antal TCR microclusters såsom visas i fig 4A .Den Lutningen på den linjära passform anger omvandlingsfaktorn C (ur ekvation 4).

Såsom visas i figur 4A, uppgår för (a) H57 _scFv C - Cy3 / pMHC-Cy5 FRET-systemet och (b) den applicerade mikroskopsystemet konfiguration till 1,995. TCR inflyttning en lätt kan härledas på följande sätt:

TCR beläggning a = FRET ge • 1.995

Protocol

1. Proteinproduktion

1,1. Tvåskiktsmembran bosatt proteiner: B7-1, ICAM-1, pMHC (t.ex. IE ^k / peptid)

1. B7-1 -12H, ICAM-1-12H
   1. Express B7-1-12H och ICAM-1-12H Konstruktionerna i höga kvantiteter som utsöndrade nativa proteiner med användning av ett baculovirus expressionssystem.
   2. Rena proteiner från odlingssupernatanter via Ni-NTA-affinitetskromatografi, följt av MonoQ-anjonbyteskromatografi och S200 storleksuteslutningskromatografi.
   3. Märk en alikvot av det renade proteinet med aminreaktiva färgämnen, såsom NHS succinimidyl-ester beredningar av Alexa Fluor 488 (eller FITC), Alexa Fluor 555 (eller Cy3), Alexa Fluor 647 (eller Cy5).
   4. Efter S200 storleksuteslutningskromatografi bestämma märkningsgraden av monomera proteinerna enligt färgämnestillverkarens specifikationer genom att jämföra protein absorption vid 280 nm och färgämnet absorption vid 488 nm (Alexa Fluor 488, FITC), 555 eller 552 nm(Alexa Fluor 555 eller Cy3) eller 647 nm (Alexa Fluor 647 eller Cy5).
      Notera: Detta förhållande kommer senare att behövas för att bestämma proteindensiteten på SLB från bulkfluorescenssignalen av färgämnesmärkt protein.
   5. Förvara de omärkta och fluoroformärkta proteiner vid -20 ° C i PBS plus 50% glycerol.
2. pMHC (här: IE ^k -2x6H eller IE ^k -12H)
   1. Refold MHC klass II från inklusionskroppar uttryckta i E. coli i närvaro av ett mycket billigare UV-klyvbar peptid substitut, som senare kan kvantitativt utväxlas med en fluorofor-konjugerad peptid av val ^{5, 7.}
   2. Rena återveckad pMHC komplex genom standardtekniker (Ni-NTA-affinitetskromatografi, MonoQ anjonbyteskromatografi, S200 gelfiltrering).
   3. Byt UV klyvbara peptiden med fluorescerande peptid ^{5, 7.}
   4. Rena monomert fluorescerande pMHC-komplex finally genom S200 gelfiltrering. Ett representativt kromatogram visas i figur 3.
   5. Kontrollera kvantitativa peptidladdning genom spektrofotometri.
   6. Förvara proteiner vid -20 ° C i PBS / 50% glycerol.

1,2. Generering av enkelkedjiga antikroppsfragment _(scFv s), införande av cysteiner för sätesspecifik märkning

1. Refold _scFv ar från inklusionskroppar uttryckta i E. coli. Här ett protokoll som utarbetats av Tsumoto och kollegor ⁸ följs i vilket inklusionskroppar först ovikta i 6 M guanidiniumklorid, fullständigt reducerade och sedan återveckas under loppet av en vecka genom att successivt minskning av koncentrationen av den protein utspelas guanidinklorid.
2. Koncentrera korrekt vikta _scFv med molekylärfilterenheterna med en molekylär cutoff 10 kDa.
3. Rena koncentratet genom S200 gelfiltrering.
4. Märk monomert scFv fosfin (TCEP) med Alexa Fluor 647 omedelbart efter rening. Utför märkningsreaktionen bäst vid ett molförhållande av protein: färgämne på högst 1: 2 vid RT under inte längre än 2 h.
   Obs: TCEP är en fosfor baserad reduktionsmedel och reagerar inte med maleimider vid dessa koncentrationer ^9. Det kan sålunda vara närvarande under märkningsreaktionen för att hålla den oparade sulfhydrylgruppen reduceras tills den reagerar med färgämnet-maleimid-derivat.
5. Rena märkt mono _scFv slutligen via S75 gelfiltrering. Ett representativt kromatogram visas i figur 3.
6. Bestäm färgämne: proteinförhållande spektrofotometriskt.
7. Förvara proteiner vid -20 ° C i PBS / 50% glycerol.

