Summary
Cet article décrit une méthode pour quantifier l’accumulation de cellules de tumeur dans les poumons dans un modèle animal de métastases tumorales.
Abstract
Afin d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent les métastases tumorales, divers essais à l’aide de la souris comme animal modèle ont été proposées. Nous démontrons ici, un simple test pour évaluer l’extravasation de cellules tumorales ou micrométastase. Dans ce test, les cellules tumorales ont été injectées dans la veine de la queue, et après une courte période, les poumons ont été disséqués et digérés pour compter les cellules tumorales marquées accumulés. Ce dosage saute l’étape initiale de l’invasion de la tumeur primitive dans le vaisseau sanguin et facilite l’étude des événements dans l’organe lointain où se produit la métastase tumorale. Le nombre de cellules injectées dans le vaisseau sanguin peut être optimisé afin d’observer un nombre limité de métastases. Il a été signalé que les cellules du stroma dans des organes éloignés contribuent à métastases. Ainsi, cet essai pourrait être un outil utile pour étudier les éventuels médicaments ou dispositifs pour la prévention des métastases tumorales.
Introduction
Métastase tumorale représente une mortalité élevée dans les maladies liées au cancer. Du point de vue des enquêtes au niveau moléculaire, les métastases peuvent être divisés en plusieurs étapes : initiation tumorale sur le site de la tumeur primitive, la croissance de la tumeur primitive et l’invasion en entourant les tissus, intravasation, circulation dans les vaisseaux sanguins , l’extravasation à des organes éloignés et re-croissance de la tumeur. Chaque étape consiste à différents ensembles de molécules/signaux1.
Études à ce jour ont porté sur les événements qui se produisent dans des organes éloignés avant de commencent aux cellules tumorales circulant dans le sang, qui est également connu comme le stade métastatique pre2,3,4,5, 6. Nos études de modèle de souris ont révélé que la phase pré métastatique facilite les métastases pulmonaires en créant des réactions inflammatoires à basse altitude et de longue durée dans les poumons. La phase pré métastatique est caractérisée par l’hyperperméabilité de themicrovasculature, le recrutement des cellules de moelle osseuse provenant (BMDC) et une augmentation des cytokines/chemokine-comme des molécules dont S100A8 et SAA33,4 . Il a été signalé que lysyl oxydase modifie la matrice extracellulaire dans les poumons pour recruter BMDCs7. Un autre rapport a révélé l’importance de la Angpt2, MMP3 et MMP10 dans la phase pré métastatique8. En d’autres termes, les interactions complexes entre les tumeurs primaires, la moelle osseuse et des organes distants doivent être compris et correctement modulée (par exemple, à l’aide de médicaments qui ciblent les protéines impliquées dans ces interactions) pour prévenir les métastases9 . Pour régler la phase pré métastatique, il abord convient visualisé et une évaluation des interventions diagnostiques ou thérapeutiques. Nous rapportons ici une analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire qui permet l’étude de la phase pré métastatique dans les poumons.
