Summary
Dette manuskript beskriver en metode til at kvantificere tumor celle ophobning i lungerne i en dyremodel af tumor metastaser.
Abstract
For at undersøge de molekylære mekanismer for tumor metastaser, er blevet foreslået forskellige assays ved hjælp af musen som en model dyr. Her viser vi en simpel analyse for at vurdere tumor celle ekstravasation eller micrometastasis. I denne analyse, tumorceller blev injiceret gennem halen vene, og efter en kort periode, lungerne blev dissekeret og fordøjet for at tælle de akkumulerede mærket tumorceller. Denne analyse springer det første trin af primær tumor invasion ind i blodkar og letter undersøgelsen af begivenhederne i fjernt organ hvor tumor metastaser opstår. Antallet af celler injiceres ind i blodkar kan optimeres for at observere et begrænset antal metastaser. Det er blevet rapporteret, at stromale celler i Fjern organ bidrage til metastaser. Således, denne analyse kunne være et nyttigt redskab til at udforske potentielle terapeutiske lægemidler eller anordninger til forebyggelse af tumor metastaser.
Introduction
Tumor metastaser konti for høj dødelighed i cancer-relaterede sygdomme. Fra synspunkt af undersøgelser på det molekylære niveau, metastaser kan opdeles i flere trin: tumor indledningen på den primære tumor site, primær tumorvækst og invasion i omkringliggende væv, intravasation, omsætning gennem blodkarrene , ekstravasation på fjerntliggende organer, og tumor re-vækst. Hvert trin indebærer forskellige sæt af molekyler/signaler1.
Undersøgelser til dato har drejet sig om hændelser, som forekommer i fjerntliggende organer før tumorcellerne, cirkulerer i blodet, hvilket er også kendt som den præ metastatisk fase2,3,4,5, 6. Vores mus model undersøgelser afslørede, at fasen forud metastatisk letter lunge metastaser ved at skabe langvarig og low-level inflammatoriske respons i lungerne. Den pre-metastatisk fase er kendetegnet ved hyperpermeability af themicrovasculature, rekruttering af knoglemarven afledt celler (BMDC) og opregulering af cytokin/chemokine-lignende molekyler herunder S100A8 og SAA33,4 . Det er blevet rapporteret, at lysyl oxidase ændrer den ekstracellulære matrix i lungerne til at rekruttere BMDCs7. En anden betænkning har afsløret betydningen af Angpt2, MMP3 og MMP10 i pre metastatisk fase8. Med andre ord, det indviklede samspil mellem primære tumorer, knoglemarv og fjerntliggende organer skal være forstået og korrekt moduleret (for eksempel ved hjælp af narkotika, der er målrettet proteiner involveret i disse interaktioner) at forhindre fremtidige metastase9 . For at regulere den pre metastatisk fase, bør det først visualiseret og evalueres for diagnostiske eller terapeutiske indgreb. Her rapporterer vi en lunge tumor celle rekruttering assay, der giver mulighed for undersøgelse af pre metastatisk fase i lungerne.
Tumorceller direkte sprøjtet ind i blodkar af musen er lig cirkulerende tumorceller i kræftpatienter, selv om der kan være forskelle mellem kulturperler celler og cirkulerende tumorceller. Cirkulerende tumorceller undergå sig nogle karakteristiske ændringer, når de indtaster omsætning fra den primære tumor. Ikke desto mindre kan kulturperler celler danne tumorer hos immundefekte mus når de er indsprøjtet i halen vene. Derudover i mus modelsystem, kan fluorescens mærket tumorceller bruges som tillader sporing af disse celler i kroppen. Opførsel af cirkulerende tumorceller er kritisk, da de afgør de endelige konsekvenser i kræft patienter10. Blod er ikke et godt sted for overlevelse af tumor celler2. De har brug at flygte fra angreb af immunsystemet vært og behovet for anti-apoptotiske signaler at forhindre apoptose mangel af fysisk støtte. Tumorceller med højere evner af tumor indledning på metastatisk sites generere flere tumor knuder. Hvis tumorceller vise specifikke orgel tropisme, bemærkes metastaser i disse særlige organer. De første trin af den metastatisk kaskade (primær tumorvækst og invasion) er ikke inkluderet i denne analyse, og så fokus er på samspillet mellem cirkulerende tumorceller og stromale celler (endotelceller, epitelceller og blodlegemer). I konventionelle tumor celle indsprøjtning assays har forskere til at vente indtil tumor knuder vokser til en konkret størrelse at påvise metastaser. I dette tilfælde ikke kan det nøjagtige antal tumorceller i blodkar kvantificeres. Denne proces indeholder desuden en tumor genvækst fase, der angiver, at andre faktorer i tumorcellerne kan påvirke resultatet.