2. Kalcium Flux Mätningar

1. Ta en ny flaska innehållande 50 ug fura-2-AM och lös det i 50 ul vattenfri DMSO.
2. Centrifugera ner 10 ⁶ T-celler i en 5 ml polypropylen rundbottnad rör under 2 minuter vid 250 till 400 g.
3. Resuspendera T-celler i 200 | il bildalstringsmedium innehållande Hanks balanserade saltlösning plus kalcium / magnesium och 1% ovalbumin vid RT, tillsätt 1 pl av fura-2-AM stamlösning (1: 200 spädning), blanda cellsuspensionen och inkubera vid RT i 30 min.
4. Tvätta T-cellerna en gång vid avbildning buffert. För detta, fylla röret innehållande cellerna med avbildning buffert vid RT och pelletera cellerna såsom beskrivs i steg 2. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 | il avbildnings buffert (dvs., vid en slutlig celldensitet av 5 x 10 ⁶ celler ml ^-1). Celler kan användas omedelbart för kalciummätningar eller lagras på is i upp till tre timmar.
5. Placera celler på ett funktionellt SLB i imaging-buffert (37 ° C). Så snart T-celler börja kontakta SLB, förvärva följande uppsättning bilder varje 15 till 30 sekunder för 30 min:
   excitatjon vid 340 +/- 5 nm, emission detektion vid 510 +/- 40 nm
   excitation vid 380 +/- 5 nm, emission detektion vid 510 +/- 40 nm
   DIC (tillval)
   Obs: Respektive exponeringstiderna beror på intensiteten av exciteringsljuskällan. Tillfredsställande resultat erhålles när pixelintensiteterna 340 nm (380 nm) kanal uppgår till ca en fjärdedel (en halv) av den maximalt möjliga intensitetsvärdet. Kom ihåg att fura-2-värden exciteras vid 340 nm, kommer att öka och de exciteras vid 380 nm, kommer att minska vid T-cellaktivering.
6. 20-25 min in i körningen, tillsätt 50 till 100 | j, l av det förvärmda anti pMHC blockerande antikropp vid en slutkoncentration av 20-50 | j, g ^ml-1. Antikroppen mättar alla pMHCs och som en följd T-celler kommer att upphöra att känna igen antigenet och sluta mjukning kalcium. Fortsätt spela in bilder för en annan 5 -. 10 min att förvärva baslinje den intracellulära kalciumkoncentrationen, vilket motsvarar den icke-aktiverade tillståndet hos T-celler < / li>
7. Bestäm den genomsnittliga bakgrundsfluorescenssignalen vid 340 nm och 380 nm excitering inom ett område av intresse av åtminstone 1000 pixlar, som innehåller ingen cell. Bakgrund-subtrahera alla uppmätta fura-2 bilder exciteras vid 340 nm och 380 nm och beräkna 340 nm / 380 nm intensitetsförhållanden hos enskilda celler eller en grupp av celler. Normalisera intensitetsförhållanden genom att dividera alla förhållanden genom förhållandet mellan de fem sista tidsramar (dvs, med fullständig antikropps blockad av pMHC).
8. Plot normaliserad fura-2 förhållanden mot tiden. Obs: När celler och bilayers är i gott skick, fura-2 340 nm / 380 nm intensitetsförhållanden antar typiskt värden mellan 2 och 5, 15-45 sekunder efter celler har tagit kontakt med dubbelskiktet. Förhållanden släpp sedan till ett värde mellan 1,6 och 2, där de stannar konstant under åtminstone 20 minuter eller längre. Värden bör sjunka till 1 endast efter tillsatsen av anti-pMHC antikroppar. Ett typiskt exempel visas i fig 5.

"> 3. Bulk FRET Mätningar

3,1. TCR dekoration med H57scF _V

1. Centrifugera ner 10 ⁶ T-celler i en 5 ml polypropylen rundbottnad rör under 2 minuter vid 250 till 400 g.
2. Häll av media, knäpp cellpelleten försiktigt och tillsätt 0,3 pl av SCF _V (koncentration ~ 1 mg / ml) till cellsuspensionen. För bulk FRET mätningar anställer endast färgämnesmärkt scFv. För enda molekyl FRET mätningar använder en blandning av omärkt scFv (5 till 9 delar, innehåller ingen oparade cystein) och färgämnesmärkt scFv (1 del, innehåller en oparade färgämne kopplade cystein).
3. Inkubera cellerna på is under 15 minuter och tvätta cellerna två gånger genom successiv centrifugering med användning iskall imaging buffert.
   Anm: Celler kan lagras på is utan signifikant förlust av bundet _scFv (t _1/2 av _scFv dissociation vid 0 ° C ~ 4 h ^2). Renheten av primära T-celler härledda från TCR-transgena (och eventuellt även Rag-1/2 bristfällig möss) och stimulerades in vitro är högre än 98% sedan T-celler är de enda celler som förökar (upp till 7 celldelningar) som svar på peptiden, som har lagts till för stimulans till T-cellkulturen. B-celler genomgå apoptos och är inte längre är i livet efter 7-10 dagars odling. Några dendritiska celler överlever kan ännu inte lätt diskrimineras inte bara på grund av sin distinkta morfologi men också eftersom de inte binder H57 anti-TCR beta scFV fragment.

