Summary
Canales para el transporte de moléculas de agua en las enzimas influyen solvatación sitio activo y la catálisis. Aquí se presenta un protocolo para la ingeniería de estos motivos catalíticos adicionales basados en in silico modelado por ordenador y experimentos. Esto mejorará nuestra comprensión de la influencia de la dinámica de disolvente sobre la catálisis enzimática.
Introduction
El agua constituye una piedra angular para la química de la vida 1. Patrones de agua y solvatación de los sitios de enzimas activas afectan tanto a la entalpía y la entropía de la unión y la catálisis 1,2 3 de una manera muy compleja que se extiende más allá del efecto hidrófobo 2,3 ligando. RMN 4, calorimetría 2 y el modelado molecular de las proteínas disueltas se han utilizado para arrojar luz sobre el papel de las moléculas de agua explícitas en la prestación de una fuerza impulsora para la asociación ligando 5-8, la especificidad y la actividad 2,9,10. El presente artículo presenta una metodología única para la evaluación experimental del impacto termodinámico de desplazamiento del disolvente en la catálisis enzimática (Figura 1). Nuestra estrategia combinada se basa en el uso de simulaciones por ordenador en concierto con la ingeniería enzimática y el análisis termodinámico (Figura 1). Esto permite arrojar luz sobre el impacto de la dinámica de disolvente en catalisis, que actualmente poco conocida.
La estabilización de las interacciones entálpicos, proporcionados por enlaces de hidrógeno mediado con el agua en la enzima solvatado sitios activos, pueden ser compensados por sanciones entrópicos 1. Estos costes entrópicos están asociados con la disminución de los grados de libertad mostrada por las moléculas de agua confinados dentro de las cavidades de proteína, en comparación con el agua a granel 5. La liberación de las moléculas de agua ordenadas puede pues proporcionar una fuerza motriz para la asociación entrópica ligando 1 y catálisis 3. Un aspecto clave de la dinámica de disolvente es el desplazamiento de moléculas de agua entre el interior de las proteínas y el disolvente exterior 4. Los cambios se acompañan de energía de activación, entalpía y entropía 11 no se comprenden por completo en el nivel molecular. Al obstruir túneles individuales responsables para el transporte de agua en las enzimas, la importancia de la dinámica de disolvente y su contribución a la activaciónenergía puede ser evaluado (Figura 1). Por otra parte, mediante la realización de una sola olla experimentos cinéticos a diferentes temperaturas, los parámetros de activación termodinámicas relativas de varios sustratos pueden ser extraídos de un número reducido de experimentos (Figura 1, derecha). Nuestro método interdisciplinario está validado para complejos enzimas ciclasa triterpeno unidas a la membrana que generan terpenos policíclicos de gran importancia para la vida 12. El protocolo permite la recuperación de grandes cantidades de proteína de membrana (10-20 mg / L) utilizando una centrífuga estándar.
Aunque las enzimas evolucionaron en agua, el papel del disolvente en la promoción de la catálisis es generalmente descuidado. Además de la dinámica de proteínas 13,14 que forma pre-organizado sitios activos con complementariedad electrostática para el estado de transición 15, la dinámica del agua podría ser de gran importancia para la catálisis enzimática eficiente. Al forjar varias técnicas interdisciplinarias, nuestraobjetivo es facilitar la altamente compleja estudio de la dinámica del agua y la termodinámica. Hacer estas herramientas más accesibles a la comunidad científica conducirá al desarrollo de nuevas estrategias en la ingeniería enzimática y el diseño de proteínas para las actividades alteradas y especificidades.
Protocol
Modelado 1. En Silico ordenador
- Descargar una estructura de AP de la proteína de interés del banco de datos de proteínas (PDB). Preparar la estructura mediante la eliminación de exceso de subunidades y luego añadir que faltan átomos de hidrógeno y disolvente explícita utilizando el "Neutralización de la célula y p K una predicción" experimento en YASARA 16. Para unidas a la membrana ciclasas triterpenos, las dimensiones adecuadas de la caja de agua son 91x67x77 Å. Ajuste el estado de protonación de los aminoácidos catalíticamente activos manualmente.
