Summary
قنوات لنقل جزيئات الماء في أنزيمات تؤثر اذابة موقع نشط والحفز. هنا نقدم بروتوكول للهندسة هذه الدوافع التحفيزية إضافية استنادا في النمذجة الحاسوبية سيليكون والتجارب. وهذا يعزز فهمنا للتأثير ديناميات المذيبات في إنزيم الحفز.
Introduction
يشكل الماء حجر الزاوية للكيمياء الحياة 1. أنماط المياه واذابة من المواقع المفعلة انزيم تؤثر على كل من المحتوى الحراري والكون من يجند ملزم 1،2 و 3 الحفز بطريقة معقدة للغاية تتجاوز تأثير مسعور 2،3. NMR 4، الكالوري 2 والنمذجة الجزيئية للبروتينات الإذابة بالإكترونات تم استخدامها لتسليط الضوء على دور جزيئات الماء واضحة في توفير القوة الدافعة للجمعية يجند 5-8 والنوعية والنشاط 2،9،10. هنا نقدم منهجية فريدة من نوعها لتقييم تجريبي لأثر الترموديناميكيه النزوح المذيبات في إنزيم الحفز (الشكل 1). ويستند استراتيجيتنا مجتمعة على استخدام المحاكاة الحاسوبية بالتنسيق مع الهندسة انزيم وتحليل الترموديناميكيه (الشكل 1). وهذا يسمح لتسليط الضوء إضافيا على تأثير ديناميات المذيبات على نحو الأرضتحلل، والتي حاليا غير مفهومة.
استقرار التفاعلات enthalpic، المقدمة من السندات الهيدروجين بوساطة المياه في المواقع المفعلة انزيم الإذابة بالإكترونات، يمكن أن يقابله العقوبات التدهور الحتمي 1. وترتبط هذه التكاليف التدهور الحتمي مع انخفاض في درجات الحرية المعروضة من قبل جزيئات المياه المحصورة داخل تجاويف البروتين، بالمقارنة مع المياه بكميات كبيرة 5. وبالتالي يمكن الافراج عن جزيئات الماء أمر توفير القوة الدافعة التدهور الحتمي للجمعية يجند 1 والحفز 3. أحد الجوانب الرئيسية لديناميات المذيبات هو النزوح من جزيئات الماء بين المناطق الداخلية من البروتينات ومذيب الخارجي 4. ليست مفهومة التغيرات المصاحبة في طاقة التنشيط، المحتوى الحراري، والكون 11 تماما على المستوى الجزيئي. عن طريق عرقلة الأنفاق الفردية المسؤولة عن نقل المياه في الإنزيمات، وأهمية ديناميات المذيبات ومساهمتها في تفعيلالطاقة يمكن تقييم (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، من خلال أداء وعاء واحد التجارب الحركية عند درجات حرارة مختلفة، ويمكن استخراج المعلمات تفعيل الثرموديناميكيه النسبية لعدة ركائز من عدد محدود من التجارب (الشكل 1، يمين). يتم التحقق من صحة منهجنا متعدد التخصصات لالمعقدة بغشاء الانزيمات تريتيربيني محلقة التي تولد تربين متعددة الحلقات ذات أهمية كبيرة للحياة 12. بروتوكول يسمح لاسترداد كميات عالية من البروتين غشاء (10-20 ملغ / L) باستخدام جهاز للطرد المركزي القياسية.
على الرغم من الأنزيمات تطورت في الماء، وعادة ما أهملت دور المذيب في تعزيز الحفز. بالإضافة إلى ديناميات البروتين 13،14 هذا الشكل قبل تنظيم المواقع المفعلة مع التكامل الكهربائي إلى الحالة الانتقالية 15، يمكن أن ديناميات المياه تكون ذات أهمية عالية لكفاءة الحفز الانزيم. من خلال إقامة العديد من التقنيات متعددة التخصصات، لديناالهدف هو تسهيل دراسة معقدة للغاية من ديناميات المياه والديناميكا الحرارية. وجعل هذه الأدوات في متناول المجتمع العلمي يؤدي إلى تطوير استراتيجيات جديدة في الهندسة والتصميم انزيم البروتين للأنشطة المعدلة وخصوصياتها.