3.2. FRET mätning via givar återhämtning efter acceptor blekning

Obs: Kom ihåg att halveringstiden för TCR-H57 SCF _V komplex uppgår till 4 timmar på is, till 50 minuter vid 22,5 ° C och 6,8 minuter vid 37 ° C (och ca 4 timmar på is) ^2. Så länge H57 _scFv fungerar som FRET givare, mätt FRET avkastning är inte känslig för H57 _scFv dissociation, dock signalbrusförhållandet ökarmed ökad H57 dissociation.

1. Förbered en SLB innehållande AF647 / Cy5-märkta pMHCs samt omärkt ICAM-1 och B7 enligt Axmann et al., ^4.
2. Byt PBS av avbildningskammaren med bildgivande medium innehållande Hanks balanserade saltlösning plus kalcium / magnesium och 1% äggalbumin. För denna pipett 400 pl av avbildningsbuffert i brunnen, blanda försiktigt och avlägsna 400 pl från brunnen. Upprepa denna procedur 3-4 gånger. Utsätt inte SLB till luften när som helst.
3. Placera avbildning kammare på mikroskop scenen och justera fokus tills fluorescerande (AF647, Cy5) SLB kommer i fri sikt.
4. Konfigurera TIRF belysning genom att översätta den fokuserade strålen parallellt med den optiska axeln till periferin av målet s fokalplan genom flyttning av periskopet s translationell skede.
5. För att finjustera excitation laserstrålar i TIRF läge, lägga till T-celler dekorerade med AF555 / Cy3 märkt _scFv
6. Förvärva följande sex bilder i angiven ordning och i snabb följd (Figur 6):
   (i1, tillval) vitt ljus, för att ta en bild av cellen,
   (i2, tillval) 647 nm excitation (låg effekt) för att ta en bild av FRET mottagare (pMHC) före blekningspulsen,
   (i3) 514 nm excitation (låg effekt) för att ta en bild av FRET donator (TCR) före blekningspulsen,
   (i4) 647 nm excitation (hög effekt) till foto bleka FRET acceptor, /> (I5) 514 nm excitation (låg effekt) för att ta en bild av FRET-givare (TCR) efter blekmedelspulsen,
   (i6) 647 nm excitation (låg effekt) för att verifiera fullständig FRET acceptor blekning.
7. Håll tiden gick mellan bilderna (i3) och (i5) så korta som möjligt för att kunna korrelera bilderna för senare analys. Håll FRET-donator blekning vid ett minimum genom användning av excitation vid lägsta möjliga effektnivån, som fortfarande medger korrekt avbildning av T-cellerna.
8. Plocka ett område av intresse (ROI), t.ex., en hel synaps eller en enskild TCR microcluster, bestämma dess medelintensitet i (i3) (= _{I (3))} och i (i5) (= _{I (5)).} För bakgrundssubtraktion, välj en ROI av samma dimension utanför belysnings plats i (3) eller (5) och bestämma dess genomsnittliga intensitet _{(I (bakgrund)).} För att bestämma FRET avkastningen utföra följande operation:
   g "/> (ekvation 7)
   Anmärkning: Det bör noteras att i förhållande till det absoluta FRET nivå, kan det vara nödvändigt att korrigera för givar blekning mellan bilder (i5) och (i3).

