Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Tumor Zelle Ansammlung in der Lunge in einem Tiermodell der Tumor Metastasen.
Abstract
Um die molekularen Mechanismen Tumor Metastasen zu untersuchen, wurden verschiedene Tests mit der Maus als Modell Tier vorgeschlagen. Hier zeigen wir eine einfache Assays Tumor Zelle Extravasation oder Micrometastasis zu bewerten. In diesem Test Tumorzellen durch die Rute Vene injiziert wurden, und nach kurzer Zeit die Lunge wurden seziert und verdaut die angesammelten beschrifteten Tumorzellen zu zählen. Dieser Assay überspringt den ersten Schritt der primäre Tumorinvasion in das Blutgefäß und erleichtert die Untersuchung der Ereignisse in der entfernten Organ wo Tumor Metastasen auftreten. Die Anzahl der Zellen in das Blutgefäß injiziert kann optimiert werden, um eine begrenzte Anzahl von Metastasen zu beobachten. Es wurde berichtet, dass Stromazellen Zellen in den entfernten Organ zur Metastasierung beitragen. So könnte dieser Assay ein nützliches Werkzeug, um mögliche therapeutische Medikamente oder Geräte für die Prävention von Tumor Metastasen zu erkunden.
Introduction
Tumor Metastasen entfallen hohe Mortalität bei Krebs-Erkrankungen. Aus der Sicht der Untersuchungen auf molekularer Ebene, kann Metastasen in mehrere Schritte unterteilt werden: Tumorentstehung am Standort der Primärtumor, Primärtumor Wachstum und Invasion in das umgebende Gewebe, Intravasation, Zirkulation durch die Blutgefäße , Extravasation auf entfernte Organe und Tumor nachwachsen. Jeder Schritt umfasst unterschiedliche Moleküle/Signale1.
Bisherigen Studien haben besorgt, mit der Ereignisse, die in entfernten Organen vor die Tumorzellen im Blut, die auch bekannt als die bereits metastasierendem Phase2,3,4,5, 6. Unsere Maus Modellstudien gezeigt, dass die bereits metastasierendem Phase Lungenkrebs Metastasen erleichtert durch lang andauernde und Low-Level-Entzündungsreaktionen in der Lunge zu schaffen. Die bereits metastasierendem Phase zeichnet sich durch Hyperpermeability von Themicrovasculature, Rekrutierung von abgeleitet Knochenmarkzellen (BMDC) und Hochregulation der Zytokin/Chemokin-ähnliche Moleküle, einschließlich S100A8 und SAA33,4 . Es wurde berichtet, dass die Lysyl-Oxidase modifiziert die extrazelluläre Matrix in der Lunge, BMDCs7zu rekrutieren. Ein weiterer Bericht hat die Bedeutung von Angpt2, MMP3 und MMP10 in der Pre-metastasiertem Phase8ergeben. Das heißt, die komplizierten Wechselwirkungen zwischen Primärtumoren, dem Knochenmark und entfernte Organe müssen verstanden und richtig (z. B. durch Drogen, die auf Proteinen, die in diesen Interaktionen) moduliert werden um zu verhindern, dass künftige Metastasen9 . Um die bereits metastasierendem Phase zu regulieren, sollte es zunächst visualisiert und ausgewertet für diagnostische oder therapeutische Interventionen. Hier berichten wir über eine Lunge Tumor Zelle Rekrutierung Assay, der die Studie bereits metastasierendem Phase in der Lunge ermöglicht.