Tælle er mærket tumorceller under et fluorescens stereomikroskop en enkel proces. Stereomikroskopet giver et bredt synsfelt, så hele lungen kan scannes. Flowcytometri er også et nyttigt værktøj, der straks giver en præcis antal tumorceller i vævet. Tælle fluorescerende celler i vævet under en Konfokal mikroskop er også muligt og viser de mest præcise billeder af metastatisk tumorceller, men det er tidskrævende og kan give partisk resultater, hvis kun et markeret område er optalt. Det ultimative mål for denne analyse er at observere, hvordan let tumorceller ophobes i lungerne. Som rapporteret tidligere3,4, hvis lungerne er i pre metastatisk fase på grund af inflammatorisk signalering fra den primære tumor, er injiceres tumorcellerne tilbøjelige til at ophobe sig i lungerne, hvilket således indebærer større chancer for lunge metastaser. Andre betingelser (leddegigt, astma, etc.), og deres behandling med anti-inflammatoriske lægemidler (såsom anti-TNFα) kan dæmpe lunge metastaser. Dermed, vi konkludere, at denne analyse er et kraftfuldt værktøj til at vurdere muligheden for lunge metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer udføres med mus blev godkendt af Animal forskning Udvalget af Tokyo Women's Medical University.
1. hale vene injektion af Lewis lunge karcinom (LLC) celler
- Vedligeholde LLC celler i DMEM suppleret med 10% FCS, i en fugtig 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Celler bør indeholde en fluorescerende proteiner udtryk system (f.eks. normal god landbrugspraksis).
- Fjerne celler fra kultur parabol ved hjælp af en ikke-enzymatiske celle dissociation reagens. Følg producentens protokol.
- Indsamle celler i en 15 mL tube, og der centrifugeres ved 400 x g 3 min. Resuspend celler i 5 mL PBS af pipettering, og der centrifugeres tube (400 x g, 3 min). Fjern derefter supernatanten.
- Gentag trinnet vask en gang mere.
- Efter den anden vask, passerer en celle si (40 µm porestørrelse) celler og resuspend i PBS til at give en afsluttende celle tæthed af 1 x 106 celler/mL.
- Indsprøjtes 0,1 mL cellesuspension (1 x 105 celler, 29 G kanyle) i hver C57BL/6 mus (8-10 uge gamle hanner) via hale vene.
2. isolering af lungerne og tælle celler Under et fluorescens stereomikroskopet
- Aflive mus af CO2 indånding.
- Fjern skindet på den ventrale overflade af brystet med en saks. Derefter skæres ribbenene og mellemgulvet til udsætte brysthulen. Skyl PBS (100 cmH2, O, samlede 15 mL) gennem højre hjertekammer med en bevinget infusion 25 G kanyle og slanger.
- Klip hjertet og thymus. Greb i luftrøret med pincet, og trække op, dissekere bindevævet omkring luftrøret med saks. Dissekere ud i lungerne og vaske dem i PBS.
- Fjern hver lap og observere det under et fluorescens stereomikroskop.
3. lunge fordøjelsen
- 10 mg collagenase, 10 mg af dispase og 10 µg DNase i 10 mL serum-fri DMEM opløses. Filtreres gennem et 0,22 µm sprøjte filter til at forberede den enzymatiske fordøjelse løsning.
- Terning den isolerede caudale lap med saks. Placer lunge-stykker i en 10 mL sprøjte, efterfulgt af stemplet.
- Opsug fordøjelsen løsning (5 mL) ind i sprøjten ved at trække tilbage i stemplet. Betjene stemplet op og ned, indtil lungen synker i løsningen. Anbring den lunge og fordøjelsen buffer i en 50 mL tube.
- Ryst glasset for 15 min ved 37 ° C på en gensidig shaker (150 rpm). Lungerne kan blive laset under denne inkubering.
- Pipetteres op og ned indtil Lungeceller er helt spredt. Ryst glasset for yderligere 30 min ved 37 ° C på en gensidig shaker (150 rpm).
- Passere en 40 µm celle si Lungeceller. Spin ned celler ved 400 x g i 3 min.
4. flowcytometri af Lungeceller
- Opløs 100 mg af BSA i 10 mL PBS og filtreres gennem et 0,22 µm sprøjte filter til at forberede PBS - 1% BSA.
- Fjern supernatanten af prøven fremstillet på trin 3.6 ved hjælp af en pipette og tilsættes 2 mL rød blod celle lysering. Derefter, spin ned celler ved 400 x g i 3 min. supernatanten.
- Resuspend celler i 5 mL PBS - 1% BSA af pipettering, og der centrifugeres tube (400 x g, 3 min). Supernatanten.
- Gentag trinnet vask en gang mere.
- Suspendere celler i 1 mL PBS - 1% BSA og passere gennem en ny 40 µm celle si.
- Analysere celler med en flow forskellige tælle tumorceller (ved hjælp af filteropsætning FL1 for normal god landbrugspraksis-LLC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungerne præsentere mange normal god landbrugspraksis-LLC celler 2 h efter injektion (figur 1A). Det skal bemærkes, at de fluorescerende steder også opdaget i den røde filter bør udelukkes fra nummer celletal. Langt størstedelen af LLC celler forsvinder fra lungerne 24 timer efter injektion (figur 1 c).