3.3. FRET mätning via sensibiliserade utsläpp

1. Utför rumslig donator och acceptor kanal inriktning med användning av mångfärgade pärlor, som fluorescerar i alla utsläppskanaler. Den rumsliga förskjutning mellan de båda kanalerna på grund av kromatisk aberration kan bestämmas genom super placera enskilda pärlor och har som skall tillämpas för korrigering av en av de två kanalerna för alla följande 2-färgbild-par ^10.
2. Bestämma graden av donatorgenomblödning med hjälp av en SLB innehåller FRET donatorfluoroforen ensam. Det är även tänkbart att använda FRET-donator-märkta T-celler på ett lipiddubbelskikt med omärkt pMHC. Bakgrund bestäms först utanför den upplysta synfältet och därefter subtraheras från båda kanalerna. På detta sätt den genomsnittliga ba BAKGRUND korrigerade intensiteten hos två motsvarande ROI (I _givarkanal och jag _{Acceptor kanal)} bestäms. Beräkna genomblödning koefficient (BTC) på följande sätt:
   (ekvation 8)
   Obs: Denna BTC är en konstant för en viss färg och filter set-kombination.
3. Beräkna FRET donator genomblödning bilden enligt följande:
   (ekvation 9)
4. Bestäm acceptorn korsexcite genom excite en SLB innehållande FRET acceptorfluoroforen enbart (t.ex. IE ^{k /} MCC-Alexa Fluor 647) först med FRET-donator excitationsljus (t.ex.., 514 nm) och därefter med acceptor excitationsljus (t.ex. 647 nm). Använd bakgrundskorrigerad bilder inom FRET acceptor kanalen för att beräkna korsexciteringskoefficient (CEC) på följande sätt:
   ftp_upload / 53157 / 53157eq10.jpg "/> (ekvation 10)
5. Eftersom CEC beror på laserintensitet som används för givar excitation, avgöra det på varje mätning dag. Använd den resulterande CEC att beräkna bild enbart genereras genom kors excitation.
   (ekvation 11)
6. Beräkna FRET bilden korrigerad för genomblödning och kors excitation enligt följande:
   (ekvation 12)
   Obs: Absolut FRET-signal (men inte den relativa FRET utbyte) är känslig för dissociation av H57 _scFv från T-cellmembranbundet TCR. För att undvika överdriven förlust av TCR-FRET-sond, syftar till att utföra mätningar vid 37 ° C inom den första 2 min efter tillsatsen av T-celler för dubbelskiktet. Mätningar med kvantitativa (≥ 95%) TCR märkning endast möjlig vid eller under 22,5 ° C inom den första 3 min eftertillsats av T-celler till dubbelskiktet.

4. enda molekyl FRET mätningar

1. Justera effekten av båda lasrarna för att ge upphov till en intensitet av 1-5 kW / xm ² vid provet. För mer information hänvisas till Axmann et al. ^4.
2. Märknings T-celler såsom beskrivs ovan med en blandning av omärkt _scFv (5-9 delar) och Cy3 / AF555-märkt _scFv (1 del). Obs: Detta sätt bara en bråkdel av TCR är märkt med FRET-givare. Detta minskar antalet detekterbara interaktioner, men bullret från donator genomblödning också minskat kraftigt (med cirka 5 ^{1/2 till} 10 ^1/2), vilket är avgörande när avveckla enda molekyl FRET händelser.
   Obs! Dissociation av H57 scFV sonden från TCR inte påverka mätningarna, eftersom det förekommer i en mycket större tidsintervall (minuter till timmar) än dissociation av TCR från SLB-bundna pMHC (sub-sekund till sekundintervall).
3. Placera en SLB med AF647-märkta pMHCs liksom ICAM och B7 på mikroskop scenen och justera fokus så att dubbelskiktet kommer i fri sikt.
4. Valfritt: Sätt en slitsöppning in i exciteringsvägen (såsom visas i Axmann m fl ^4.) För att maskera den största delen av området för belysnings utom synapsen. På detta sätt oblekta IE ^k / MCC (C) -Alexa Fluor 647 FRET acceptormolekyler kan flytta in i området för belysning.
5. Lägg H57 _scFv dekorerade T-celler till dubbelskiktet (med avbildningsbuffert), och vänta tills synapser visas i synfältet.
6. Ta i snabb följd en sekvens av 10 till 20 bilduppsättningar med hjälp av 2-färg upptäckt:
   i1) excitation 514 nm
   i2) excitation 647 nm
7. Exponera bilder för 1 till 5 ms och skaffa som en uppsättning bilder.
8. För att bedöma identitet enda molekyl FRET händelser, tillämpa samma korrigering avseende donator genomblödning och acceptor tvär excitaning. Dessutom enda molekyl FRET händelser måste anpassa sig till enstaka acceptormolekyler och bör dyka upp och försvinna i ett steg (se även figur 7).
9. Off-hastighetsbestämning
   1. Spela spår av enda molekyl FRET händelser under flera förvärv tidsramar.
      Obs: I detta exempel (i kursiv stil) off-rate mellan 5c.c7 TCR och IE ^k / K3 mäts vid 25 ° C med fyra olika fördröjningstider (42 ms, 490 ms, 1007 msek, 1989 ms).
   2. Lista FRET spår enligt deras spårlängder såsom visas i tabell 1.
   3. Konvertera tabell 1 till en inversa kumulativa avklingningsfunktion (tabell 2) som visas (färgade siffror är hämtade från tabell 1).
   4. För att normalisera den resulterande avklingningsfunktion, dividera antalet av spår av tabell 2 med summan av alla spår i denna speciella grupp. Plotta de normaliserade värdena mot antalet tidsramar. När utelämna den sista tidsramen, som innehåller en nolla, kan de sönderfall läsasily utrustad med en enda exponentiell funktion (figur 8A).
   5. Som visas i figur 8B, rita väntevärdet <n (t _{eftersläpning)>,} dvs den negativa inversen av exponenten för avklingningsfunktion bestäms ovan mot fördröjningstiden t _{eftersläpning} som används (i detta exempel: x = t _{eftersläpning} = 0,042 s och y = <n (t _LAG)> = 1 / 0,662 = 1,511, x = 0,49 s och y = 1 / 0,902 = 1,101, x = 1.007 s och y = 1 / 1.131 = 0,884 x = 1.989 s och y = 1 / 1,591 = 0,629).
   6. Fit τ _{av och} <n _bleka> baserad på ekvation 3. Detta kan göras genom att använda en icke-linjär montering funktionen hos en vetenskaplig analys av data program som Origin.
      Obs: Den bästa passform som visas i detta exempel ger en τ _{bort av} 2,12 +/- 0,23 s och <n _bleka> 1,53 +/- 0,06 sek.
   7. Beräkna half livet av interaktionen t _{1/2 av med} t _{1/2 av} = τ _off • ln (2) (i det här exemplet: 1,47 s).
10. 2D-K _D bestämning
    1. Bestäm omvandlingsfaktorn C för den FRET-färgämne paret utnyttjas med användning av ekvation 6 och såsom beskrivits ovan (Figur 4A).
    2. Bestäm FRET avkastningen för enskilda TCR microclusters eller hela synapser (figurerna 3B och 5).
    3. Användning av ekvation 4 konvertera alla enskilda FRET ger till TCR occupancies (Figur 4C).
    4. Applicera ekvation 11 för att konvertera alla TCR occupancies i 2D-K _D s. Som anges nedan är inhomogen synaptic bindande. En meningsfull åtgärd för synaptiska K _D s är medianen (markerade med rött) av alla uppmätta microclusters (Figur 4D).
11. Beräkning av 2D-k _på s
    1. Beräkna k _{vidare med} lagen om massverkan med k _{on =} k _off / K _D och experimentellt bestämda k _off och K _D-värden.
       Obs: Den synaptiska _koff för experimentet visas i figur 4 (IE ^{k /} MCC interagerar med 5c.c7 TCR vid 25 ° C) är 0,41 s ^-1. Därav _Kd kurva (Figur 4D) kan omvandlas till ak _på tomt, såsom visas i fig 4E.

