Summary
כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.
Abstract
כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים גרורות הגידול, הוצעו מבחני שונים באמצעות העכבר כחיה מודל. . הנה, נדגים וזמינותו פשוט להעריך הגידול תא extravasation או micrometastasis. ב הזה assay, תאים סרטניים הוזרקו דרך הווריד של הזנב, ו לאחר תקופה קצרה, הריאות היו גזור מתעכל לספור את תאי הגידול שכותרתו שהצטברו. Assay זה מדלג על השלב הראשוני של הגידול העיקרי הפלישה לתוך כלי דם ואסטמה ומקילה על המחקר של אירועים באיבר מרוחק שבו מתרחשת גרורות הגידול. ניתן למטב את מספר התאים מוזרק לתוך כלי הדם להתבונן במספר מצומצם של גרורות. בעבר דווח כי סטרומה תאים באיבר מרוחק לתרום גרורות. לפיכך, וזמינותו הזה יכול להיות כלי שימושי כדי לחקור תרופות טיפוליות או התקנים למניעת גרורות הגידול.
Introduction
גרורות הגידול חשבונות עבור תמותה גבוהה במחלות הקשורים לסרטן. מנקודת מבט של חקירות ברמה המולקולרית, גרורות ניתן לחלק מספר השלבים: גידול חניכה הגידול העיקרי באתר, הגידול העיקרי ו הפלישה לתוך סביב רקמות, intravasation, זרימת הדם דרך כלי הדם , extravasation איברים רחוקים, וכן גידול מחדש את הצמיחה. כל שלב כרוך סטים שונים של מולקולות/אותות1.
מחקרים עד כה מעורב עם אירועים המתרחשים באיברים מרוחקים לפני לתאי הגידול במחזור הדם, אשר נקרא גם שלב גרורתי מראש2,3,4,5, 6. המחקרים שלנו דגם העכבר חשף כי שלב גרורתי מראש מקלה על גרורות ריאה על-ידי יצירת תגובות דלקתיות לטווח ארוך, ברמה נמוכה של הריאות. שלב טרום גרורתי מאופיין על-ידי hyperpermeability של themicrovasculature, גיוס של תאים במח העצם נגזר (BMDC), קולטנים upregulation של מולקולות ציטוקין/כימוקין-כמו כולל3,S100A8 ו- SAA34 . בעבר דווח שכי אוקסידאז lysyl משנה של מטריצה חוץ-תאית בריאות לגייס BMDCs7. דוח אחר חשף את החשיבות של Angpt2, MMP3 ו- MMP10 שלב גרורתי מראש8. במילים אחרות, מורכבות האינטראקציות בין גידולים העיקרי, מח עצם, ואיברים מרחוק צריך להיות מובן, מאופנן כראוי (למשל, באמצעות תרופות המיועדות החלבונים המעורבים אינטראקציות אלה) כדי למנוע בעתיד גרורות9 . כדי להסדיר את שלב גרורתי מראש, הוא צריך קודם להיות דמיינו, שחושבה עבור התערבויות אבחון או טיפולית. כאן, אנחנו מדווחים על ריאות הגידול תא גיוס assay המאפשרת הלימוד של שלב טרום גרורות בריאות.
תאים סרטניים מוזרק ישירות כלי הדם של העכבר דומים מחזורי תאים סרטניים חולי סרטן, אם כי ייתכנו הבדלים בין תאים בתרבית ופיזור תאים סרטניים. מחזורי תאים סרטניים עצמם עוברים שינויים אופייניים כאשר הם מזינים את זרימת הדם מן הגידול העיקרי. עם זאת, תאים בתרבית יכולים ליצור את גידולים בעכברים immunodeficient כשהם מוזרקים בווריד הזנב. בנוסף, במערכת מודל העכבר, זריחה עם התווית תאים סרטניים יכולים לשמש לאפשר מעקב של תאים אלה בגוף. ההתנהגות של מחזורי תאים סרטניים חיוני כפי שהם קובעים את ההשלכות האולטימטיבי חולי סרטן10. דם אינו מקום טוב להישרדות של תאי גידול2. הם צריכים לברוח מפני התקפה על ידי המערכת החיסונית מארח וזקוקים אנטי-מוות אותות כדי למנוע אפופטוזיס עקב חוסר תמיכה פיזית. תאים סרטניים עם יכולות גבוהות יותר של הגידול חניכה באתרים גרורתי להפיק יותר גושים סרטניים. אם תאים סרטניים מראים tropism איבר מסוים, גרורות להתייחס באיברים האלה מסוים. זה assay, השלבים הראשונים של המפל גרורתי (הגידול העיקרי ואת הפלישה) אינם כלולים ולאחר אז הדגש הוא על האינטראקציה בין מחזורי תאים סרטניים ותאים סטרומה (תאי אנדותל בתאי אפיתל, תאי דם). בגידול קונבנציונאלי מבחני הזרקת תא, חוקרים צריכים לחכות עד גושים סרטניים לגדול לגודל מוחשי כדי לזהות את גרורות. במקרה זה, המספר המדויק של תאי גידול כלי דם לא ניתן לכמת. בנוסף, תהליך זה כולל הגידול שלב לצמיחה מחודשת, המציין כי גורמים אחרים בתאי הגידול עשוי להשפיע על התוצאה.