For at bekræfte antallet af normal god landbrugspraksis-LLC i lungerne, kan en af lapper anvendes til flow cytometric analyse (figur 2).
Figur 1 : Påvisning af normal god landbrugspraksis-LLC celler under et fluorescens stereo mikroskop. (A) lunger er isolerede 2 h (A: filter sæt GFPLP, B: filter sat ET/CY3) eller 24 h (C: filter sæt GFPLP, D: filter sat ET/CY3) efter injektion af 3 x 104 NGL-LLC celler. I (C) markeres en normal god landbrugspraksis-LLC celle med en gul pil. De steder, der er afmærket med blå pile er ikke normal god landbrugspraksis-LLC celler. Skalalinjen angiver 750 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Flow flowcytometri analyse af Lungeceller. (A) og (B); Flow cytometric analyse af normal god landbrugspraksis-LLC celler til hale vene injektion. For at udelukke døde celler indeholdt celle suspension buffer propidium Iodid (1 µg/mL). (A) viser FSC vs SSC plot, og celler i regionen (c) er udviklet i (B) til at vise FL1 vs. FL3 plot. Celler i regionen (D) betragtes som normal god landbrugspraksis-LLC celler. (E) og (F); Dot parceller af caudale lap celler isoleret 24 h efter hale vene injektion. Normal god landbrugspraksis-LLC celler er observeret i området (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forbehandling af mus med antistoffer, narkotika, højt fedtindhold kost eller tumor-aircondition medium før tumor celle indsprøjtning er muligt. Det sværeste skridt i denne analyse er hale vene injektion. Ufuldstændig injektion resulterer i uafklarede data. Hale vene i C57BL/6 er særligt vanskeligt at identificere, hvilket resulterer i fejlbehæftede injektioner. Placere mus på en varmepude (37 ° C) spile hjælper hale vene, således at injektionen bliver lettere.
Denne analyse bruger et stort antal (1 x 10,4 - 1 x 105) tumorceller, som er meget større end det observerede i patientens blod. En engangs injektion af et stort antal celler kan medføre uønskede reaktioner fra værten dyr. I den fluorescens stereo mikroskopi optælling, tumorceller dybt inde i vævet er svære at opdage. I analysen af handelsstrømmen flowcytometri, er lungerne helt fordøjet for at tælle tumorceller i lungerne. Denne proces medfører tab af værdifulde oplysninger om tumor celleplacering (i eller uden for blodkar). Tværtimod, påvisning af tumorceller under en Konfokal fluorescens mikroskop giver den karakteristiske tumor celler i blodkarrenes fra de andre10.
Fluorescens stereo mikroskopi er en meget enkel metode. Ved hjælp af flowcytometri tælle tumorcellerne har ingen bias sammenlignet med mikroskop scanning. Det er muligt at scanne hele lunge sektioner under en Konfokal fluorescens mikroskop; men analysen vil derefter være omstændelig. Andre typer af tumorceller eller stromale celler kan være blandet med de injicerede tumorceller. Co injektion af kræft-associerede celler øger muligheden for metastase. Tumor metastaser sats afhænger stærkt af tumor celle og det dyr som bruges.
Som nævnt ovenfor er er det mest afgørende skridt i denne protokol hale vene injektion. En nøjagtig antal celler skal injiceres med ingen lækage, men teknisk vanskeligt. Omhyggeligt observere håndtering af kvalificerede forskere kan være til stor hjælp.
En række mus model undersøgelser har rapporteret, at 20% af de injicerede tumorceller undergik ekstravasation, 3% af dem dannede micrometastases, og kun 0,02% udviklet sig til konkrete metastatisk knuder2. I tilfælde af normal god landbrugspraksis-LLC celle indsprøjtning (3 x 104 celler), blev 150-300 normal god landbrugspraksis-LLC celler påvist ved flowcytometri analyse i den caudale lap isoleret 2 timer efter injektion. Det samlede antal NGL-LLC i lungerne antages for at være 600-1.200, der angiver, at 2-4% af de injicerede celler forblev i live. Dette forhold nedsætter i en tidsafhængig måde3,11. De andre celler antages for at gennemgå apoptose på grund af manglende fysisk støtte eller ernæring, eller som følge af udelukkelse af immunsystemet. I vores seneste data, 24 timer efter injektion af normal god landbrugspraksis-LLC (6 x 104 celler), blev antallet af normal god landbrugspraksis-LLC i lungerne fundet for at være omkring 20. Disse resultater kan være påvirket af musen stamme, tumor celle og andre faktorer. For eksempel, er blevet rapporteret, at antallet af tumorceller i lungerne blev forhøjet i pre metastatisk fase12, eller i gen modificeret mus13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