Protocol
النمذجة 1. في السيليكون الحاسوب
- تحميل هيكل PDB من البروتين من الفائدة من البنك بيانات البروتين (PDB). إعداد الهيكل عن طريق إزالة مفارز الزائدة ثم إضافة ذرات الهيدروجين في عداد المفقودين والمذيبات صريح باستخدام "تحييد خلية وص K التنبؤ" التجربة في YASARA 16. لغشاء ملزمة cyclases تريتيربيني، أبعاد مناسبة من مربع المياه هي 91x67x77 Å. ضبط حالة protonation من الأحماض الأمينية النشطة حفاز يدويا.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، التناظرية الركيزة في ملف PDB يمكن تعديلها لركيزة حقيقية باستخدام "تحرير | مبادله | أتوم" القيادة. - تقليل الهيكل بواسطة الأمر "الطاقة التقليل إلى أدنى حد" باستخدام القوة AMBER الحقل جناح 17. استخدام ايوالد نهج شبكة الجسيمات (PME) 18 لحساب بعيدة المدى التفاعلات كهرباء. ضبط قطع لفان دير فال التفاعلات وفقاإلى الإعدادات القياسية.
ملاحظة: "الطاقة التقليل إلى أدنى حد" القيادة يزيل التوتر بتكوين قبل فترة قصيرة أشد تقليل النسب، ثم محاكاة الصلب (خطوة زمنية 2 fsec، سرعات ذرة تقليصها بنسبة 0.9 في كل خطوة ال 10) يتم تنفيذ حتى يتم التوصل إلى تقارب (أي تحسين الطاقة قبل أقل من 0،012 سعر حراري / مول في الذرة خلال 200 الخطوات).
2. نموذج من موقع نشط اذابة وصول المياه
- بعد محاكاة الصلب، تشغيل 20 الديناميات الجزيئية NSEC (MD) مسار وتوليد لا يقل عن 10 لقطات من "ملف | حفظ باسم | محاكاة لقطة" الأمر متبوعا "محاكاة على". تشغيل المحاكاة على الكمبيوتر القياسية الدوري الحدود مع الظروف تحت الفرقة الكنسي. الحفاظ على درجة حرارة 298 K باستخدام الحرارة Berendsen.
- إعداد لقطات تم الحصول عليها من 2.1 عن طريق حذف كل جزيئات الماء وبروابط نهاية المطاف / ركائز باستخدام(4)؛ تحرير | حذف | بقايا "القيادة Superpose كل لقطة على حدة على الأصلي PDB هيكل من قبل." Superpose | وجوه "القيادة لضمان أن جميع الهياكل تتقاسم موقف المكاني نفسه حفظ كل لقطة أعد بهذه الطريقة بمثابة PDB الجديد. -file (باستخدام "ملف | حفظ باسم | PDB" الأوامر).
ملاحظة: للحصول على النماذج ذوي الخبرة: كتابة السيناريو لأتمتة هذه العملية وفقا للنموذج الوارد في القانون التكميلي ملف 1. - استخدام لقطات مستعدة (PDB) من 2.2 التي تم الانحياز في 3D الفضاء كمدخلات لبرنامج CAVER 3.0 19. لتحليل عدد محدود من لقطات، تشغيل CAVER على جهاز كمبيوتر قياسي. استخدام دائرة نصف قطرها التحقيق من 0.7 Å 19 لضمان الكشف عن الأنفاق التي هي محددة لنقل جزيئات الماء.
- تصور الأنفاق التي تم إنشاؤها بواسطة CAVER 3.0 في برامج الرسومات الجزيئي. التصور سهل من الأنفاق، استخدام الماكرو هو مبين في التكميلية رمز الفيله 2.
3. في السيليكون أنزيم الهندسة تعديل أنماط المياه وحيوية المياه
- تحديد الأنفاق أعلى مرتبة وفقا لرأس "ID" المدرجة في ملف الإخراج "summary.txt" ولدت من CAVER 3.0 البرمجيات.
- تحديد الأحماض الأمينية بطانة الأنفاق أعلى مرتبة (3.1)، وأنه عرض سلسلة جانبية صغيرة لافتا نحو الداخل القناة عن طريق التفتيش البصري (باستخدام نموذج تم الحصول عليها من 2.4). تحديد بدائل واحدة من الأحماض الأمينية التي من شأنها عرقلة النفق عن طريق زيادة عائق الفراغية باستخدام الأمر "بقايا جسم". تحقق من أن النفق عرقلة من قبل الفحص البصري، ثم بتكرار الخطوات 1،2-3،1 البروتوكول.