Zirkulierende Tumorzellen bei Krebspatienten, obwohl es möglicherweise Unterschiede zwischen kultivierten Zellen und zirkulierenden Tumorzellen ähneln Tumorzellen direkt in das Blutgefäß der Maus injiziert. Zirkulierenden Tumorzellen unterziehen sich einige charakteristischen Veränderungen, wenn sie aus dem primären Tumor in Umlauf. Dennoch können kultivierte Zellen Tumore in immungeschwächte Mäuse bilden, wenn sie in die Rute Vene injiziert werden. Darüber hinaus kann im Maus-Modell-System Fluoreszenz beschriftet Tumorzellen verwendet werden, die Verfolgung dieser Zellen im Körper zu ermöglichen. Das Verhalten der zirkulierenden Tumorzellen ist wichtig, da sie die letzten Konsequenzen in Krebs Patienten10bestimmen. Blut ist kein guter Ort für das Überleben von Tumor-Zellen-2. Sie müssen vor Angriffen durch das Immunsystem des Wirts zu entkommen und brauchen Anti-Apoptotic Signale Apoptose aufgrund mangelnder körperlicher Unterstützung zu verhindern. Tumorzellen mit höheren Fähigkeiten der Tumorentstehung bei metastasiertem Websites generieren mehr Tumor Knötchen. Wenn die Tumorzellen spezifisches Organ Tropismus zeigen, Metastasen in den einzelnen Organen zu beachten. In diesem Test die ersten Schritte der metastatischen Kaskade (Primärtumor Wachstum und Invasion) sind nicht im Preis inbegriffen, und so im Mittelpunkt steht das Zusammenspiel von zirkulierenden Tumorzellen und die stromale Zellen (Endothelzellen, Epithelzellen und Blutzellen). In herkömmlichen Tumor Zelle Injektion Assays haben Forscher warten, bis der Tumor Knötchen wachsen auf eine konkrete Größe der Metastasen zu erkennen. In diesem Fall werden nicht die genaue Anzahl der Tumorzellen in den Blutgefäßen quantifiziert. Darüber hinaus enthält dieses Prozesses eine Tumor Regrowth Phase, darauf hinweist, dass andere Faktoren in den Tumorzellen das Ergebnis beeinflussen können.
Zählen ist beschriftet Tumorzellen unter eine Fluoreszenz Stereomikroskop ein einfacher Prozess. Das Stereomikroskop bietet ein breites Sichtfeld, so dass die ganze Lunge gescannt werden kann. Durchflusszytometrie ist auch ein nützliches Tool, das sofort eine genaue Anzahl von Tumorzellen in das Gewebe gibt. Ist auch möglich und zeigt die genauesten Bilder von metastatischen Tumorzellen zählen fluoreszierende Zellen in das Gewebe unter einem confocal Mikroskop, aber es ist zeitaufwändig und verzerrte Ergebnisse geben kann, wenn nur ein ausgewählter Bereich gezählt wird. Das Endziel dieser Assay ist zu beobachten, wie leicht die Tumor-Zellen in der Lunge ansammeln. Wie bereits berichtet3,4, wenn die Lunge durch entzündliche Signalisierung aus dem primären Tumor bereits Metastasen phasengleich sind, neigen die injizierten Tumorzellen in die Lunge, so impliziert höhere Chancen auf Lungenkrebs Metastasen ansammeln. Andere Bedingungen (rheumatoide Arthritis, Asthma, etc.) und deren Behandlung mit entzündungshemmenden Mitteln (z. B. Anti-TNF) kann Lungenkrebs Metastasen dämpfen. So schließen wir, dass dieser Test ein mächtiges Werkzeug ist um die Möglichkeit der Lunge Metastasen zu bewerten.
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Protocol
Alle Verfahren, die mit Mäusen durchgeführt wurden durch das Tier Forschung Ausschuß von Tokyo Medical Frauenuniversität genehmigt.
1. Rute Vene Injektion von Lewis Lungenzellen Karzinom (LLC)
- Pflegen LLC Zellen in DMEM mit 10 % FCS, in einer befeuchteten 5 % ergänzt CO2 Inkubator bei 37 ° C. Zellen sollten ein fluoreszierendes Protein Expressionssystems (z. B. GFP) enthalten.
- Entfernen Sie Zellen von Kulturschale mithilfe eines nicht-enzymatische Zelle Dissoziation Reagenzes. Protokoll des Herstellers zu folgen.
- Sammeln Sie Zellen in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 400 X g, für 3 min. Aufschwemmen der Zellen in 5 mL PBS durch pipettieren und Zentrifugieren die Röhre (400 X g, 3 min). Entfernen Sie dann den überstand.
- Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.
- Nach der zweiten Wäsche eine Zelle Sieb (40 µm Porengröße) die Zellen durchlaufen, und Aufschwemmen in PBS, eine endgültige Zelldichte von 1 x 106 Zellen/mL zu geben.
- Injizieren Sie 0,1 mL Zellsuspension (1 x 105 Zellen, 29 G-Nadel) in jeder C57BL/6-Maus (8-10 Wochen alte Männer) über die Rute Vene.
2. Isolierung der Lunge und zählen die Zellen unter einem Fluoreszenz Stereomikroskop
- Die Mäuse durch CO2 Inhalation einschläfern.