Les cellules tumorales injectées directement dans le vaisseau sanguin de la souris sont similaires à circulant les cellules tumorales de patients atteints de cancer, bien qu’il peut y avoir des différences entre les cellules et les cellules tumorales circulantes. Cellules tumorales circulantes eux-mêmes subissent certains changements caractéristiques lorsqu’ils entrent dans la circulation de la tumeur primaire. Néanmoins, les cellules cultivées peuvent former des tumeurs chez des souris immunodéficientes lorsqu’ils sont injectés dans la veine caudale. En outre, dans le système de modèle de souris, fluorescence étiqueté cellules tumorales peut être utilisé qui permettent le suivi de ces cellules dans le corps. Le comportement des cellules tumorales circulantes est critique car ils déterminent les conséquences ultimes du cancer patients10. Sang n’est pas un bon endroit pour la survie des cellules de tumeur2. Ils doivent échapper à l’attaque par le système immunitaire et ont besoin de signaux anti-apoptotiques pour empêcher l’apoptosis en raison du manque de support physique. Des cellules tumorales avec des capacités plus élevées d’initiation tumorale métastatique sites génèrent plusieurs nodules de tumeur. Si les cellules tumorales montrent tropisme d’organe spécifique, métastase doit être observée dans ces organes particuliers. Dans ce test, les premières étapes de la cascade métastatique (croissance de la tumeur primitive et invasion) ne sont pas inclus, et si l’accent est mis sur l’interaction entre la circulation de cellules tumorales et les cellules du stroma (cellules endothéliales, les cellules épithéliales et les cellules du sang). Dans des essais d’injection de cellules de tumeur classiques, les chercheurs doivent attendre que les nodules de tumeur atteignent une taille tangible pour détecter les métastases. Dans ce cas, le nombre exact de cellules tumorales dans les vaisseaux sanguins ne peut être quantifié. En outre, ce processus comporte une phase de repousse de tumeur, ce qui indique que les autres facteurs dans les cellules tumorales peuvent affecter le résultat.
Comptage étiqueté sous un stéréomicroscope de fluorescence des cellules tumorales est un processus simple. Le stéréomicroscope offre un large champ de vision afin que le poumon entier peut être scanné. Cytométrie en flux est également un outil utile qui donne instantanément un nombre précis de cellules tumorales dans les tissus. Compter les cellules fluorescentes dans les tissus sous un microscope confocal est également possible et affiche les photos plus précises des cellules de tumeur métastatique, mais il prend du temps et peut donner des résultats biaisés si seulement une zone sélectionnée est comptabilisée. Le but ultime de ce test est d’observer avec quelle facilité les cellules tumorales s’accumuler dans les poumons. Comme indiqué précédemment,3,4, si les poumons sont en phase métastatique préalable en raison de la signalisation inflammatoires de la tumeur primaire, les cellules tumorales injectées ont tendance à s’accumuler dans les poumons, ce qui implique des chances plus élevées de métastases pulmonaires. Autres conditions (polyarthrite rhumatoïde, l’asthme, etc.) et leur traitement avec des agents anti-inflammatoires (par exemple les anti-TNFα) peuvent atténuer les métastases pulmonaires. Par conséquent, nous concluons que ce test est un outil puissant pour évaluer la possibilité de métastases pulmonaires.
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Protocol
Toutes les procédures effectuées sur des souris ont été approuvées par Medical University de l’Animal Research Committee of Tokyo Women.
1. queue Injection dans la veine des cellules de poumon de Lewis carcinome (LLC)
- Maintenir les cellules LLC en DMEM additionné de 10 % FCS, dans un humidifié 5 % CO2 incubateur à 37 ° C. Cellules doivent contenir un système d’expression de protéine fluorescente (p. ex., GFP).
- Éliminer les cellules de la boîte de pétri en utilisant un réactif de dissociation cellulaire non enzymatiques. Suivre le protocole du fabricant.
- Prélever des cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger à x 400 g pour 3 min. remettre en suspension les cellules dans 5 mL de PBS de pipetage et centrifuger le tube (400 x g, 3 min). Ensuite, retirez le surnageant.
- Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
- Après le deuxième lavage, passez les cellules à travers un tamis de cellule (taille de pore de 40 µm) et remettre en suspension dans du PBS pour donner une densité finale de 1 x 106 cellules/mL.
- Injecter 0,1 mL de suspension cellulaire (1 x 105 cellules, aiguille de 29 G) dans chaque souris C57BL/6 (garçons de 8-10 semaines vieux) via la veine caudale.
2. isolement des poumons et de compter les cellules sous un stéréomicroscope de Fluorescence
- Euthanasier les souris par inhalation de CO2 .