4. التعبير عن الجين المتحول
- إدخال طفرات في البرية من نوع الجين عن طريق الطفرات PCR باستخدام غير متداخلة الاشعال 20.
- إضافة DNA البلازميد التي تحتوي على الجين التي تهم أنبوبالصورة مع الخلايا المختصة من سلالة الاستنساخ مناسبة واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. إجراء تحول الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في حمام مائي مع درجة الحرارة لتعيين 42 ° C. إضافة 500 ميكرولتر من وسيلة غنية جديدة (2YT، 16 ز / L تريبتون، 10 جرام / لتر خلاصة الخميرة، 5 ز / L كلوريد الصوديوم)، واحتضان عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة. جعل الاختيار عن طريق طلاء الخلايا تحولت على لوحات أجار تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة.
- بعد التأكد من تسلسل الحمض النووي للالجين المتحور، وتحويل DNA البلازميد الى سلالة التعبير باستخدام الصدمة الحرارية كما هو موضح أعلاه. للتعبير عن غشاء ملزمة cyclases تريتيربيني، استخدم BL21 (DE3).
- بدء 5 مل O / N الثقافة عند 37 درجة مئوية من سلالة التعبير في 2YT وسائل الإعلام تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة.
- تطعيم 2 L هزة حيرة قارورة، يحتوي على 300 مل 2YT وسائل الإعلام تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة، إلى OD النهائي من 0،05-0،09 (تقاس في 600 نانومتر). بعد الاستقراء في لOD من 0،6-0.8 والبروتين التعبير، وتجميد بيليه الخلية وتخزينها في -80 ° C.
- لcyclases تريتيربيني بغشاء في ناقلات pD861، لحث مع 0،5-2 رامنوز ملم و 4 ساعة التعبير عند 37 درجة مئوية إلى تحقيق عوائد عالية من البروتين 21.
5. غشاء استخراج باستخدام عادي الطرد المركزي وتنقية البروتين
- إعداد المخازن المؤقتة التالية: العازلة إعادة تعليق (100 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.5 تستكمل مع مثبط البروتياز أقراص)، منظفات عازلة (1٪ (V / V) تريتون X-100، 50 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.5) ورد فعل العازلة (0.2 ٪ تريتون X-100، 50 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.5).
- لcyclases السكوالين-hopene أو غيرها من إنزيمات مرتبطة بالغشاء مع انخفاض الرقم الهيدروجيني الأمثل، استبدال الفوسفات والبوتاسيوم في المنطقة العازلة إعادة تعليق مع سترات. لهذه الإنزيمات استخدام المخازن المؤقتة التالية: منظفات عازلة (1٪ تريتون X-100، 60 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 6.0) ورد فعل العازلة (0.2٪ تريتون-X 100، 60 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 6.0).
ملاحظة: إذا تم استخدام صاحب العلامة لتنقية، تكملة العازلة إعادة تعليق مع 20 ملي إميدازول (تركيز النهائي).
- لcyclases السكوالين-hopene أو غيرها من إنزيمات مرتبطة بالغشاء مع انخفاض الرقم الهيدروجيني الأمثل، استبدال الفوسفات والبوتاسيوم في المنطقة العازلة إعادة تعليق مع سترات. لهذه الإنزيمات استخدام المخازن المؤقتة التالية: منظفات عازلة (1٪ تريتون X-100، 60 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 6.0) ورد فعل العازلة (0.2٪ تريتون-X 100، 60 ملي سيترات، ودرجة الحموضة 6.0).
- تزن بيليه الخلايا المجمدة في كوب زجاجي. resuspend الخلايا في المخزن إعادة تعليق باستخدام الخالط إلى تركيز النهائي من 0.3 غرام خلية / مل. ليز الخلايا معلق من قبل ultrasonication مع اتساع 80٪ ونبضة من 1 ثانية على و1 ثانية قبالة. استخدام ثلاث دورات تكرار من 50 ثانية لكل منهما.