Representative Results

Inspelningen av intracellulärt kalcium via fura-2 kalciumfärgämne samt den efterföljande cellulär analys för att verifiera den stimulatoriska potens och därmed funktionalitet SLBs visas i figur 4. Såsom blir uppenbart, kalciumnivåerna stiger i T-celler (uttryckt som normaliserad fura-2 340 nm / 380 nm förhållande med baslinjen är 1) omedelbart så fort de sätter sig på de stimulerande SLBs. Kalciumnivåer återvänder till baslinjenivåer kort efter tillsats av en antikropp som blockerar pMHCs från TCR engagemang och som avslutar T-cellsaktivering.

Figur 6 avbildar ett typiskt experiment som involverar FRET donator återhämtning efter acceptor blekning, som användes för att mäta FRET utbyten och som tjänar till att beräkna 2D-K _D-värden (visad i figur 4). Observera ökningen i FRET givar intensitet, vilket motsvarar TCR märkt via AF555, efter snabb och fullständig ablation av FRET encceptor arter (här: AF647 associerad med pMHCs). Också uppenbart är den starka minskningen av FRET-kanalen, dvs., den FRET-acceptor-kanalen under FRET-donator excitation, efter FRET acceptor blekning. Den knappt synliga kvarvarande signal motsvarar FRET donator genomblödning. FRET utbyten inom enskilda TCR microclusters eller hela synapser beräknas utifrån de angivna uppmätta intensitetsvärdena (figur 6B).

Figur 7 visar en bana och time lapse av en enda molekyl FRET händelsen syns i två tidsramar. Som beskrivits ovan i inledningen sådant beteende orsakas av både sönderfall av synaptiska TCR-pMHC bindande och fotoblekning. Att skilja mellan dessa två bidrag, de experimentella förvärvstidsramar måste varieras i längd: medan fotoblekning förblir konstant, förändringar i FRET händelse bana längd endast orsakas av bindande kinetik. En kvantifiering av tracelengths, w hich utgör grunden för beräkningen av off hastigheter och blekning som visas i fig 7, är anordnade i tabellerna ett till 3.

