Summary
Kanäle für den Transport von Wassermolekülen in Enzymen beeinflussen aktiven Stelle Solvatation und Katalyse. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Engineering dieser zusätzlichen katalytischen Motive auf In-silico-Computer-Modellierung und Experimenten. Dies wird unser Verständnis des Einflusses der Lösungsmitteldynamik auf Enzymkatalyse.
Introduction
Wasser bildet einen Grundstein für die Chemie des Lebens 1. Wasser-Muster und Solvatation der aktiven Zentren von Enzymen wirken sich sowohl auf die Enthalpie und Entropie der Ligandenbindung 1,2 und Katalyse 3 in einem sehr komplexen Art und Weise über den hydrophoben Effekt 2,3 erstreckt. NMR 4, Kalorimetrie 2 und molekulare Modellierung solvatisierter Proteine verwendet worden, um Licht auf die Rolle der explizite Wassermoleküle in die eine treibende Kraft für die Ligand-Assoziations 5-8, Spezifität und Aktivität 2,9,10 vergießen. Wir beschreiben hier eine einzigartige Methodologie für die experimentelle Bestimmung der thermodynamischen Wirkung des Lösungs Verschieben auf Enzymkatalyse (Abbildung 1). Unsere kombinierte Strategie basiert auf der Verwendung von Computersimulationen im Konzert mit Enzym-Engineering und thermodynamische Analysen (Abbildung 1) basiert. Dies ermöglicht vergießen zusätzliches Licht auf die Auswirkungen der Lösedynamik auf cataLyse, die derzeit wenig verstanden wird.
Stabilisierende enthalpische Wechselwirkungen, durch Wasser vermittelte Wasserstoffbrücken in solvatisierten aktiven Zentren von Enzymen zur Verfügung gestellt, kann durch entropischen Sanktionen 1 ausgeglichen werden. Diese entropischen Kosten mit der Abnahme der Freiheitsgrade von im Protein Hohlräume beschränkt ist, Wassermoleküle angezeigt wird, wie in Groß 5 im Vergleich zu Wasser verbunden. Die Freisetzung von geordneten Wassermoleküle können somit einen entropischen Triebkraft für Ligand-Assoziations 1 und 3 der Katalyse. Ein Schlüsselaspekt der Solvatationsdynamiken ist die Verschiebung von Wassermolekülen zwischen dem Inneren der Proteine und der Außen Lösungsmittel 4. Die damit einhergehenden Veränderungen in der Aktivierungsenergie, Enthalpie und Entropie 11 nicht vollständig auf molekularer Ebene zu verstehen. Durch Behinderung einzelnen Tunnel für den Transport von Wasser in Enzymen der Bedeutung Solvatationsdynamiken und dessen Beitrag zur Aktivierung verantwortlichEnergie kann ausgewertet werden (Abbildung 1). Darüber hinaus wird durch Durchführen einer Eintopf kinetischen Experimenten bei verschiedenen Temperaturen Die relativen thermodynamischen Aktivierungsparameter mehrere Substrate können aus einer reduzierten Anzahl von Experimenten (Figur 1, rechts) extrahiert werden. Unser interdisziplinäres Verfahren für komplexe membrangebundenen Triterpen-Cyclase-Enzyme, die polycyclischen Terpenen der für das Leben 12 einen hohen Stellenwert zu generieren validiert. Das Protokoll ermöglicht die Gewinnung von großen Mengen an Membranprotein (10-20 mg / l) unter Verwendung einer herkömmlichen Zentrifuge.
Obwohl Enzyme in Wasser entwickelt hat, wird die Rolle des Lösungsmittels bei der Förderung der Katalyse in der Regel vernachlässigt. Neben der Proteindynamik 13,14, die Form vor, eine organisierte aktive Stellen mit elektrostatischen Komplementarität zu den Übergangszustand 15, könnte Wasser Dynamik für eine effiziente Enzymkatalyse hoher Bedeutung sein. Durch Schmieden mehrere interdisziplinäre Methoden, unsereZiel ist, die hoch komplexe Untersuchung der Wasserdynamik und der Thermodynamik zu erleichtern. Machen diese Werkzeuge leichter zugänglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft wird zur Entwicklung neuer Strategien in der Enzymtechnik und Proteindesign für veränderte Aktivitäten und Spezifitäten führen.