- إضافة العازلة المنظفات لتركيز النهائي من 0.2٪ (ت / ت) المنظفات. تتوازن مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. استرداد جزء بروتين الغشاء عن طريق حفظ طاف بعد خطوة واحدة الطرد المركزي في 39000 x ج لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إذا تم استخدام تنقية صاحب العلامة، إضافة حوالي 1.5 مل ني NTA الاغاروز خلية / ز واحتضان لمدة 1 ساعة. - إجراء تنقية الأولىخطوة إما التبادل الأيوني أو تنقية 21 صاحب العلامة. تكملة موازنة وشطف مخازن مع 0.2٪ تريتون X-100. تركيز البروتين المنقى خمس مرات باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع قطع من 10 كيلو دالتون.
ملاحظة: حجم المذيلات النتائج تريتون X-100 في تركيز المنظفات لتركيز النهائي من ما يقرب من 1٪. - وضع اللمسات الأخيرة تنقية قبل تلميع خطوة الترشيح الجل باستخدام البروتين المركز ومصفوفة متوافق مع مجموعة التجزئة للبروتينات كروية من 2 × 10 4 -8 × 10 6 استخدم العازلة رد فعل كما يعمل العازلة. قياس كمية البروتين النقي باستخدام الترا عدة برادفورد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
6. حركية
- جعل 5 ملي حل الأسهم جديدة من الركيزة في رد فعل العازلة. الحصول على مستحلب متجانس من قبل ultrasonication في 30٪ السعة لمدة 2-5 دقيقة.
- تتوازن على thermomixerفي درجة حرارة التفاعل المطلوب. التحقق من درجة الحرارة داخل المياه التي تحتوي على قنينة زجاجية عن طريق الحرارة الخارجية.
- لحركية واحدة الركيزة، وتمييع الركيزة مستحلب إلى خمسة على الأقل قوارير الزجاج إلى نفس تركيز الركيزة النهائية.
- لوعاء واحد حركية نسبية مع ركائز متعددة، وإعداد ما لا يقل عن خمس قوارير زجاجية متطابقة عن طريق خلط جميع ركائز في كل قارورة. لالتربينات مسعور، استخدام تركيزات الركيزة النهائية في حدود 10-200 ميكرومتر.
- يحضن مسبقا على قارورة زجاجية في thermomixer لمدة 10 دقيقة. بدء رد فعل عن طريق إضافة الانزيم. A حجم رد الفعل الكلي لل1 مل هو مناسب. استخدام سرعة اهتزاز 1200 على الأقل دورة في الدقيقة.
- وقف ردود الفعل عند نقاط زمنية مختلفة من خلال إضافة 500 ميكرولتر ethylacetate ارتفعت بنسبة 100 ميكرومتر decanol كمعيار التكامل.
7. استخراج وتحليل الديناميكا الحرارية
- استخراج مخاليط رد فعل من قبلvortexing لوتهز يدويا قوارير الزجاج بقوة لمدة 1 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي قوارير الزجاج في 9600 x ج في أعلى الجدول الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في RT. نقل الطبقة العليا (المرحلة العضوية) إلى أنبوب فارغ. إضافة 500 ميكرولتر إضافية لاستخراج مذيب للأنابيب رد فعل وتكرار الإجراء الاستخراج.
- تجفيف مخاليط رد فعل المستخرجة مع نا 2 SO 4. دوامة لمدة 5 ثوان، والسماح للأنابيب راحة لمدة 10 دقيقة. أداء خطوة الطرد المركزي النهائية في 9600 x ج لمدة 1 دقيقة في RT باستخدام جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول. نقل العينات المستخرجة إلى اللوني للغاز (GC) قارورة.
- كرر الخطوات تحت 6،1-7،2 لكل متغير انزيم من الفائدة، وذلك باستخدام أربعة على الأقل تركيز مختلفة الأولي من الركيزة (لحركية الركيزة واحدة)، وأربع درجات حرارة مختلفة (لكل ركيزة واحدة وحركية تنافسية).
- أداء GC-التحليل كما هو موضح سابقا 3. استخدام عمود غير القطبية لتحليل hydrophobجيم المنتجات خماسي. ضبط درجة حرارة الفرن الأولية إلى 120 درجة مئوية واستخدام التدرج في درجة الحرارة من 5 ° C / دقيقة، اعتمادا على المنتجات والعمود.