Nota: Si es necesario, un análogo de sustrato en el archivo PDB puede ser modificado a un sustrato real utilizando la "Edición | swap | Atom" de comandos. - Reducir al mínimo la estructura mediante el comando "Energía Minimización" utilizando la suite de campo de fuerza AMBAR 17. Utilice el enfoque Ewald malla de partículas (PME) 18 para dar cuenta de largo alcance interacciones electrostáticas. Establecer el límite para interacciones de van der Waals segúna la configuración estándar.
Nota: El comando "Energía Minimización" elimina el estrés conformacional por una minimización corto descenso más pronunciado, a continuación, un recocido simulado (paso de tiempo 2 FSEC, velocidades atómicas escalados por 0,9 cada 10 ª etapa) se lleva a cabo hasta que se alcance la convergencia (es decir, la mejora de la energía por menos de 0,012 kcal / mol por átomo durante 200 pasos).
2. Modelo de solvatación sitio activo y Acceso al agua
- Después del recocido simulado, ejecutar un 20 dinámica molecular NSEC (MD) trayectoria y generar por lo menos 10 instantáneas por el "Archivo | Simulación Snapshot | Guardar como" comando seguido de "Simulación On". Ejecute las simulaciones en una computadora estándar con condiciones de contorno periódicas en el marco del conjunto canónico. Se mantiene la temperatura a 298 K usando un termostato Berendsen.
- Preparar las instantáneas obtenidas de 2,1 mediante la supresión de todas las moléculas de agua y ligandos eventuales / sustratos utilizando el4; Editar | Eliminar | Residuo "comando Superpose cada instantánea de forma individual en la estructura PDB original de la". Superpose | comando Objeto "para garantizar que todas las estructuras comparten la misma posición espacial Ahorra cada instantánea preparado de esta manera como un nuevo anteproyecto de presupuesto. -file (utilizando el "Archivo | Guardar como | AP" de comandos).
Nota: Para los modeladores experimentados: escribir un script para automatizar este proceso de acuerdo con la plantilla dada en el Código complementario Archivo 1. - Utilice las instantáneas preparadas (PDB) de 2.2 que se han alineado en 3D-espacio como entradas al CAVER software 3.0 19. Para el análisis de un número limitado de instantáneas, ejecute CAVER en un equipo estándar. Utilice un radio de sonda de 0.7 Å 19 para asegurar la detección de túneles que son específicas para el transporte de moléculas de agua.
- Visualice los túneles generados por CAVER 3.0 en un software de gráficos molecular. Para facilitar la visualización de los túneles, utilice la macro se muestra en Código suplementario File 2.
3. En Silico Enzima Ingeniería para modificar los patrones de agua y la dinámica del agua
- Identificar los túneles de más alto rango de acuerdo con el encabezado "ID" que figuran en el archivo de salida "summary.txt" generado por el software CAVER 3.0.
- Identificar aminoácidos que recubren los túneles de más alto rango (3.1) y que muestran una pequeña cadena lateral que señala hacia el interior del canal mediante inspección visual (usando el modelo obtenido a partir de 2,4). Identificar las sustituciones de aminoácidos individuales que bloquean el túnel por el aumento de impedimento estérico con el comando "Residuo de intercambio". Verifique que el túnel está obstruida por inspección visual, y luego repitiendo los pasos 1.2 a 3.1 del protocolo.
4. Expresión de los genes mutados
- Introducir mutaciones en el gen de tipo salvaje mediante mutagénesis por PCR usando cebadores que no se solapan 20.
- Añadir ADN plásmido que contiene el gen de interés al tubos con células competentes de una cepa de clonación adecuado y se incuba en hielo durante 30 min. Realizar una transformación de choque térmico durante 45 segundos en un baño de agua con la temperatura ajustada a 42 ° C. Añadir 500 l de un medio rico fresco (2YT, 16 g / L de triptona, extracto de levadura 10 g / L, 5 g / L NaCl) y se incuba a 37 ° C, 200 rpm durante 45 min. Realice una selección en placas las células transformadas en placas de agar suplementadas con los antibióticos apropiados.