Protocol
1. In Silico Computermodellierung
- Laden Sie eine PDB Struktur des Proteins von Interesse aus der Proteindatenbank (PDB). Bereiten Sie die Struktur, die durch die Beseitigung von überschüssigen Untereinheiten und dann Zugabe fehlenden Wasserstoffatome und explizite Lösungsmittels mit Hilfe der "Zellneutralisation und p K eine Vorhersage" Experiment in YASARA 16. Für Membran gebunden Triterpen-Cyclasen, geeignete Abmessungen des Wasserkastens sind 91x67x77 Å. Stellen Sie die Protonierungszustand der katalytisch aktiven Aminosäuren manuell.
Hinweis: Falls erforderlich, kann ein Substrat analog in der PDB-Datei zu einem echten Substrat mit dem "Bearbeiten | Tausche | Atom" geändert werden Befehl. - Minimieren Sie die Struktur, die durch die "Energieminimierung" -Befehl mit dem AMBER-Kraftfeld-Suite 17. Verwenden Sie die Partikel Mesh Ewald Ansatz (PME) 18 für Langstreckenelektrostatische Wechselwirkungen zu berücksichtigen. Stellen Sie die Cut-off für die van der Waals-Wechselwirkungen nachIn den Standardeinstellungen.
Hinweis: Der Befehl "Energieminimierung" entfernt Konformationsänderung Stress durch eine kurze steilsten Abstiegs Minimierung, dann ein Simulated Annealing (Zeitschritt 2 fs, Atom Geschwindigkeiten um 0,9 Jede 10. Schritt skaliert) durchgeführt wird, bis die Konvergenz erreicht ist (dh Verbesserung der Energie von weniger als 0,012 kcal / mol pro Atom in 200 Stufen).
2. Modell des aktiven Zentrums Solvatation und Zugang zum Wasser
- Nach der Simulated Annealing, führen Sie eine 20 ns Molekulardynamik (MD) Flugbahn und erzeugen mindestens 10 Schnappschüsse von der "File | Simulation Snapshot | speichern unter" Befehl, gefolgt von "Simulation On". Führen Sie die Simulationen auf einem Standard-Computer mit periodischen Randbedingungen unter der kanonischen Gesamtheit. Pflegen Sie die Temperatur bei 298 K mit einem Berendsen Thermostat.
- Bereiten Sie die von 2,1 erhalten Snapshots durch das Löschen aller Wassermoleküle und eventuelle Liganden / Substraten unter Verwendung der4; Bearbeiten | Löschen | Rückstands "-Befehl überlagern jeder Snapshot einzeln auf dem Original PDB-Struktur durch das." Lagern | Befehl Objekt ", um sicherzustellen, dass alle Strukturen die gleiche räumliche Position Speichern Sie jede Momentaufnahme auf diese Weise als eine neue PDB vorbereitet. -Datei (mit der "Datei | Speichern unter | PDB" -Befehl).
Hinweis: Für erfahrene Modellbauer: Schreiben Sie ein Skript, um dieses Verfahren gemäß der Vorlage in Ergänzender Kodex Datei 1 angegebenen automatisieren. - Verwenden Sie die vorbereiteten Snapshots (PDB) von 2,2, die in 3D-Raum als Eingänge zu der Software CAVER 3.0 19 ausgerichtet sind. Für die Analyse von einer begrenzten Anzahl von Snapshots, führen CAVER auf einem Standard-Computer. Eine Messsonde Radius von 0,7 Å 19 um den Nachweis von Tunneln, die spezifisch für den Transport von Wassermoleküle sicherzustellen.
- Visualisieren Sie die von CAVER 3.0 in einer molekularen Grafik-Software generierte Tunnel. Für die einfache Visualisierung von Tunneln, verwenden Sie die in Ergänzender Kodex Fil gezeigten Makroe 2.
3. In Silico Enzym-Engineering, um Wasser-Muster-und Wasser-Dynamics ändern
- Identifizieren Sie die am höchsten eingestuften Tunnel nach der Kopfzeile "ID" in der Ausgabedatei "summary.txt" aus dem CAVER 3.0 Software generiert aufgeführt.