- دمج مناطق الذروة من المنتج (ق) وتحويل مناطق ذروة المنتج في تركيزات المنتج المطابق من خلال الاستفادة من مساحة مستوى التكامل (الموافق 100 ميكرومتر). رسم تركيز كل منتج ([P]) مقابل وقت رد الفعل (ر). أداء الانحدار الخطي من نقاط البيانات المقابلة لتحويل أقل من 10٪. ونظرا لسرعة رد الفعل الأولية (V 0) من قبل المنحدر من خط المجهزة وفق ما يلي:
ملاحظة: للحصول على وعاء واحد حركية نسبية مع ركائز متعددة، V 0 هو المعدل الأولي ركيزة معينة تحت تأثير ركائز أخرى. - لحركية الركيزة واحدة، مؤامرة V 0 ك واضح القط / K M القيمة من خلال المنحدر من الخطية جزء من الرسم البياني فقا لما يلي:
[S] هو تركيز الركيزة و[E] تركيز انزيم المستخدمة في هذا التحول. ك القط / K M يعادل ثابت الحفاز على ثابت ميخائيل. تكرار التحليل لكل درجة الحرارة وكل متغير الانزيم. - لحركية الركيزة واحدة، وإجراء تحليل الحرارية وفقا لنظرية الحالة الانتقالية 22
ك ب هي بولتزمان ثابتة، ح ثابت بلانك، T درجة الحرارة في كلفن، وR ثابت الغازات. إجراء تحليل الانحدار الخطي للمؤامرة من قانون الجنسية ((K/ K M) / ((ك ب * T) / ح))) مقابل 1 / T. المحتوى الحراري تفعيل (Δ H ‡) يعطى عن طريق (-slope) * تعطى R والكون تفعيل (Δ S ‡) من خلال (التقاطع) * R.
ملاحظة: وبالمثل، تحليلا تحت تشبع تركيز الركيزة يمكن القيام بها باستخدام ك القط كما معدل ثابت في المعادلة 3. - لوعاء واحد حركية نسبية مع ركائز متعددة، الحصول على نسبة واضحة
ك القط / القيم K M من 23:
(ك القط / K M) A / (ك القط / K M) B = V 0، A / V 0، B * [B] / [A] (4)
التي V 0، A يشير إلى معدل الأولي لالركيزة A في منافسة مع الركيزة B. - لوعاء واحد كي النسبيnetics مع ركائز متعددة، يجب الحصول على المعلمات الحرارية النسبية لتنشيط B، مقارنة كمرجع، عن طريق الانحدار غير الخطية:
- حساب المعلمات تفعيل المطلقة لالركيزة B من المحتوى الحراري تفعيل والكون مرجعية مجمع A:
Representative Results
هو متورط أهمية ديناميكية المياه في الأنزيمية polycyclization الحفز التي كتبها في تحليل سيليكون والتصور لاحق من الأنفاق الكشف عن (باستخدام البرنامج النصي في القانون التكميلي ملف 2). وعقب الباب 3 من البروتوكول، وجدت S168 لتكون "هوت سبوت" بقايا الأحماض الأمينية بطانة أحد الأنفاق في تريتيربيني محلقة الانزيم من Alicyclobacillus acidocaldarius (الشكل 1، وسط يسار). من خلال إدخال طفرة S168F في سيليكون، وعرقلة النفق كما رأينا عن طريق التفتيش البصري (الشكل 1، أسفل اليسار).
معدل التفاعل لتشكيل المنتجات المتعددة الحلقات المعروضة بواسطة انزيم تريتيربيني محلقة حساس للغاية لدرجة الحرارة (الشكل 2A). بعد بروتوكول (القسم 4-7)، وتبين أن الظاهر ك القط / K
من المعلمات الحركية تجريبيا، يتم إنشاؤها المؤامرات الثرموديناميكيه الخطية المعادلة 3 والقسم 6-7 من بروتوكول للحركية الركيزة واحدة (الشكل 2B) التالية. التغيرات الكبيرة جدا في الكون التنشيط والمحتوى الحراري لوحظت في المتغيرات إيواء الأنفاق منعت تعني دورا رئيسيا لديناميكية المياه في الترويج لسلسلة polycyclization (الشكل 2C، الحسابات على أساس الشكل 2B). علاوة على ذلك، المتغيرات مع عرض أنفاق المياه المتغيرة لتغيير طاقة جيبس الحرة للتنشيط (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡، الشكل 2B-C). على سبيل المثال، في 303 K النفق البديل S168F يعرض طاقة جيبس الحرة للتنشيط من 14 كيلو كالوري / مول مقابل 16 كيلو كالوري / مول للانزيم من النوع البري.