- Después de verificar la secuencia de ADN del gen mutado, transformar el ADN de plásmido en una cepa de expresión utilizando choque térmico como se describió anteriormente. Para la expresión de unidas a la membrana ciclasas triterpénicos, utilice BL21 (DE3).
- Iniciar un cultivo de 5 ml O / N a 37 ° C de la cepa de expresión en 2YT-media suplementado con los antibióticos apropiados.
- Inocular un matraz de agitación desconcertado 2 L, que contiene 300 ml 2YT-medio suplementado con los antibióticos adecuados, a una DO final de 0,05 a 0,09 (medida a 600 nm). Después de la inducción a una DO de 0,6-0.8 y expresión de proteínas, congelar el sedimento celular y se almacena a -80 ° C.
- Para ciclasas triterpénicos unidas a la membrana en un vector pD861, inducir con 0,5 a 2 mM ramnosa y 4 hr de expresión a 37 ° C para lograr altos rendimientos de proteína de 21.
5. membrana de extracción usando una centrífuga normal y Protein Purification
- Preparar los siguientes tampones: tampón de resuspensión (fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5 suplementado con inhibidor de la proteasa Tablets), tampón detergente (1% (v / v) de Triton X-100, fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5) y tampón de reacción (0,2 % de Triton X-100, fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5).
- Para ciclasas escualeno-hopene u otras enzimas unidas a la membrana con un óptimo de pH más bajo, sustituya el fosfato de potasio en el tampón de resuspensión con citrato. Para tales enzimas utilizar los tampones siguientes: tampón detergente (1% de Triton X-100, Citrato 60 mM, pH 6,0) y tampón de reacción (0,2% de citrato mM Triton X-100, 60, pH 6,0).
Nota: Si un His-tag se utiliza para la purificación, complementar el tampón de resuspensión con imidazol 20 mM (concentración final).
- Para ciclasas escualeno-hopene u otras enzimas unidas a la membrana con un óptimo de pH más bajo, sustituya el fosfato de potasio en el tampón de resuspensión con citrato. Para tales enzimas utilizar los tampones siguientes: tampón detergente (1% de Triton X-100, Citrato 60 mM, pH 6,0) y tampón de reacción (0,2% de citrato mM Triton X-100, 60, pH 6,0).
- Pesar un sedimento celular congelado en un vaso de precipitados de vidrio. Resuspender las células en tampón de resuspensión usando un homogeneizador a una concentración final de 0,3 g de células / ml. Lisar las células resuspendidas por ultrasonidos con una amplitud de 80% y un pulso de 1 seg y 1 seg en off. Utilice tres ciclos de repetición de 50 seg cada uno.
- Añadir tampón detergente hasta una concentración final de 0,2% (v / v) de detergente. Equilibrar mezclando a 4 ° C durante 1 hr de extremo a extremo. Recuperar la fracción de proteína de membrana por el ahorro el sobrenadante después de una única etapa de centrifugación a 39.000 xg durante 50 min a 4 ° C.
Nota: Si se utiliza la purificación His-tag, añadir aproximadamente 1,5 ml de agarosa Ni-NTA células / g y se incuba durante 1 hr. - Realizar una primera depuraciónpaso por cualquiera de intercambio iónico o purificación 21 Su-etiqueta. Suplemento el equilibrado y elución tampones con 0,2% Triton X-100. Se concentra la proteína purificada cinco veces usando Filtrar Unidades centrífugas con un punto de corte de 10 kDa.
Nota: El tamaño de las micelas resultados Triton X-100 en una concentración de detergente a una concentración final de aproximadamente 1%. - Finalizar la purificación por filtración en gel un paso de pulido utilizando la proteína concentrada y una matriz compatible con un intervalo de fraccionamiento de las proteínas globulares de 2 × 10 × 10 4 -8 6. Utilice el tampón de reacción como tampón. Medir la cantidad de proteína purificada utilizando el kit Ultra Bradford de acuerdo con el protocolo del fabricante.
6. Cinética
- Hacer una nueva mM solución 5 stock de sustrato en tampón de reacción. Obtener una emulsión homogénea por ultrasonidos a 30% de la amplitud de 2-5 minutos.