- Entfernen Sie die Haut auf der ventralen Oberfläche der Brust mit einer Schere. Dann schneiden Sie die Rippen und das Zwerchfell, der Brusthöhle verfügbar zu machen. Spülen Sie PBS (100 CmH2O, insgesamt 15 mL) durch die rechte Herzkammer mit einer geflügelten Infusion 25 G Nadel und Schläuche.
- Schneiden Sie das Herz und die Thymusdrüse. Greifen Sie die Luftröhre mit einer Pinzette und hochziehen Sie, sezieren das Bindegewebe um die Luftröhre mit einer Schere. Aus der Lunge sezieren und waschen mit PBS-Puffer.
- Jeder Lappen zu trennen und unter einem Stereomikroskop Fluoreszenz beobachten.
(3) Lunge Verdauung
- 10 mg Kollagenase, 10 mg Dispase und 10 µg der DNase in 10 mL serumfreien DMEM auflösen. Filtern Sie durch einen 0,22 µm Spritze Filter, die enzymatische Verdauung Lösung vorzubereiten.
- Würfel des isolierten kaudalen Lappens mit einer Schere. Legen Sie die Lunge Stücke in einer 10 mL Spritze, gefolgt von den Kolben.
- Aspirieren Sie die Verdauung-Lösung (5 mL) in die Spritze durch den Kolben zurückziehen. Betreiben Sie den Kolben rauf und runter, bis die Lösung die Lunge versinkt. Legen Sie dann die Lunge und Verdauung-Puffer in einem 50 mL-Tube.
- Schütteln Sie das Rohr für 15 min bei 37 ° C auf einem gegenseitigen Shaker (150 u/min). Lungen können während diese Inkubation zerrissen werden.
- Pipette rauf und runter bis Lungenzellen vollständig aufgelöst sind. Schütteln Sie das Rohr für zusätzliche 30 min bei 37 ° C auf einem gegenseitigen Shaker (150 u/min).
- Ein 40 µm Zelle Sieb durchlaufen Sie die Lungenzellen. Spin-down der Zellen bei 400 X g für 3 min.
4. Durchflusszytometrie der Lungenzellen
- Lösen Sie 100 mg der BSA in 10 mL PBS und Filter durch einen 0,22 µm Spritze Filter, PBS - 1 % BSA vorzubereiten.
- Entfernen Sie überstand von der Probe bei Schritt 3.6 mit einer Pipette und 2 mL der roten Blutzelle Lysis Lösung. Dann verwerfen Spin-down der Zellen bei 400 X g für 3 min. Überstands.
- Aufschwemmen der Zellen in 5 mL PBS - 1 % BSA durch pipettieren und Zentrifugieren der Röhre (400 X g, 3 min). Verwerfen Sie den überstand.
- Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.
- Zellen in 1 mL PBS - 1 % BSA auszusetzen und eine neue 40 µm Zelle Sieb passieren.
- Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer Tumorzellen (mit Filtereinstellungen FL1 für GLP-LLC) zählen.
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Representative Results
Die Lungen präsentieren viele GFP-LLC Zellen 2 h nach der Injektion (Abbildung 1A). Es sei darauf hingewiesen, dass die fluoreszierende Punkte auch in den roten Filter erkannt aus der Nummer Zellenzahl ausgeschlossen werden sollen. Die überwiegende Mehrheit der LLC Zellen verschwinden aus den Lungen 24 h nach der Injektion (Abbildung 1).
Um die Anzahl der GFP-LLC in der Lunge zu bestätigen, kann man der Lappen für durchflusszytometrischen Analyse (Abbildung 2) verwendet werden.