- Enlever la peau sur la surface ventrale de la poitrine avec des ciseaux. Ensuite, couper les côtes et le diaphragme pour exposer la cavité thoracique. Rincer les PBS (100 cmH2O, total 15 mL) à travers le ventricule droit avec une aiguille 25 G de perfusion à ailes et les tubulures.
- Découpez le cœur et le thymus. Saisir la trachée avec une pince et tirer vers le haut, les tissus conjonctifs autour de trachée de dissection aux ciseaux. Disséquer les poumons et les laver dans du PBS.
- Détacher chaque lobe et observez-la sous un stéréomicroscope de fluorescence.
3. poumon Digestion
- Dissoudre 10 mg de collagénase, 10 mg d’a et 10 µg de DNase dans 10 mL de DMEM sans sérum. Filtrer sur un filtre de seringue de 0,22 µm pour préparer la solution de digestion enzymatique.
- Dés le lobe caudal isolé avec des ciseaux. Placer les morceaux de poumon dans une seringue de 10 mL, suivie par le piston.
- Aspirer la solution de digestion (5 mL) dans la seringue en tirant sur le piston. Fonctionner le piston monte et descend jusqu'à ce que le poumon s’enfonce dans la solution. Ensuite, placez le tampon de poumon et de la digestion dans un tube de 50 mL.
- Agiter le tube pendant 15 min à 37 ° C dans un agitateur réciproque (150 tr/min). Poumons peuvent devenir lambeaux pendant l’incubation.
- Pipette de haut en bas jusqu'à ce que les cellules pulmonaires sont complètement dispersées. Agiter le tube supplémentaire 30 min à 37 ° C dans un agitateur réciproque (150 tr/min).
- Passer les cellules pulmonaires à travers un tamis de cellule 40 µm. Tournez en bas les cellules à 400 g pendant 3 min.
4. cytométrie de cellules pulmonaires
- Dissoudre 100 mg de BSA dans 10 mL de PBS et filtre par un filtre de seringue 0,22 µm pour préparer les PBS - 1 % de BSA.
- Retirez le surnageant de l’échantillon obtenu à l’étape 3.6 à l’aide d’une pipette et ajouter 2 mL de solution de lyse des globules rouges. Puis, centrifuger les cellules à 400 g pendant 3 min. éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de PBS - 1 % de BSA en pipettant également et centrifuger le tube (400 x g, 3 min). Jeter le surnageant.
- Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
- Suspendre les cellules dans 1 mL de PBS - 1 % de BSA et passer à travers un nouveau tamis cellulaire de 40 µm.
- Analyser les cellules avec un cytomètre en flux pour compter les cellules tumorales (à l’aide de la configuration du filtre FL1 pour GFP-LLC).
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Representative Results
Les poumons présentent plusieurs cellules de GFP-LLC 2 h après l’injection (Figure 1 a). Il est à noter que les taches fluorescentes également détectés dans le filtre rouge devraient être exclus du nombre nombre d’éléments. La grande majorité des cellules LLC disparaître des poumons 24 h après l’injection (Figure 1).
Pour confirmer le nombre de la GFP-SARL dans les poumons, un des lobes peut être utilisé pour l’analyse en cytométrie en flux (Figure 2).