- Equilibrar una termomezcladora la temperatura de reacción deseada. Verifique la temperatura dentro de un frasco de cristal que contiene agua con un termómetro externo.
- Para la cinética-sustrato único, diluir el sustrato emulsionado en al menos cinco viales de vidrio a la misma concentración de sustrato final.
- Por una olla cinética relativos con múltiples sustratos, preparar al menos cinco viales de vidrio idénticas mezclando todos los sustratos en cada vial. Para triterpenos hidrófobos, utilizar concentraciones de sustrato finales en el rango de 10 a 200 mM.
- Preincubar los viales de vidrio en el termomezclador durante 10 min. Se inicia la reacción mediante la adición de la enzima. Un volumen de reacción total de 1 ml es adecuado. Utilice una velocidad de agitación de al menos 1.200 rpm.
- Alto a las reacciones en diferentes puntos de tiempo mediante la adición de 500 l de acetato de etilo claveteado con 100 decanol M como un estándar de integración.
7. Extracción y Análisis termodinámico
- Extracto de las mezclas de reacción porvórtex y agitando manualmente los viales de vidrio vigorosamente durante 1 min. Centrifugar los viales de vidrio en 9600 xg en una centrífuga de mesa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir la capa superior (fase orgánica) a un tubo vacío. Añadir un adicional de 500 l de disolvente de extracción de los tubos de reacción y repita el procedimiento de extracción.
- Seque las mezclas de reacción se extrae con Na 2 SO 4. Vortex durante 5 segundos y dejar los tubos descansar durante 10 minutos. Realice una etapa de centrifugación final a 9.600 xg durante 1 min a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de mesa. Transferir las muestras extraídas de cromatografía de gases (GC) viales.
- Repetir los pasos bajo 6.1 a 7.2 para cada variante enzima de interés, utilizando al menos cuatro concentraciones diferentes inicial del sustrato (por la cinética de sustrato individuales) y cuatro temperaturas diferentes (tanto para un solo sustrato y la cinética competitivos).
- Realizar GC-análisis a lo descrito previamente 3. Utilice una columna no polar para el análisis de hydrophobic productos pentacíclicos. Ajustar la temperatura inicial de la estufa a 120 ° C y el uso de un gradiente de temperatura de 5 ° C / min, dependiendo de los productos y la columna.
- Integrar las áreas de los picos del producto (s) y transformar áreas de los picos del producto en las concentraciones de productos correspondientes mediante la utilización de la zona de la norma de integración (correspondiente a 100 mM). Trazar la concentración de cada producto ([P]) versus el tiempo de reacción (t). Realizar regresión lineal de los puntos de datos correspondientes a la conversión de menos de 10%. La velocidad de reacción inicial (V 0) viene dada por la pendiente de la línea ajustada de acuerdo a:
Nota: Por una olla cinética relativos con múltiples sustratos, V 0 es la velocidad inicial de un sustrato particular bajo la influencia de otros sustratos. - Para la cinética de sustrato individuales, parcela V 0 k cat / valor de K M está dada por la pendiente de la parte lineal de la gráfica de acuerdo a:
[S] es la concentración de sustrato y [E] la concentración de enzima utilizada en la transformación. K cat / K M equivale a la constante catalítica sobre la constante de Michaelis. Repetir el análisis para cada temperatura y cada variante de la enzima. - Para la cinética de sustrato individuales, realizar un análisis termodinámico de acuerdo con la teoría del estado de transición 22
k b es la constante de Boltzmann, constante h, T de Planck de la temperatura en grados Kelvin, y R la constante de los gases. Realizar un análisis de regresión lineal de la trama de ln ((k
Nota: Del mismo modo, un análisis bajo la concentración de sustrato saturante se puede realizar mediante el uso de k gato como tasa constante en la ecuación 3. - Por una olla cinética relativos con múltiples sustratos, obtener la aparente relación
k cat / K valores de M de 23:
(K cat / K M) A / (k cat / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4)
para los que V 0, A se refiere a la tasa inicial de sustrato A en competencia con el sustrato B. - Para un solo recipiente ki relativanetics con múltiples sustratos, obtener los parámetros termodinámicos relativos de activación para B, en comparación con A como referencia, por regresión no lineal:
- Calcular los parámetros de activación absolutos de sustrato B de la entalpía de activación y la entropía del compuesto de referencia A:
Representative Results
La importancia de la dinámica del agua en la catálisis enzimática polycyclization está implicado por análisis in silico y posterior visualización de túneles detectados (con el script en el Código complementario Archivo 2). Después de la sección 3 del protocolo, S168 se encuentra que es un residuo de aminoácido "punto caliente" que recubre uno de los túneles de la triterpeno enzima ciclasa de Alicyclobacillus acidocaldarius (Figura 1, parte central izquierda). Mediante la introducción de la mutación S168F in silico, el túnel está obstruido como se ve por inspección visual (Figura 1, parte inferior izquierda).