بعد بروتوكول في الباب 7، المعادلة 4 يسمح لحساب القيم القط / K M ك واضحا للركائز إضافية من وعاء واحد التجارب الحركية (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، مؤامرة الحرارية الخطية (الشكل 3B) يمكن بناؤها عن طريق تشغيل مقال المنافسة عند درجات حرارة مختلفة (المعادلة 5). قياسا إلى حركية الركيزة واحدة، والمحتوى الحراري تفعيل النسبي والانتروبي للركائز إضافية مقابل مجمع الاشارة هي readilيمكن الوصول إليها من اعتراض والمنحدر من الخطية ذ يناسب البيانات التجريبية. يمكن تقييم القيم المطلقة للمعلمات الحرارية من التنشيط من إضافة الحسابية باستخدام البيانات الحرارية المرتبطة مجمع المرجعية (معادلة 6). باستخدام بروتوكول هنا، ولدت تظهر النتائج بوضوح أن انزيم الغشاء مع المتغيرات عرض أنفاق المياه منعت المعلمات الحرارية تختلف اختلافا جوهريا من تفعيل للركائز من أحجام مختلفة (الشكل 3C).
الرقم ملخص بروتوكول 1.: في النمذجة الحاسوبية سيليكون وبالتنسيق مع تصميم تجريبي البروتين وتحليل الحرارية يسمح لفهم أفضل لتأثير ديناميات المذيبات على الحفز الانزيم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الثيرموديناميكية تفعيل النوع البري ونفق المتغيرات من حركية الركيزة واحدة. (A) ك الظاهري القط / القيم K M تم الحصول عليها من البيانات التجريبية وباستخدام معادلات 1 و 2. (B) تحليل الترموديناميكيه باستخدام نظرية الحالة الانتقالية وتناسب خطية من البيانات التجريبية للمعادلة 3. (C) الثيرموديناميكية تفعيل تحسب من المؤامرات في (B). ويرد الركيزة السكوالين prefolded مع السندات شكلت / كسر كخطوط منقطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
"1"> 
الرقم 3. المعايير الحرارية للتفعيل من النوع البري ونفق المتغيرات للركائز مختلفة. (A) ك النسبي القط / القيم K M تم الحصول عليها من حركية وعاء واحد باستخدام المعادلة 4. (B) المؤامرات الترموديناميكيه البيانات الحركية في مختلف درجات الحرارة باستخدام المعادلة 5. (C) معلمات الحرارية المطلقة التنشيط باستخدام المعادلة (6) وباستخدام السكوالين الركيزة في الشكل 2 كمرجع. يتم عرض السندات شكلت / كسر في ركائز كخطوط منقطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية في تحقيق جودة عالية البيانات الثرموديناميكيه التجريبية لالبرية من نوع الإنزيم الغشاء ونفق متغيرات هي: 1) توليد نموذج جهاز الكمبيوتر. 2) تنقية البروتينات متجانس. 3) أسهم الركيزة مستحلب. 4) السيطرة على درجة الحرارة خلال حركية. 5) استخراج مخاليط رد فعل باستخدام معيار الداخلية.
توليد نموذج جهاز الكمبيوتر مما يسهل إلى حد كبير عن طريق استخدام برنامج مع واجهة سهلة الاستخدام التي تدعم مجموعة متنوعة من المنصات. وبالتالي، يقوم هذا البروتوكول على YASARA النمذجة جناح 16 لجعل استراتيجيتنا الوصول حتى إلى النمذجة غير الخبراء. ينبغي من الناحية المثالية أن يستند نموذج حاسوبي لتحديد نفق المياه على التركيب البلوري للانزيم من الفائدة 24. لهذا الغرض، وثروة من هياكل الكريستال المتوفرة في بنك المعلومات بروتين مفيد جدا. في تجربتنا، جانبا رئيسيا في نجاح إعداد تيملوحات لتحديد النفق هو الحفاظ على المياه البلورات. ومن الأهمية المتساوية لاستخدام مربع انزيم الإذابة بالإكترونات عند تنفيذ ديناميات المحاكاة الجزيئية، والتي يمكن تشغيلها على جهاز الكمبيوتر العادي. ومحلقة تريتيربيني من Alicyclobacillus acidocaldarius مستقرة في المياه خلال المحاكاة MD 3. ومع ذلك، وحفظ المنظفات البلورات و / أو استخدام يقلد غشاء الخلية من شأنه ربما تكون هناك حاجة لإنزيمات يحتمل أن تكون غير مستقرة للسماح لمحاكاة MD طويلة. ومن المتوقع أن التركيب البلوري التقليل من الأهداف الصعبة للغاية يمكن ان توفر معرفة الآلية الهامة باستخدام بروتوكول، على الرغم من أن هذا لن التقاط الجوانب الديناميكية للتنظيم النفق.