Fastställande av 2D-K _D s kräver registrering av bulk FRET avkastningen för FRET-givar märkta TCRs. Med användningen av den experimentellt härledda konstanten C (Figur 4), kan en FRET Utvinningen som uppmättes för en TCR microcluster eller en hel synaps omvandlas till TCR inflyttning en, dvs., förhållandet mellan pMHC-engagerade och totala TCR (figur 4C) . Med kända pMHC densiteter närvarande på SLB före tillsats av T-cellen, kan appliceras en värden för att bestämma synaptiska 2D-K _D-värden (Figur 4D). On-priser kan beräknas med lagstiftningen i massverkan (2D-k _på = 2D-k _off / 2D-K _D) från den fastställda synaptiska off-rate och 2D-KD värden.

1 "src =" / filer / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk skiss över den plana glas stöds lipiddubbelskikt (SLB) -system. (A) SLBs består av POPC (90-99%) och den syntetiska lipid DGS Ni-NTA (1-10%) och bildas spontant när rena glasytor debiteras med små unilamellära vesiklar (SUV) som består av motsvarande lipider. (B) När den väl bildats, kan sådana SLBs funktionaliseras med lösliga polyhistidin-märkta extracellulära delar härledda från pMHCs, samstimulerande B7-1 proteiner och ICAM-1-vidhäftningsproteiner, för att tjäna som APC för T-celler. För mer information om att förbereda SLBs avser Axmann et al. ^4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figu re 2. Förster Resonance Energy Transfer-baserad analys att kvantifiera TCR-pMHC bindning in situ. (A) En kompositstruktur av en TCR komplexbunden med ett H57 enkelkedjig fragmentet ingrepp med en pMHC illustrerar FRET-baserade tillvägagångssätt beskrivs häri. Notera det korta avståndet på ca 41a skiljer de två motsvarande fluoroforema genomgår FRET. Acceptorställen för fluoroforen-maleimider anges i grönt och rött. (B) Principen för detektering TCR-pMHC interaktioner i situ illustreras. Endast _scFv -Dekorerade TCR och pMHCs (här IE ^k), som bildar specifika komplex, ge upphov till en mätbar FRET signal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"/>
Figur 3. Kromatogram för den slutliga gelfiltreringssteget ger upphov till monomera scFv _Vg och peptidladdade IE ^k -2x6H molekyler. X-axeln representerar retentionsvolymen i ml, Y-axlar indikerar absorbans vid 280 nm i godtyckliga enheter (AU) . (A) H57 _scFv platsspecifikt märkta med Alexa Fluor 555 maleimid utsattes för S75-kromatografi för att separera oreagerat färgämne från proteinet (steg 1.2.5). Fraktioner motsvarande behålla intervallet 14 till 15 ml (streckade linjer) representerar märkt mono H57 _scFv. (B) IE ^k -2x6H molekyler komplex med UV-klyvbara ANP-space hållare peptiden hade UV-bestrålas, odlades med platsspecifikt Alex 647 maleimid-märkt peptid och slutligen utsattes för S200 kromatografi för att separera proteinet från fri peptid (steg 1.1.2.4). Intervallet mellan de streckade linjerna innehåller korrekt vikta och mono pMHCs. (A, B) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Bestämning _2D-Kd s och 2D-k _på s. (A) Korrelationen mellan FRET utbyte som bestäms genom donator återhämtning efter acceptor blekning och TCR beläggning mättes experimentellt. TCR beläggning kan bestämmas för enskilda TCR microclusters som förklaras i avsnitt 4.2. En linjär anpassning av data visas av linjen är lika med förhållandet C mellan TCR vars lutningbeläggning och FRET-utbyte. C är en konstant som är specifik för FRET-systemet och fluoroforerna (här Cy3 och Cy5) användes. I detta exempel gav 1.988. (B) FRET uppgifter avkastnings bestämdes för enskilda TCR microclusters (N = 187, temperatur = 24 ° C) genom donator återvinning av acceptor blekning. Numren nedan histogram staplar visar den övre gränsen inom intervallet. (C) Omvandling av data som visas i (B) genom att multiplicera mätt FRET utbyten med konstanten C bestäms i (A). Siffrorna under staplarna visar den övre gränsen inom intervallet. (D) Histogram (semi-logaritmisk, bas = 4) som visar fördelningen av 2D-K _D s mätt för enskilda TCR microclusters. Median _2D-Kd indikeras i blått. Siffrorna under staplarna visar den övre gränsen inom intervallet. (E) Histogrammet visas i (D) omvandlades intoa 2D-k _på -histogram (semi-logaritmisk, bas = 4) som utnyttjar den synaptiska k _{off för} 24 ° C (0,41 s ^-1). Den bestämda median 2D-k _på värdet visas i blått. Data publicerades ursprungligen i et al. Huppa ² och visualiseras här i ett nytt format. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Funktionell validering av SLBs används för T-cellstimulering och bildbehandling. (A) TCR-transgena T-cellblaster innefattande fura-2 konfronterades med stimulatorisk SLB hysande antigena pMHCs, ICAM-1 och B-7. Cellular fura-2 utsläpp upphetsad vid 340 nm och 380 nm samt DIC bilderna sparas. Såsom indikeras, förhållandevärden av de utsläppsintensitet exciteras vid 340 och 380 nm visas i den högra panelen. Tillsats av pMHC blockerande antikroppar 14 min in i experimentkörning resulterade i en minskning av intracellulära kalciumnivåer kan jämföras med den hos vilande T-celler. (B) En typisk tids profil genomsnittliga fura-2 förhållanden i T-celler i kontakt stimulerande SLBs kännetecknas genom en en initial ökning av intracellulärt kalcium som är 2 till 4 gånger högre jämfört med den hos icke-aktiverade T-celler eller T-celler som berövats antigen efter antikroppsmedierad blockad. Gröna cirklarna anger tidpunkter som visas i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Bulk FRET avkastning mätt genom FRET givar återhämtning efter FRET acceptor blekning. et al ^4). Linjen som visas i den vänstra DIC bilden anger gränsen för T-cells synaps. Notera förlusten i intensitet inom FRET acceptor kanalen samt är ökningen i intensitet i FRET-donator kanalen efter FRET acceptor bleknings (steg 4). (B) FRET effektivitetsvinster kan kvantifieras enligt vad som anges för enskilda synaptiska regioner eller för hela synapser. För inspektion, är bilder före och efter FRET acceptor blekning visas med hjälp av två uppslagstabeller (LUT, grönt och fysik). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. enda molekyl FRET händelser dyka upp och försvinna insingle steg och är perfekt i linje med en enda FRET acceptorfluorofor. Tiden för enda molekyl FRET händelsen visas. Bilder förvärvades med hjälp av en back-belyst EMCCD kamera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8. Fastställande τ _off = 1 / k _bort från uppmätta smFRET banor. (A) De normaliserade kumulativa summor observerbara FRET signaler (härledda från H57 _scFv -AF555 dekorerade 5c.c7 TCR transgena T-cellblaster erkänna IE <sup> k / K3-AF647 vid 24 ° C) under fyra olika tids fördröjningar (42 ms, 490 ms, 1007 msek, 1989 msek) plottades som en funktion av det totala antalet observationer. Mono-exponentiell fit funktioner ger upphov till motsvarande negativ inversen av väntevärdena <n (t _LAG)>. (B) väntevärden avsattes mot förseningar t _{eftersläpning} och monteras med ekvation <n (t _lag)> = τ _off / {(x _av / <n _bleka>) + t _{eftersläpning}} att ge τ _{av och} <n _bleka>. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Mätt protein-protein interaktioner in situ är mycket önskvärt, särskilt när det handlar om låg affinitet interaktioner såsom TCR-pMHC-bindning ^11. Detta beror på att på-hastighet samt stabiliteten hos sådana interaktioner avsevärt påverkas av de speciella omständigheter under vilka bindning sker. Minimal invasiva FRET-baserad avbildning är således i princip perfekt lämpade för sådana uppgifter, men ändå innebära ett antal hinder som först måste övervinnas. Buller som genereras av cellulär autofluorescens begränsar känsligheten av mätningarna och bör därför hållas på ett minimum. TIRF mikroskopi tjänar detta behov mycket väl ¹² men kräver funktionalisering av glas diabilder, helst i form av en plan glas stöds lipiddubbelskikt dekorerad med proteiner av val ^13-15. En annan fördel med en delvis reconstitutive strategi är att rekombinanta tvåskiktsmembran bosatt FRET partners kan vara mycket mmalm lätt märkt på ett kvantitativt, platsspecifika och rationellt sätt med mindre och ljusare fluoroforer än vad som skulle vara möjligt med cell ytuttryckta proteiner. TCR är märkta med rekombinant scFv _V s, som inte påverkar T-celligenkänning, som testades tidigare ^två. Dessutom proteinkompositionen av SLB, exempelvis densiteten hos pMHCs och valet av accessoriska faktorer kan anpassas till sina specifika behov. Vi har tidigare utfört experiment med varierande densiteter stimulerande pMHCs, men har inte upptäckt signifikanta skillnader i 2D-k _off och 2D-K _D ^2.