- Identifizieren Aminosäuren entlang der am höchsten eingestuften Tunneln (3.1) und dass die Anzeige ein kleiner Seitenkette in Richtung der Kanalinnen durch Sichtprüfung (unter Verwendung der von 2,4 erhalten Modell). Identifizieren Sie einzelne Aminosäure-Substitutionen, die den Tunnel durch erhöhte sterische Hinderung mit dem Befehl "Swap Rückstands" blockiert werden. Sicherzustellen, dass der Tunnel durch visuelle Inspektion durch Wiederholen der Schritte von 1,2 bis 3,1 des Protokolls verhindert wird, und dann.
4. Expression von mutierten Genen
- Einführung von Mutationen in den Wildtyp-Gen durch Mutagenese PCR unter Verwendung von nicht überlappenden Primern 20.
- In Plasmid-DNA, die das Gen von Interesse für Röhrchen mits mit kompetenten Zellen eines geeigneten Klonen Stamm und Inkubation auf Eis für 30 min. Durchführen einer Hitzeschocktransformation für 45 sec in einem Wasserbad mit einer Temperatur bis 42 ° C eingestellt. Gib 500 ul einer frischen Vollmedium (2YT, 16 g / l Trypton, 10 g / L Hefeextrakt, 5 g / L NaCl) und Inkubation bei 37 ° C, 200 Upm für 45 min. Treffen Sie eine Auswahl durch Ausplattieren der transformierten Zellen auf Agar-Platten mit geeigneten Antibiotika ergänzt.
- Nach Überprüfung der DNA-Sequenz des mutierten Gens, wandelt die Plasmid-DNA in einen Expressionsstamm, mit Hitzeschock, wie oben beschrieben. Für die Expression von membrangebundenen Triterpen Cyclasen verwenden BL21 (DE3).
- Beginne eine 5 ml O / N-Kultur bei 37 ° C des Expressionsstammes in 2YT-Medium mit den geeigneten Antibiotika ergänzt.
- Inokulieren einen 2 L Schüttelkolben Kolben, enthaltend 300 ml 2YT-Medium mit geeigneten Antibiotika ergänzt wurde, bei einer endgültigen OD von 0,05-0,09 (gemessen bei 600 nm). Nach der Induktion bei einer OD von 0,6-0.8 und Proteinexpression, Gefriert das Zellpellet und bei -80 ° C.
- Für membrangebundene Triterpen Cyclasen in einem pD861 Vektor, induzieren mit 0,5 bis 2 mM Rhamnose und 4 h der Expression bei 37 ° C zu hohen Ausbeuten an Protein 21 zu erreichen.
5. Membranextraktion unter Verwendung eines normalen Zentrifuge und Proteinreinigung
- Bereiten Sie die folgenden Puffer: Resuspensionspuffer (100 mM Kaliumphosphat, pH 7,5 mit Protease Inhibitor Tabletten ergänzt), Wasch-Puffer (1% (v / v) Triton X-100, 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,5) und Reaktionspuffer (0,2 % Triton X-100, 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.5).
- Für Squalen-Hopen-Cyclasen oder andere membrangebundenen Enzymen mit einem niedrigeren pH-Optimum, ersetzen Sie den Kaliumphosphat in der Resuspensionspuffer mit Citrat. Für solche Enzyme verwenden Sie die folgenden Puffer: Waschmittel-Puffer (1% Triton X-100, 60 mM Citrat, pH 6,0) und Reaktionspuffer (0,2% Triton-X 100, 60 mM Citrat, pH 6,0).
Hinweis: Wenn ein His-Tag zur Reinigung verwendet wird, ergänzen die Resuspensionspuffer mit 20 mM Imidazol (Endkonzentration).
- Für Squalen-Hopen-Cyclasen oder andere membrangebundenen Enzymen mit einem niedrigeren pH-Optimum, ersetzen Sie den Kaliumphosphat in der Resuspensionspuffer mit Citrat. Für solche Enzyme verwenden Sie die folgenden Puffer: Waschmittel-Puffer (1% Triton X-100, 60 mM Citrat, pH 6,0) und Reaktionspuffer (0,2% Triton-X 100, 60 mM Citrat, pH 6,0).