CAVER 19 في الوضع الأساسي، مع واحد أو عدد محدود من لقطات كمدخل، يمكن استخدامها من قبل غير الخبراء على جهاز كمبيوتر محمول قياسي. بناء على خبرتنا 3 والأنفاق مع دائرة نصف قطرها عنق الزجاجة (أي نصف قطرهافي النقطة الأكثر الضيقة) أصغر من 1 Å يمكن أن تكون ذات أهمية كبيرة للمياه، وخاصة إذا كان يوجد جزيئات الماء البلورات داخل النفق وتوقع (الشكل 1، وسط يسار). من ناحية أخرى، يمكن لدائرة نصف قطرها أكبر عنق الزجاجة يعني نفق لنقل الركيزة في والخروج من موقع نشط 10. البرنامج النصي في القانون التكميلي ملف 2 يمكن استخدامها من قبل غير الخبراء لتصور الأنفاق المتوقعة. والتجارب في المستقبل تكشف ما إذا كانت نماذج التماثل ستكون عالية بما فيه الكفاية قرار للسماح لدراسة يملك ثرواتها فئات من شبكات المياه وديناميكية. تسليط الضوء على كيفية أداء ديناميات المحاكاة الجزيئية، مع وبدون يجند موجودة في موقع نشط، يؤثر فإن عملية تحديد نفق أيضا أن تكون ذات أهمية.
يمكن حركية بروتينات الغشاء يشكل تحديا هائلا 25. بروتوكول هنا يستند إلى بروتوكول استخراج غشاء بسيطللحصول على انزيم غشاء من دون استخدام معدات باهظة الثمن، مثل نابذة فائقة السرعة. استخدام هلام الترشيح كخطوة تلميع النهائية يزيل الجزيئات المحتملة الغشاء المتبقية ويسمح لتحديد بيئة المنظفات المناسبة 25.
أحد الجوانب الرئيسية في تحقيق نتائج الحركية استنساخه من البروتوكول هو لاستحلب محلول المخزون الركيزة التي ultrasonication. vortexing لبسيط من ركائز مسعور المخفف في المخزن المؤقت رد فعل غير متجانسة يعطي خليط من الركيزة المنظفات. وpipetting لحلول الركيزة غير مستحلب يؤدي إلى تركيزات irreproducible (أكدته GC الكمي)، مما يحول دون تحديد دقيق لمعدلات الأولية. في المقابل، يتعين على pipetting لحلول الأسهم مستحلب بشكل صحيح يؤدي في تحليل الانحدار الخطي من المعدلات الأولية مع R 2 في نطاق 0،98-0،99. جانب آخر مهم من ركائز مسعور هو الركيزة الذوبان واضحوتوفر في مخاليط الركيزة المنظفات. في الواقع، لم يكن من الممكن لتشبع محلقة تريتيربيني مع السكوالين الركيزة المرجعية. لهذا السبب واضح ك القط / يتم عرض القيم K M هنا التي يمكن أن تحتوي على مساهمات من الملزمة والكيمياء. ومع ذلك، فقد تبين أن الكيمياء هو معدل الحد لك القط / K M لسلسلة polycyclization أجرته cyclases تريتيربيني 3.