La velocidad de reacción para la formación de productos policíclicos mostradas por la enzima adenilato triterpeno es altamente sensible a la temperatura (Figura 2A). Siguiendo el protocolo (sección 4-7), se encuentra que la aparente k cat / K
A partir de los parámetros cinéticos determinados experimentalmente, parcelas termodinámicos lineales se generan por la ecuación 3 y por el artículo 6.7 del protocolo para la cinética de sustrato individuales (Figura 2 B) siguiente. Los cambios muy grandes en la entropía y la entalpía de activación observados para las variantes que albergan túneles bloqueados implica un papel clave para la dinámica del agua en la promoción de la cascada polycyclization (Figura 2C, los cálculos sobre la base de la Figura 2B). Además, Variantes con túneles de agua alterados muestran una alteración energía libre de Gibbs de activación (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, Figura 2B-C). Por ejemplo, en la variante 303 K túnel S168F muestra una energía libre de Gibbs de activación de 14 kcal / mol en comparación con 16 kcal / mol para la enzima de tipo salvaje.
Siguiendo el protocolo en el apartado 7, la ecuación 4 permite el cálculo de los valores cat / K M aparente k para sustratos adicionales de una olla experimentos cinéticos (Figura 3A). Por otra parte, una parcela termodinámico lineal (Figura 3B) se puede construir mediante la ejecución del ensayo de la competencia a diferentes temperaturas (ecuación 5). En analogía a la cinética de sustrato individuales, la entalpía y la entropía relativa de activación para sustratos adicionales en comparación con un compuesto de referencia son readily accesibles desde el origen y la pendiente del lineal se ajusta a los datos experimentales. Los valores absolutos de los parámetros termodinámicos de activación pueden ser evaluados de la adición aritmética mediante el uso de datos termodinámicos asociados con el compuesto de referencia (ecuación 6). Usando el protocolo en el presente documento, generan resultados muestran claramente que la enzima de membrana variantes con túneles de agua bloqueados muestran fundamentalmente diferentes parámetros termodinámicos de activación para sustratos de diferentes tamaños (Figura 3C).
Resumen Figura 1. Protocolo:. In silico modelado por ordenador en concierto con el diseño de proteínas experimental y análisis termodinámico permite una mejor comprensión de la influencia de la dinámica de disolvente en la catálisis de la enzima Por favor, haga clicaquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. parámetros termodinámicos de activación de las variantes de tipo salvaje y túneles de la cinética de sustrato individuales. (A) k aparente cat / K M valores obtenidos a partir de datos experimentales y mediante el uso de ecuaciones 1 y 2. (B) Análisis termodinámico utilizando la teoría del estado de transición y ajuste lineal de los datos experimentales a la ecuación 3. (C) parámetros termodinámicos de activación calculados a partir de las parcelas en (B). El sustrato escualeno dobladas se muestra con bonos formada / roto como líneas de puntos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. parámetros termodinámicos de activación de las variantes de tipo salvaje y túneles para diferentes sustratos. (A) k relativa cat / K M valores obtenidos de la cinética de una sola olla utilizando la ecuación 4. (B) parcelas termodinámicas de los datos cinéticos en diferente temperaturas usando la ecuación 5. (C) parámetros termodinámicos absolutos de activación calculados por la ecuación 6 y utilizando el escualeno sustrato en la Figura 2 como referencia. Bonos formado / rotos en los sustratos se muestran como líneas de puntos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los pasos más importantes en el logro de los datos termodinámicos experimentales de alta calidad para la enzima de membrana y túneles variantes de tipo salvaje son: 1) generación del modelo de la computadora; 2) las proteínas purificadas de forma homogénea; 3) las reservas de sustratos emulsionados; 4) el control de la temperatura durante la cinética; 5) extracción de mezclas de reacción utilizando patrón interno.