- Wiegen ein gefrorenes Zellpellet in einem Becherglas. Resuspendieren der Zellen in Resuspensionspuffer Verwendung eines Homogenisators auf eine Endkonzentration von 0,3 g Zellen / ml. Lyse der resuspendierten Zellen durch Ultraschallbehandlung mit einer Amplitude von 80% und einem Impuls von 1 Sekunde lang und 1 s ab. Verwenden Sie drei sich wiederholenden Zyklen von je 50 sec.
- Das Waschmittel-Puffer zu einer Endkonzentration von 0,2% (v / v) Detergenz. Äquilibrieren durch End-over-end Mischen bei 4 ° C für 1 Stunde. Die Membran zu gewinnen Proteinfraktion durch Speichern der Überstand nach einer einzigen Zentrifugationsschritt bei 39.000 × g für 50 min bei 4 ° C.
Hinweis: Wenn His-Tag der Reinigung verwendet wird, fügen Sie etwa 1,5 ml Ni-NTA Agarose / g Zellen und Inkubation für 1 Std. - Führen Sie eine erste ReinigungsSchritt entweder durch Ionenaustausch oder His-Tag Reinigung 21. Ergänzung der Äquilibrierung und Elutionspuffer mit 0,2% Triton X-100. Konzentrieren Sie sich das gereinigte Protein fünfmal mit Zentrifugen-Filtereinheiten mit einem Cut-off von 10 kDa.
Hinweis: Die Größe der Triton X-100-Mizellen führt zu einer Konzentration des Reinigungsmittels bis zu einer Endkonzentration von etwa 1%. - Finalisieren Reinigung durch Gelfiltration Polierschritt unter Verwendung der konzentrierten Protein und einer Matrix mit einem Fraktionierungsbereich für globuläre Proteine von 2 × 10 -8 4 x 10 6 kompatibel ist. Mit dem Reaktionspuffer als Laufpuffer. Messung der Menge an gereinigtem Protein, das durch Verwendung des Bradford Ultra-Set nach dem Protokoll des Herstellers.
6. Kinetics
- Machen Sie eine frische 5 mM Stammlösung des Substrats im Reaktionspuffer. Besorgen Sie sich eine homogene Emulsion mit Ultraschall bei 30% Amplitude für 2-5 min.
- Äquilibrieren einen Thermomixerbei der gewünschten Reaktionstemperatur. Überprüfen Sie die Temperatur im Inneren ein Glasfläschchen, die Wasser von einem externen Thermometer.
- Für Single-Substrat-Kinetik, verdünnen das emulgiert Substrat in mindestens fünf Glasfläschchen auf den gleichen Endsubstratkonzentration.
- Für Eintopf relativen Kinetik mit mehreren Substraten, bereiten mindestens fünf identische Glasfläschchen durch Mischen aller Substrate in jedem Fläschchen. Für hydrophobe Triterpene Verwenden Endsubstrat Konzentrationen im Bereich von 10-200 uM.
- Vorinkubieren die Glasfläschchen im Thermomixer für 10 min. Startet die Reaktion durch Zugabe des Enzyms. Ein Reaktionsvolumen von 1 ml ist geeignet. Verwenden Sie ein Schütteln Geschwindigkeit von mindestens 1200 Umdrehungen pro Minute.
- Stoppen Sie die Reaktionen zu verschiedenen Zeitpunkten durch Zugabe von 500 ul Ethylacetat versetzt mit 100 uM Decanol als Integrationsstandard.
7. Extraktion und thermodynamische Analyse
- Extrahieren Sie die Reaktionsgemische durchVortexen und Hand schütteln die Glasfläschchen 1 min kräftig. Zentrifugieren Sie die Glasfläschchen bei 9.600 × g in einer Tischzentrifuge für 10 min bei RT. Übertragen Sie die obere Schicht (organische Phase), um eine leere Hülse. Fügen Sie eine weitere 500 ul Extraktionslösungsmittel, um die Reaktionsrohre und wiederholen Sie den Extraktionsverfahren.