ومن الأهمية العالية للتحقق من درجة الحرارة الفعلية داخل قارورة زجاجية رد فعل مع الحرارة الخارجية. ومع ذلك، يمكن أن يناسب الخطية يكون الأكثر فقرا للمتغيرات مع ثابت أساسي ك واضح القط / القيم K M عند درجات حرارة مختلفة. وأكد هذا للالبديل S168F هنا (الشكل 2A) مع المحتوى الحراري تفعيل قريبة من الصفر (الشكل 2B و2C). األصغر جداتغييرات لتر درجة الحرارة التي تعتمد في الظاهر ك القط / K M، يمكن أن يفضي عدم اليقين في الكون تفعيل احظ Δ S ‡ (أي اعتراض في المؤامرات الخطية في الشكل 2B). من حيث المبدأ، ويمكن أيضا أن تتأثر تفعيل الكون المرصود من قبل وفرة مختلفة من الانزيمات النشطة للمتغيرات المختلفة، والتي لن يتم الكشف عن طريق قياس تركيز البروتين. ومن المتوقع أن الأخطاء التجريبية يتم تخفيض عند خلط عدة ركائز في بوتقة واحدة. وذلك لأن جميع ركائز مختلفة تتفاعل مع نفس كمية الانزيم في ظل هذه الظروف (المعادلة 4). استخدام مذيب استخراج ارتفع مع المعيار الداخلي هو المهم مراعاة الفروق أثناء استخراج و / أو GC-الحقن.
وقد استخدم نظرية الحالة الانتقالية بنجاح في علم الإنزيمات 26. هذا الإطار النظري المهم كان دي أصلاveloped لردود الفعل unimolecular في الطور الغازي. ومع ذلك، فقد تبين أن الأنزيمات تعمل أساسا عن طريق خفض حاجز طاقة التنشيط الكلاسيكي 26. معامل انتقال يفترض أن تكون هنا يمكن للمرء أن يؤثر على المحتوى الحراري تفعيل قياس و / أو الكون. مساهمة نفق، وغيرها من الآثار غير التقليدية مثل recrossing الدولة تمر بمرحلة انتقالية، يمكن أن يسهم ما يقرب من 1000 أضعاف إلى 26 الحفز المقابلة لحوالي 4 كيلو كالوري / مول في مجال الطاقة. ويمكن ملاحظة أن الكون تفعيل عرض من النوع البري انزيم (16 كيلو كالوري / مول في 328 K، الشكل 2C) هو أكبر بكثير من هذه الآثار غير التقليدية الناجمة عن معامل انتقال غير موحدة. تأثير معامل انتقال يجب أن تنخفض عند المقارنة بين المعلمات الحرارية من التنشيط لنوع ونفق البرية المتغيرات باستخدام بروتوكول.
طاقة جيبس الحرة للتنشيط (Δ G ‡) هو كومبوالحوار الاقتصادي الاستراتيجي من كل من enthalpic (Δ H ‡) والتدهور الحتمي (- T * Δ S ‡) المدى. إعادة تنظيم المذيبات في الإنزيمات خلال الحفز يمكن أن تؤثر في كل من المعلمات. ومن المتوقع أن تيسير دراسة هذه الظواهر عن طريق تجميع الأدوات من الأدوات الحاسوبية ذات الصلة وسهلة الاستعمال في سيليكون مع الإطار التجريبي الفيزيائية الحيوية اللازمة في هذا البروتوكول. ومن المتوقع طريقة لتكون مفيدة لدراسة عدد كبير من العمليات الأنزيمية، بما في ذلك الحفز بواسطة إنزيمات مرتبطة بالغشاء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
| CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
| Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
| Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |
References
- Ball, P. Water as an active constituent in cell biology. Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).
- Snyder, P. W., et al. Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).
- Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).
- Persson, F., Halle, B. Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR. J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).
- Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).
- Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization. J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).
- Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38α MAP kinase inhibitors. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).
- Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).
- Matsuoka, S., et al. Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein. Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).
- Pavlova, M., et al. Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate. Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).
- Breiten, B., et al. Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).
- Oldfield, E., Lin, F. Y.
- Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
- Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. Protein activity regulation by conformational entropy. Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).
- Warshel, A. Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).
- Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).
- Duan, Y., et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations. J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).
- Essmann, U., et al. A smooth particle mesh Ewald method. J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).
- Chovancova, E., et al. CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures. PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).
- Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).
- Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli. Protein Express. Purif. , (2015).
- Eyring, H., Stearn, A. E. The application of the theory of absolute reaction rates to proteins. Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).
- Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. Structure and function of a squalene cyclase. Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations. Science. 303 (5655), 186-195 (2004).