La generación del modelo de la computadora se ve facilitada en gran medida por el uso de un software con una interfaz fácil de usar que soporta una variedad de plataformas. Por lo tanto, este protocolo se basa en el modelado de baño YASARA 16 para que nuestra estrategia accesible incluso para modelar los no expertos. Un modelo de ordenador para la identificación de túnel de agua idealmente debe basarse en una estructura cristalina de la enzima de interés 24. Para este propósito, la riqueza de estructuras cristalinas disponibles en el banco de datos de proteínas es muy beneficioso. En nuestra experiencia, un aspecto clave en la preparación exitosa de templacas para la identificación del túnel es mantener aguas cristalográficas. Es de igual importancia de usar una caja enzima solvatado al realizar simulaciones de dinámica molecular, que se pueden ejecutar en un ordenador normal. La adenilato triterpeno de Alicyclobacillus acidocaldarius es estable en agua durante 3 simulaciones MD. Sin embargo, mantener detergentes cristalográficos y / o utilizar imita la membrana celular tal vez sería necesario para enzimas potencialmente inestables para permitir simulaciones MD prolongados. Se prevé que la estructura cristalina minimizada de objetivos altamente desafiantes podría proporcionar información importante sobre mecanicista utilizando el protocolo, aunque esto no sería capturar los aspectos dinámicos de la organización túnel.
CAVER 19 en el modo básico, con un solo o un número limitado de instantáneas como entrada, puede ser utilizado por personas no expertas en un ordenador portátil estándar. Basándonos en nuestra experiencia 3, túneles con un radio de cuello de botella (es decir, el radioen el punto más estrecho) menor que 1 Å puede ser de gran relevancia para el agua, sobre todo si las moléculas de agua cristalográficas residen dentro del túnel previsto (Figura 1, parte central izquierda). Por otro lado, un radio de cuello de botella más grande podría implicar un túnel para el transporte del sustrato en y fuera del sitio activo 10. La secuencia de comandos en el Código complementario Archivo 2 puede ser utilizado por los no expertos para la visualización de los túneles previstos. Los futuros experimentos revelarán si los modelos de homología serán de resolución suficientemente alta para permitir el estudio atomista de redes de agua y la dinámica. Arrojando luz sobre la forma de realizar simulaciones de dinámica molecular, con y sin un ligando presente en el sitio activo, influye en el proceso de identificación del túnel también sería de importancia.
Cinética de las proteínas de membrana pueden constituir un reto formidable 25. El protocolo en el presente documento se basa en un protocolo de extracción simple membranapara obtener la enzima de la membrana sin el uso de un equipo caro, tal como una ultracentrífuga. El uso de filtración en gel como un paso final de pulido elimina posibles partículas de membrana residual y permite para definir un entorno detergente apropiado 25.
Un aspecto clave en el logro de resultados cinéticas reproducibles desde el protocolo es para emulsionar la solución de sustrato stock de ultrasonidos. Vórtex simple de sustratos hidrófobos diluidas en el tampón de reacción da mezclas de sustrato-detergentes no homogéneas. El pipeteo de soluciones de sustrato no emulsionadas conduce a concentraciones irreproducibles (confirmados por GC cuantitativa), lo que impide la determinación exacta de las tasas iniciales. En contraste, el pipeteo de soluciones madre adecuadamente emulsionados debe resultar en análisis de regresión lineal de las tasas iniciales con R 2 en el intervalo de 0,98 a 0,99. Otro aspecto importante de los sustratos hidrofóbicos es la solubilidad aparente sustratoy la disponibilidad en las mezclas de sustrato-detergentes. De hecho, no era posible para saturar la adenilato triterpeno con el escualeno sustrato de referencia. Por esta razón aparente k cat / K M valores se presentan en este documento que podría contener contribuciones de tanto vinculantes como la química. Sin embargo, se ha demostrado que la química es limitante de la velocidad para k cat / K M para la cascada polycyclization llevada a cabo por ciclasas triterpénicos 3.