- Trocknen der extrahierten Reaktionsgemische mit Na 2 SO 4. Vortex für 5 Sekunden und lassen Sie die Röhrchen für 10 Minuten ruhen. Durchführen einer abschließenden Zentrifugationsschritt bei 9.600 × g für 1 min bei RT unter Verwendung einer Tischzentrifuge. Übertragen Sie die extrahierten Proben zur Gaschromatographie (GC) Ampullen.
- Wiederhole die Schritte unter 6,1 bis 7,2 für jede Enzymvariante von Interesse unter Verwendung von mindestens vier verschiedenen Anfangskonzentration des Substrats (für die Einzelsubstrat Kinetik) und vier verschiedenen Temperaturen (sowohl für Einzelsubstrat und wettbewerbsfähige Kinetik).
- Zuführen GC-Analyse, wie vorstehend beschrieben 3. Verwenden einen unpolaren Säule zur Analyse von hydrophobic penta Produkte. Gesetzt den anfänglichen Ofentemperatur auf 120 ° C und mit einem Temperaturgradienten von 5 ° C / min, in Abhängigkeit von den Produkten und der Säule.
- Integration der Peakflächen für das Produkt (en) und Transformationsproduktpeakflächen in den entsprechenden Produktkonzentrationen durch Verwendung der Fläche der Integrationsstandard (entsprechend 100 & mgr; M). Plotten der Konzentration von jedem Produkt ([P]) als Funktion der Reaktionszeit (t). Die lineare Regression der Datenpunkte, die weniger als 10% Umwandlung. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit (V 0) wird durch die Steigung der angepassten Linie entsprechend angegeben:
Anmerkung: Für Eintopf relativen Kinetik mit mehreren Substraten, V 0 die Anfangsrate eines speziellen Substrats unter dem Einfluss von anderen Substraten. - Für einzigen Substrat Kinetik, Grundstück V 0 k cat / K M Wert wird durch die Steigung des linearen Teils des Diagramms nach angegeben:
[S] die Substratkonzentration und [E] die Konzentration des Enzyms in der Transformation. K cat verwendet / K M entspricht katalytischen konstant über die Michaelis-Konstante. Wiederholen Sie die Analyse für jede Temperatur und jeder Enzymvariante. - Für einzigen Substrat Kinetik, führen Sie eine thermodynamische Analyse nach Eyring-Theorie 22
k b die Boltzmann-Konstante, h die Planck-Konstante ist, T die Temperatur in Kelvin und R die Gaskonstante. Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse der Auftragung von ln ((k
Hinweis: Ebenso kann eine Analyse unter sättigenden Substratkonzentration unter Verwendung von k cat als Rate in Gleichung 3 konstant durchgeführt werden. - Für Eintopf relativen Kinetik mit mehreren Substraten, erhalten die relative scheinbare
k cat / K M Werte von 23:
(K cat / K M) A / (k cat / K M) B = V 0, A / V-0, B * [B] / [A] (4)
bei denen V 0, A bezieht sich auf die Anfangsgeschwindigkeit für das Substrat A in Konkurrenz mit Substrat B - Für Eintopf relativen kitik mit mehreren Substraten zu erhalten, die relativen thermodynamischen Parametern der Aktivierung von B im Vergleich zu einem als Bezug, durch nichtlineare Regression:
- Berechnen Sie die absolute Aktivierungsparameter für Substrat B aus der Aktivierungsenthalpie und Entropie der Referenzverbindung A:
Representative Results
Die Bedeutung der Wasserdynamik in der enzymatischen Katalyse Polycyclisierung wird von in silico-Analyse und anschließende Visualisierung der erfassten Tunnel (mit dem Skript in Ergänzender Code-Datei 2) in Verbindung gebracht. Nach § 3 des Protokolls wird S168 festgestellt, dass ein "hot spot" Aminosäurerest Futter einen der Tunnel in der Triterpen-Cyclase-Enzym aus Alicyclobacillus acidocaldarius (Abbildung 1, Mitte links) sein. Durch die Einführung der Mutation S168F in silico ist der Tunnel behindert wie durch visuelle Inspektion (Figur 1 unten links) gesehen.