Hittills här erkännandet av MHC klass Il-molekyler har behandlats med enbart, främst på grund av arten av deras peptidbindande klyftan, som är öppen i båda ändar och därmed rymmer större peptider, inklusive en länk för fluorofor fastsättning. I vissa fall sådant tillvägagångssätt kan också fungera för märkning MHC class I molekyler ¹⁶ men stor försiktighet bör vidtas för att kontrollera deras användning i försök. Känsligheten hos T-celler mot antigener, som kan mätas via T-cellproliferationsanalyser, liksom pMHC-TCR-bindande kinetik mätt in vitro genom ytplasmonresonans bör inte påverkas av tillsats av linkern och fluoroforen till peptiden. Alternativt kan MHC klass I-molekyler sig märkas på ett sätesspecifikt sätt med införandet av en oparad cystein inom sekvensen av den tunga kedjan (opublicerade observationer).

Med användning av lämpliga molekylära prober kan i princip studeras någon synaptisk interaktion protein-protein i en mode som beskrivs häri. Sådana prober, t.ex. bör _scFv s eller Skapat ankyrin upprepningsproteiner (DARPins) ^17, vara monovalent och bör binda sitt mål stabilt utan att påverka interaktionen av intresse. Naturligtvis strukturell INFORMATIOn är mycket önskvärt för rationell sond design men inte absolut nödvändigt. Vid upprättandet av ett par nya FRET partners, är det rekommenderat att registrera och analysera FRET i bulk först. Platser av etikettfäst kan varieras avsevärt för att maximera FRET signalen och även för att verifiera att mätta FRET avkastningen skiljer sig åt beroende på inter-dye avstånd. När systemet är optimerat, enda molekyl FRET signaler kan registreras genom att begränsa märkning av den höga överflöd FRET partner till 10-30% och blekning den låga förekomsten FRET partner tills enskilda molekyler är upplösningen på området för belysning.

Sist men inte minst det bör noteras att SLBs approximera några men inte alla aspekter av en fysiologisk plasmamembranet. Egenskaper som membran krökning och flexibilitet, domän uppdelning, cytoskelettala omflyttningar och cellmotilitet samt en hög mängd ytuttryckta membranproteiner är inte företräds av SLBs men kan påverka than bearbeta under utredning. Stora ansträngningar kommer att behöva investeras för att skapa avbildningsmetoder som tillåter övervakning protein-proteininteraktioner med enda molekyl upplösning i fysiologiska synapser, som är oåtkomliga för TIRF avbildning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Sf900 II	Life Technologies	10227402	insect cell media for baculo virus production
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)	Fisher Scientific	10564038	insect cell media for baculo virus expression
Sf9 cells	Life Technologies	11496-015	cells for virus production and expansion
High Five Cells	Life Technologies	B855-02	cells for potein expression
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Centramate System	Pall		protein concentartion from large volumes
Centramate cassette 10kDa cutoff	Pall	OS010T12	protein concentartion from large volumes
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC900308	protein concentartion
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC800308	protein concentartion
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL	EMD Millipore	5123	protein concentartion
Äkta pure 25L	GE Healthcare	29-0182-24	protein purification
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17-5175-01	protein purification
Superdex 75 10/300 GL	GE Healthcare	17-5174-01	protein purification
Mono Q 5/50GL	GE Healthcare	17-5166-01	protein purification
Ni Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-01	protein purification
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Cy3 maleimide	GE Healthcare	PA23031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Cy5 maleimide	GE Healthcare	PA25031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20347	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Fura-2, AM, cell permeant	Life Technologies	F-1221	calcium-sensitive dye for cell labeling
dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	151874	for dissolving fura-2 am
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium	Fisher Scientific	10225362	imaging buffer
PBS	Life Technologies	14190-136
Bovine Serum Albumin lyophilized powder	Sigma Aldrich	A2153	supplement for imaging buffer
14-4-4S antibody	affimetrix eBioscience	14-5980-81	blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)
5 ml polypropylene round-bottom tube	Becton Dickinson	FALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit	EMD Millipore	UFC30GV0S
Syringe filter 0.2µm	Millipore	GVWP04700
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Life technologies	T-7279
Microscope for fura-2-based calcium measurements	LEICA	DMI4000B
Microscope for (single molecule) FRET measurements	LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS	for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
planar supported lipid bilayers		for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
RPMI 1640, with L-Glutamine	Life Technologies	11554416	T-cell media
non-essential amino acid 100X	Hyclone	SH30238.01	T-cell media supplement
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x	Life Technologies	12000226	T-cell media supplement
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	T-cell media supplement
mouse interleukin-2 recombinant protein	BPS Bioscience	90185-B	T-cell media supplement
Research Grade Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160.03	T-cell media supplement
Origin (analysis program)	OrigenLab	http://www.originlab.com/	non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])