Es de gran importancia para verificar la temperatura real dentro de un vial de vidrio reacción con un termómetro externo. Aún así, ajustes lineales pueden ser más pobres para las variantes con constantes esenciales aparente k cat / K valores de M a diferentes temperaturas. Esto se destacó para la variante S168F en el presente documento (Figura 2A) con una entalpía de activación cercano a cero (Figura 2B y 2C). Muy Small cambios dependientes de la temperatura en aparente k cat / K M, podrían inducir la incertidumbre en la entropía activación observada Δ S ‡ (es decir, la intersección en las parcelas lineales en la Figura 2B). En principio, la entropía de activación observada también podría verse afectada por una abundancia diferente de enzimas activas para diferentes variantes, que no serían detectados mediante la medición de la concentración de proteína. Se espera que los errores experimentales se reducen cuando la mezcla de varios sustratos en una olla. Esto es porque todos los diferentes sustratos interactúan con la misma cantidad de enzima en estas circunstancias (ecuación 4). El uso de un disolvente de extracción se disparó con un patrón interno es importante para explicar las diferencias durante la extracción y / o GC-inyección.
La teoría del estado de transición se ha utilizado con éxito en enzimología 26. Este marco teórico importante era el principiodesarrollado para reacciones unimoleculares en la fase gaseosa. Sin embargo, se ha demostrado que las enzimas trabajan principalmente mediante la reducción de la barrera de energía de activación clásica 26. El coeficiente de transmisión asumido que ser uno en el presente documento podría afectar a la entalpía de activación medido y / o la entropía. La contribución de tunelización, y otros efectos no clásicos tales como recruzando del estado de transición, pueden contribuir más o menos 1.000 veces a la catálisis 26 que corresponde a aproximadamente 4 kcal / mol en energía. Se puede observar que la entropía de activación mostrada por la enzima de tipo salvaje (16 kcal / mol a 328 K, la Figura 2C) es mucho mayor que tales efectos no clásicos causados por un coeficiente de transmisión no uniforme. El impacto del coeficiente de transmisión debe disminuir cuando la comparación de los parámetros termodinámicos de activación para el tipo y túneles variantes silvestres utilizando el protocolo.
La energía libre de Gibbs de activación (Δ G ‡) es composed tanto de un entálpico (Δ H ‡) y un entrópico (- T * Δ S ‡) plazo. Reorganización de disolventes en las enzimas durante la catálisis puede influir en ambos parámetros. Se espera que el presente protocolo para facilitar el estudio de estos fenómenos mediante el ensamblaje de una caja de herramientas de herramientas computacionales relevantes y fáciles de usar in silico con el marco experimental biofísico necesario. El método está previsto para ser útil para el estudio de una plétora de procesos enzimáticos, incluyendo la catálisis por las enzimas unidas a la membrana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
| CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
| Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
| Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |
References
- Ball, P. Water as an active constituent in cell biology. Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).
- Snyder, P. W., et al. Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).
- Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).
- Persson, F., Halle, B. Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR. J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).
- Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).
- Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization. J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).
- Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38α MAP kinase inhibitors. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).
- Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).
- Matsuoka, S., et al. Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein. Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).
- Pavlova, M., et al. Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate. Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).
- Breiten, B., et al. Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).
- Oldfield, E., Lin, F. Y.
- Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
- Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. Protein activity regulation by conformational entropy. Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).
- Warshel, A. Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).
- Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).
- Duan, Y., et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations. J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).
- Essmann, U., et al. A smooth particle mesh Ewald method. J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).
- Chovancova, E., et al. CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures. PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).
- Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).
- Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli. Protein Express. Purif. , (2015).
- Eyring, H., Stearn, A. E. The application of the theory of absolute reaction rates to proteins. Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).
- Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. Structure and function of a squalene cyclase. Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations. Science. 303 (5655), 186-195 (2004).