Die Reaktionsgeschwindigkeit für die Bildung von polycyclischen Produkte Triterpens Cyclase Enzym angezeigt ist sehr empfindlich gegenüber Temperatur (2A). Nach dem Protokoll (Abschnitt 4-7), wird festgestellt, daß die scheinbare k cat / K
Aus der experimentell bestimmten kinetischen Parameter sind lineare thermoStücke durch Gleichung 3 und durch folgende Abschnitt 6-7 des Protokolls für die Einzelsubstrat Kinetik (2B) erzeugt wird. Die sehr großen Veränderungen in der Aktivierung Entropie und Enthalpie für Varianten beherbergen blockierten Tunnel beobachtet bedeutet eine entscheidende Rolle für die Wasserdynamik bei der Förderung der Polycyclisierung Kaskade (2C, Berechnungen auf Basis von 2B). AußerdemVarianten mit veränderten Wassertunnel zeigen eine veränderte Gibbs-Aktivierungsenergie (Δ G = Δ ‡ H ‡ - T * Δ S ‡, 2B-C). Zum Beispiel bei 303 K die S168F Tunnelvariante zeigt eine Gibbs-Aktivierungsenergie von 14 kcal / mol im Vergleich zu 16 kcal / mol für das Wildtyp-Enzym.
Nach dem Protokoll in Kapitel 7, Gleichung 4 ermöglicht die Berechnung der scheinbaren k cat / K M Werte für zusätzliche Substrate von Eintopf kinetischen Experimenten (3A). Darüber hinaus kann ein lineares thermodynamischen Grundstück (3B), indem Sie den Wettbewerb Essay bei unterschiedlichen Temperaturen (Gleichung 5) konstruiert werden. In Analogie zu Einzelsubstrat Kinetik, die relative Aktivierung Enthalpie und Entropie für weitere Substrate im Vergleich zu einer Referenzverbindung sind readily aus dem Achsenabschnitt und Steigung der linearen zugänglich passt an die experimentellen Daten. Absolutwerte der thermodynamischen Parameter der Aktivierung kann aus arithmetische Addition unter Verwendung thermodynamischen Daten mit der Referenzverbindung (Gleichung 6) zugeordnet beurteilen. Verwendung des Protokolls hier erzielte Ergebnisse zeigen deutlich, dass Membranenzymvarianten mit blockierten Wasser Tunnel anzuzeigen grundsätzlich verschiedene thermodynamische Parameter der Aktivierung für Substrate in verschiedenen Größen (3C).
Abbildung 1. Protokoll Zusammenfassung:. In silico Computermodellierung im Konzert mit experimentellen Proteindesign und thermodynamische Analyse ermöglicht ein besseres Verständnis des Einflusses der Lösungsmitteldynamik auf Enzymkatalyse Bitte klickenSie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Thermodynamische Parameter der Aktivierung von Wildtyp und Tunnelvarianten vom einzigen Substrat Kinetik. (A) Scheinbare k cat / K M Werte von experimentellen Daten und unter Verwendung der Gleichungen 1 und 2 (B) Thermodynamische Analyse unter Verwendung von Übergangszustand Theorie erhalten und lineare Anpassung der experimentellen Daten bis 3. (C) Thermodynamische Parameter der Aktivierung von den Stellplätzen in (B) berechnet Gleichung. Die vorgefaltet Squalen Substrat mit Anleihen gezeigt, ausgebildet / als gepunktete Linien gebrochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Thermodynamische Parameter der Aktivierung von Wildtyp und Tunnelvarianten für unterschiedliche Substrate. (A) Relative k cat / vom Eintopf Kinetik unter Verwendung der Gleichung 4 (B) erhaltenen K M -Werte Thermodynamische Grundstücke der kinetischen Daten bei unterschiedlichen Temperaturen unter Verwendung von Gleichung 5 (C) Absolute thermodynamischen Parameter der Aktivierung durch die Gleichung 6 und durch die Verwendung des Substrats Squalen in 2 als Referenz berechnet. Bindungen in den Substraten gebildet / gebrochen sind als gestrichelte Linien dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Die wichtigsten Schritte bei der Erreichung hoher Qualität experimentellen thermodynamischen Daten für Wildtyp-Enzym-Membran und Tunnelvarianten sind: 1) Generation der Computer-Modell; 2) homogen gereinigte Proteine; 3) emulgiert Substrat Bestände; 4) Kontrolle der Temperatur während der Kinetik; 5) Extraktion von Reaktionsgemischen mit Hilfe interner Standard.