ספירת שכותרתו תאים סרטניים תחת stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית היא תהליך פשוט. Stereomicroscope מספק שדה ראייה רחב כך ניתן לסרוק את כל הריאה. Cytometry זרימה הוא גם כלי שימושי שנותן באופן מיידי מספר מדויק של תאים סרטניים ברקמה. ספירת תאים פלורסנט ברקמה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי אפשרי גם ומציג את התמונות המדויקות ביותר של תאים סרטניים גרורתי, אולם היא גוזלת זמן, עלולה להחזיר תוצאות מוטה אם רק אזור שנבחר נספרת. המטרה האולטימטיבית של זה וזמינותו היא לבחון איך בקלות תאים סרטניים להצטבר בתוך הריאות. כפי שדווח בעבר3,4, אם הריאות הן בשלב טרום גרורתי עקב איתות דלקתיות מן הגידול העיקרי, לתאי הגידול מוזרק נוטים להצטבר הריאות, ובכך רומז גבוהה יותר הסיכויים גרורות ריאה. תנאים אחרים (דלקת מפרקים שגרונית, אסטמה, וכו '), והטיפול עם סוכנים אנטי דלקתי (כגון אנטי-TNFα) עשוי להחליש גרורות ריאה. לפיכך, אנו מסיקים כי assay הזה הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את האפשרות של גרורות ריאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שבוצעו עם עכברים אושרו על-ידי האוניברסיטה לרפואה חיה מחקר הוועדה של טוקיו של הנשים.
1. הזנב הזרקה לווריד של לואיס ריאות (LLC) קרצינומה של תאים
- לשמור על LLC בתאים DMEM בתוספת 10% FCS, ב- 5% humidified חממה2 CO ב 37 º C. תאים צריך להכיל מערכת ביטוי חלבון פלואורסצנטי (למשל, ה-GFP).
- להסיר תאים מקערה תרבות באמצעות ריאגנט דיסוציאציה תא הלא-אנזימטי. פעלתי לפי הנהלים של היצרן
- איסוף תאים 15 מ"ל שפופרת, ולאחר צנטריפוגה ב 400 x g עבור 3 מינימלית Resuspend התאים 5 מ של PBS מאת pipetting, centrifuge את הצינור (400 x גרם, 3 דקות). לאחר מכן, הסר את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב זה כביסה עוד פעם אחת.
- לאחר לשטוף את השני, עוברים את התאים דרך מסננת תא (40 µm גודל הנקבוביות), resuspend ב- PBS לתת צפיפות התא האחרון של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
- מזריקים 0.1 מ"ל של השעיה תא (1 x 105 תאים, המחט ג'י 29) לתוך כל עכבר C57BL/6 (שבוע 8-10 גברים) דרך הווריד של הזנב.
2. בידוד של הריאות וספירת תאי תחת Stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית
- המתת חסד העכברים באמצעות אינהלציה2 CO.
- מסירים את העור על פני השטח הגחון של החזה עם מספריים. . תעצור את הצלעות והסרעפת לחשוף את חלל בית החזה. ריקון PBS (100 cmH2O, הכולל 15 מ"ל) דרך החדר הימני עם אינפוזיה המכונף 25 גרם מחטים אבובים.
- לגזור את הלב ואת בלוטת התימוס. אחיזה קנה הנשימה עם מלקחיים, ומשוך למעלה, לנתח את רקמות החיבור סביב קנה הנשימה עם מספריים. שווייץ הריאות ולשטוף אותם ב- PBS.
- ניתוק כל אונה, התבוננו בו תחת stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית.