Figure 1 : Détection de GFP-LLC de cellules au microscope stéréo fluorescence. (A) les poumons sont isolé 2 h (A: filtre GFPLP filtre B: serti, ET/CY3) ou 24h (C: filtre GFPLP filtre D: serti, ET/CY3) après l’injection de cellules4 GFP-LLC de 3 x 10. (C), une cellule de GFP-LLC est marquée par une flèche jaune. Les points marqués par des flèches bleues ne sont pas des cellules de GFP-LLC. Barre d’échelle indique 750 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse d’écoulement cytometry de cellules pulmonaires. (A) et (B) ; Cytométrie de cellules de GFP-LLC utilisée pour l’injection dans la veine queue. D’exclure les cellules mortes, le tampon de suspension cellulaire contenues l’iodure de propidium (1 µg/mL). (A) montre le FSC vs parcelles de la SSC et des cellules dans la région de (C) sont développés en (B) pour montrer FL1 vs FL3 intrigue. Cellules dans la région (D) sont considérées comme des cellules de GFP-LLC. (E) et (F) ; Parcelles de dot de lobe caudales cellules isolées 24 h après l’injection dans la veine queue. Les cellules de GFP-LLC sont observées dans la région (D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Prétraitement des souris avec des anticorps, de drogues, une alimentation riche en graisses ou milieu conditionné par tumeur avant l’injection de cellules tumorales est possible. L’étape la plus difficile dans cet essai est l’injection dans la veine queue. Injection incomplète se traduit par des données non concluantes. La veine caudale C57BL/6 est particulièrement difficile à identifier, résultant en des injections a échoué. Placer les souris sur un coussin chauffant (37 ° C) aide à dilate la veine caudale afin que l’injection devient plus facile.
Ce test utilise une grandes cellules tumorales numéro (1 x 104 - 1 x 10,5), qui est beaucoup plus grande que celle observée dans le sang de patients. Une seule injection d’un grand nombre des cellules peut susciter des réactions indésirables chez l’hôte. Dans le stéréo fluorecence comptage, profondément à l’intérieur des cellules tumorales, les tissus sont difficiles à détecter. Dans l’analyse en cytométrie en flux, les poumons sont complètement digérés pour compter les cellules de tumeur dans les poumons. Ce processus entraîne une perte d’informations précieuses sur l’emplacement de cellule de tumeur (à l’intérieur ou à l’extérieur du vaisseau sanguin). Au contraire, la détection des cellules tumorales sous un microscope confocal fluorescence permet la tumeur distinctive des cellules dans le vaisseau sanguin des autres10.
La microscopie en fluorescence stéréo est une méthode très simple. Utilisant l’écoulement cytometry pour compter les cellules tumorales n’a aucun biais par rapport au microscope à balayage. Il est possible de numériser des sections de l’ensemble du poumon sous un microscope confocal fluorescence ; Toutefois, le dosage sera alors laborieux. Autres types de cellules tumorales ou cellules stromales peuvent être mélangés avec les cellules tumorales injectées. Coinjection de cellules de cancer associés à améliore la possibilité de métastases. Le taux de métastases tumorales dépend fortement du type de la cellule tumorale et l’animal utilisé.
Comme mentionné ci-dessus, l’étape la plus critique dans le présent protocole est l’injection dans la veine queue. Un nombre précis de cellules doit être injecté sans fuite, mais est techniquement difficile. Observer attentivement la manipulation par les chercheurs qualifiés peut-être être d’une grande aide.
Une série d’études de modèles de souris ont rapporté que 20 % des cellules tumorales injectées ont subi une extravasation, 3 % d'entre eux ont formé micrométastases, et seulement 0,02 % devenue tangible nodules métastatiques2. En cas d’injection de cellules de GFP-LLC (3 x 104 cellules), les cellules de GFP-LLC de 150-300 ont été détectés par analyse en cytométrie en flux dans le lobe caudal isolé 2 h après l’injection. Le nombre total de GFP-LLC dans les poumons est censé pour être 600-1 200, ce qui indique que 2 à 4 % des cellules injectées sont restés en vie. Ce ratio diminue dans une fonction du temps3,11. On suppose que les autres cellules subissent l’apoptosis en raison de l’absence de support physique ou de la nutrition, ou en raison de l’exclusion par le système immunitaire. Dans nos données récentes, 24 h après l’injection de GFP-LLC (6 x 104 cellules), le nombre de GFP-LLC dans les poumons s’est avéré pour être environ 20. Ces résultats peuvent être affectés par la souche de souris, cellule tumorale et d’autres facteurs. Par exemple, il a été signalé que le nombre de cellules tumorales dans les poumons a été élevé dans le stade métastatique avant12ou gène modifié souris13,14.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Aucun
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
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