Die Erzeugung des Computermodell wird durch die Verwendung einer Software mit einer benutzerfreundlichen Schnittstelle, die eine Vielzahl von Plattformen unterstützt erleichtert. Daher wird dieses Protokoll auf der YASARA Modellierung suite 16 voraus unserer Strategie zugänglich, auch die Modellierung Nicht-Experten zu machen. Ein Computermodell für die Wassertunnel Identifikation sollte idealerweise auf einer Kristallstruktur des Enzyms von Interesse 24 basieren. Zu diesem Zweck ist der Reichtum der Kristallstrukturen in der Proteindatenbank sehr vorteilhaft. Nach unserer Erfahrung ein wichtiger Aspekt bei der erfolgreichen Herstellung von TEMPlatten für die Tunnelidentifikations ist kristallographischen Wasser zu halten. Es ist ebenso wichtig, um einen gelösten Enzyms Feld verwenden bei der Durchführung von Moleküldynamiksimulationen, die auf einem normalen Computer ausgeführt werden können. Die Triterpen-Cyclase aus Alicyclobacillus acidocaldarius ist während der MD-Simulationen 3 in Wasser stabil. Allerdings halten kristallographischen Detergenzien und / oder mit Zellmembran imitiert wäre vielleicht für potenziell instabilen Enzymen erforderlich sein, um für längere MD-Simulationen zu ermöglichen. Es ist vorgesehen, dass das minimierte Kristallstruktur von höchst anspruchsvollen Ziele könnten wichtige mechanistische Einblicke liefern unter Verwendung des Protokolls, auch wenn dies nicht dynamische Aspekte der Tunnel Organisation zu erfassen.
CAVER 19 in der Grundmode mit einem einzigen oder einer begrenzten Anzahl von Snapshots als Eingang kann durch Nicht-Experten auf einem Standard-Laptop verwendet werden. Basierend auf unserer Erfahrung 3, Tunnel mit einer Engpass Radius (dh der Radiusan der engsten Stelle) kleiner als 1 Å für Wasser von hoher Relevanz sein, besonders wenn kristallographischen Wassermoleküle befinden sich innerhalb der vorhergesagten Tunnel (Abbildung 1, Mitte links). Andererseits könnte ein größerer Radius Engpass eines Tunnels für den Transport des Substrats in den und aus dem aktiven Zentrum 10 bedeuten. Das Skript in Ergänzungscodedatei 2 kann durch Nicht-Experten für die Visualisierung von vorhergesagten Tunnel verwendet werden. Zukünftige Experimente werden zeigen, ob Homologie-Modelle werden mit ausreichend hoher Auflösung sein, für die atomistische Untersuchung von Wassernetzen und Dynamik zu ermöglichen. Licht auf, wie die Durchführung Moleküldynamiksimulationen, mit und ohne in der aktiven Stelle vorhandenen Liganden beeinflusst der Prozess der Tunnelidentifikations würde auch von Bedeutung sein.
Kinetik der Membranproteine können eine gewaltige Herausforderung 25 bilden. Das Protokoll wird hierin auf eine einfache Membranextraktionsprotokoll basierendum die Membran Enzym ohne die Verwendung von teurer Ausrüstung, wie zum Beispiel einer Ultrazentrifuge erhalten. Die Verwendung von Gelfiltration als Endpolierschritt beseitigt potenzielle Restmembranpartikeln und ermöglicht die Festlegung eines geeigneten Reinigungsmittel Umwelt 25.
Ein wesentlicher Aspekt bei der Erreichung reproduzierbarer Kinetik ergibt sich aus der Protokoll ist, das Substrat-Stammlösung durch Ultra emulgieren. Einfache Verwirbeln von hydrophoben Substraten in dem Reaktionspuffer verdünnt gibt inhomogene Substrat-Detergensgemische. Das Pipettieren der nicht emulgierten Substratlösungen führt zu reproduzierbaren Konzentrationen (durch quantitative GC bestätigt), die genaue Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten verhindert. Im Gegensatz dazu sollte das Pipettieren von richtig emulgiert Stammlösungen in linearen Regressionsanalyse der Anfangsgeschwindigkeiten mit R 2 im Bereich von 0,98 bis 0,99 führen. Ein weiterer wichtiger Aspekt von hydrophoben Substraten ist die scheinbare Löslichkeit des Substratsund die Verfügbarkeit in den Substrat-Detergensgemische. Tatsächlich war es nicht möglich, die Triterpen-Cyclase mit dem Referenzsubstrat Squalen sättigen. Aus diesem Grund ersichtlich, k cat / K M -Werte werden hier vorgestellt, die Beiträge der beiden Bindungs und Chemie enthalten könnten. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass die Chemie Ratenbegrenzung für k cat / K M für die Polycyclisierung Kaskade von Triterpen-Cyclasen 3 durchgeführt.