Abbildung 1 : Erkennung von GFP-LLC Zellen unter einem Fluoreszenz Stereomikroskop. (A) Lungen sind isolierte 2 h (A: Filtersatz GFPLP, B: Filtersatz ET/CY3) oder 24 h (Filter C: GFPLP D: Filter eingestellt, ET/CY3) nach Injektion von 3 x 104 GLP-LLC-Zellen. (C) ist eine GLP-LLC-Zelle durch einen gelben Pfeil markiert. Die Flecken durch blaue Pfeile gekennzeichnet sind nicht GLP-LLC-Zellen. Maßstabsleiste zeigt 750 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Flow Cytometry Analyse der Lungenzellen. (A) und (B); Durchflusszytometrischen Analyse der GFP-LLC-Zellen für Heck Vene Injektion verwendet. Auszuschließende abgestorbene Zellen enthielt der Zelle Aussetzung Puffer Propidium Jodid (1 µg/mL). (A) zeigt, dass FSC vs. SSC Handlung und Zellen in der Region von (C) entwickelt werden (B), um FL1 vs. FL3 Handlung zu zeigen. Zellen in der Region (D) gelten als GLP-LLC-Zellen. (E) und (F); Punkt plottet der kaudalen Lappen Zellen isoliert 24 h nach der Rute Vene Injektion. Die GFP-LLC-Zellen werden in der Region (D) beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Vorbehandlung von Mäusen mit Antikörpern, Drogen, eine fettreiche Diät oder Tumor konditioniertes Medium vor der Tumor Zelle Injektion ist möglich. Der schwierigste Schritt in diesem Test ist das Heck Vene einspritzen. Unvollständiger Injektion führt nicht schlüssig Daten. Die Schweif Ader im C57BL/6 ist besonders schwer zu erkennen, was fehlerhafte Injektionen. Platzieren die Mäuse auf ein Heizkissen (37 ° C) erweitern hilft die Rute Vene so dass Injektion einfacher wird.
Dieser Assay verwendet eine große Anzahl (1 x 104 - 1 x 105) Tumorzellen, das ist viel größer als die im Patientenblut beobachtet. Eine einmalige Injektion einer großen Anzahl von Zellen kann unerwünschte Reaktionen aus der Wirtstiere herbeizuführen. In der Stereo-Fluoreszenzmikroskopie zählen, Tumorzellen, die tief im Inneren des Gewebes sind schwer zu erkennen. In Flow-Zytometrie-Analyse sind Lunge vollständig verdaut, um die Tumorzellen in der Lunge zu zählen. Dieser Prozess führt zum Verlust von wertvollen Informationen über Tumor Zellenposition (innerhalb oder außerhalb der Blutgefäße). Im Gegenteil, Nachweis von Tumorzellen unter dem konfokale Fluoreszenzmikroskop ermöglicht die Unterscheidung Tumor der Zellen in den Blutgefäßen von den anderen10.
Stereo-Fluoreszenzmikroskopie ist eine sehr einfache Methode. Mittels Durchflusszytometrie, um die Tumorzellen zu zählen hat keine Vorurteile gegenüber Mikroskop scannen. Es ist möglich, die gesamte Lunge Abschnitte unter dem konfokale Fluoreszenzmikroskop zu scannen; jedoch wird der Test dann mühsam sein. Andere Arten von Tumorzellen oder Stromazellen Zellen können mit der injizierten Tumorzellen gemischt werden. Co-Injektion von Krebs-assoziierte Zellen erhöht die Möglichkeit der Metastasierung. Die Tumor Metastasen Rate hängt stark von der Art der Tumorzellen und das Tier verwendet.
Wie bereits erwähnt, ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll die Rute Vene Injektion. Eine genaue Anzahl von Zellen mit keine Leckage injiziert werden muss, aber ist technisch schwierig. Sorgfältig beobachten das Handling durch qualifizierte Forscher kann eine große Hilfe sein.
Eine Reihe von Studien an Mäusen Modell haben berichtet, dass 20 % der injizierten Tumorzellen unterzog Paravasation, 3 % von ihnen gebildet Fixierungsprotokoll und entwickelte sich nur 0,02 % greifbare metastasiertem Knötchen2. Im Falle von GFP-LLC Zelle Injektion (3 x 10-4 -Zellen) wurden 150-300 GFP-LLC Zellen durch Flow-Zytometrie-Analyse in der kaudalen Lappen isoliert 2 h nach der Injektion festgestellt. Die Gesamtzahl der GFP-LLC in der Lunge wird als angenommen 600-1.200, darauf hinweist, dass ca. 2-4 % der injizierten Zellen lebendig geblieben. Dieses Verhältnis sinkt in einem Zeit-abhängigen Weise3,11. Die anderen Zellen werden vom Immunsystem als Apoptose durch fehlende körperliche Unterstützung oder Ernährung oder durch Ausschluss. In unserer jüngsten Daten 24 h nach der Injektion von GFP-LLC (6 x 104 -Zellen) die Anzahl der GFP-LLC in der Lunge erwies sich etwa 20. Diese Ergebnisse können durch die Maus Belastung, Tumorzellen und andere Faktoren beeinflusst. Beispielsweise wurde berichtet, dass die Zahl der Tumorzellen in der Lunge oder im gen Mäuse13,14 geänderterhöhte in der Pre-metastasiertem Phase12 wurde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
nichts
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
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