Es ist von großer Bedeutung, um die tatsächliche Temperatur innerhalb einer Reaktionsglasfläschchen mit einem Außenthermometer verifizieren. Dennoch können lineare fits ärmer Varianten mit wesentlichen konstanten scheinbaren k cat / K M-Werte bei verschiedenen Temperaturen zu sein. Dies ist für den S168F Variante hierin (2A) mit einem Aktivierungs Enthalpie nahe Null (2B und 2C) betont. Sehr kleinel temperaturabhängige Änderungen der scheinbaren k cat / K M, könnte Unsicherheit in der beobachteten Aktivierungsentropie induzieren Δ S ‡ (dh der Schnittpunkt in den linearen Grundstücke in 2B). Im Prinzip könnte die beobachtete Aktivierung Entropie auch durch eine unterschiedliche Häufigkeit von aktiven Enzymen für verschiedene Varianten, die nicht durch die Messung der Proteinkonzentration detektiert werden würde beeinträchtigt werden. Es wird erwartet, dass die experimentellen Fehler werden reduziert, wenn Mischen mehrerer Substrate in einer Eintopfreaktion. Dies liegt daran, dass alle verschiedenen Substraten in Wechselwirkung mit der gleichen Menge an Enzym unter diesen Umständen (Gleichung 4). Die Verwendung eines Extraktionslösungsmittels versetzt mit einem internen Standard ist wichtig, um Unterschiede bei der Extraktion und / oder GC-Einspritzung zu berücksichtigen.
Eyring-Theorie wurde erfolgreich in Enzymology 26 verwendet. Diese wichtige theoretische Rahmen wurde ursprünglich deentwickelt für unimolekulare Reaktionen in der Gasphase. Allerdings hat es sich gezeigt, dass Enzyme vor allem durch Absenken des klassischen Aktivierungsbarriere 26 zu arbeiten. Die Durchgangskoeffizient angenommen, eine hierin könnte den gemessenen Aktivierungsenthalpie und / oder Entropie beeinflussen. Der Beitrag von Tunneln und anderen nichtklassischen Wirkungen wie Rückkreuzung des Übergangszustands, können grob 1000-fach bis 26-Katalyse entsprechend ca. 4 kcal / mol in Energie beitragen. Es kann gesehen werden, dass die Aktivierung der Entropie durch das Wildtyp-Enzym (16 kcal / mol bei 328 K, 2C) angezeigt wird, viel größer als eine solche nicht-klassischen Effekte einer ungleichmäßigen Übertragungskoeffizienten bewirkt. Die Auswirkungen des Durchgangskoeffizient sollte beim Vergleich von thermodynamischen Parameter der Aktivierung für Wildtyp und Tunnelvarianten unter Verwendung des Protokolls verringern.
Die Gibbs-Aktivierungsenergie (Δ G ‡) ist COMPOsed sowohl ein enthalpischen (Δ H ‡) und einer entropischen (- T * Δ S ‡) tigen. Beide Parameter können Lösungsmittel Reorganisation in Enzymen während der Katalyse beeinflussen. Das vorliegende Protokoll wird erwartet, dass die Untersuchung dieser Phänomene durch Zusammenfügen einer Toolbox von relevanten und benutzerfreundlich in silico Rechenwerkzeuge mit der notwendigen biophysikalischen experimentellen Rahmen zu erleichtern. Das Verfahren ist vorgesehen für die Untersuchung einer Vielzahl enzymatischer Prozesse, einschließlich Katalyse von membrangebundenen Enzymen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
| CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
| Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
| Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |
References
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