3. ריאות עיכול
- להמיס 10 מ ג של collagenase, 10 מ ג של dispase ו- µg 10 של DNase ב 10 מ"ל של DMEM ללא סרום. לסנן דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 להכין את הפתרון עיכול אנזימטי.
- הקוביות האונה סימטרית מבודד עם מספריים. מקם את החלקים ריאות מזרק 10 מ ל, ואחריו הבוכנה.
- האחות הפתרון עיכול (5 מ"ל) לתוך המזרק מאת למשוך בחזרה על הבוכנה. הפעל את הבוכנה למעלה ולמטה עד הריאה שוקעת לתוך הפתרון. אז, במקום המאגר ריאות, מערכת העיכול בשפופרת 50 מ.
- לנער את הצינור למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף הדדיים (150 סל ד). הריאות עלול להפוך קרועים ובלויים במהלך הדגירה הזה.
- פיפטה למעלה ולמטה עד ריאות תאים מפוזרים לגמרי. לנער את הצינור למשך 30 דקות נוספות-37 מעלות צלזיוס על מטרף הדדיים (150 סל ד).
- עוברים את תאי הריאה דרך מסננת תא 40 µm. ספין למטה התאים ב g x 400 למשך 3 דקות.
4. לזרום Cytometry של ריאות תאים
- להמיס 100 מ ג של BSA ב 10 מ"ל של PBS ואת מסנן דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 להכין BSA PBS - 1%.
- להסיר את תגובת שיקוע של המדגם שהושג בשלב 3.6 באמצעות פיפטה ולהוסיף 2 מ"ל של פתרון פירוק תאי הדם האדומים. לאחר מכן, ספין למטה התאים ב 400 g x עבור מינימום 3 לבטל את תגובת שיקוע.
- Resuspend התאים 5 מ של PBS - 1% BSA מאת pipetting, centrifuge את הצינור (400 x גרם, 3 דקות). למחוק את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב זה כביסה עוד פעם אחת.
- להשעות תאים 1 מ"ל של PBS - 1% BSA ומעבירים דרך מסננת תא 40 µm חדש.
- לנתח את התאים עם cytometer זרימה לספור תאים סרטניים (באמצעות הגדרת מסנן FL1 עבור ה-GFP-LLC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הריאות מציגים GFP-אינק הרבה תאים 2 h לאחר ההזרקה (איור 1 א'). יצוין, כי המקומות פלורסנט זוהה גם במסנן אדום לא להיות כלולים ספירת מספר. הרוב המכריע של תאים LLC נעלמים מן הריאות 24 שעות לאחר ההזרקה (איור 1C).
כדי לאשר את מספר ה-GFP-LLC בריאות, לאחת האונות יכול לשמש עבור ניתוח תזרים cytometric (איור 2).
איור 1 : זיהוי של GFP-אינק תאים במיקרוסקופ סטריאו קרינה פלואורסצנטית. (א) הריאות מבודד 2 h (ת: מסנן מוגדר GFPLP, ב': מסנן מוגדר ואח/CY3) או 24 שעות (c: מסנן מוגדר GFPLP, d: מסנן מוגדר ואח/CY3) לאחר ההזרקה של 3 x 10 תאים4 GFP-אינק. (C), תא GFP-אינק מסומן על ידי חץ צהוב. המקומות המסומנים על ידי חצים כחולים אינם תאים GFP-אינק. מיקרומטר 750. בקנה מידה בר מציין אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Flow cytometry ניתוח ריאות תאים. (א) ו- (ב); ניתוח cytometric זרימה של התאים GFP-אינק המשמש הזרקת וריד הזנב. כדי לא לכלול תאים מתים המאגר התליה תא הכילה propidium יודיד (1 µg/mL). (א) מראה FSC לעומת האס, והעלילה תאים באזור (ג) מפותחים (ב) כדי להראות FL1 לעומת FL3 עלילה. תאים באזור (D) נחשבים תאים GFP-אינק. (ה) ו- (נ); נקודה חלקות של האונה סימטרית תאים מבודדים 24 שעות לאחר הזריקה וריד הזנב. התאים GFP-LLC הם נצפו באזור (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפול קדם של עכברים עם נוגדנים, תרופות, תזונה עתירת שומן או ממוזגים-גידול בינוני לפני הזרקת תאי הגידול הוא אפשרי. השלב הקשה ביותר זה וזמינותו היא הזריקה וריד הזנב. הזרקת לא שלם תוצאות חד משמעיות נתונים. וריד הזנב ב- C57BL/6 קשה במיוחד לזהות, וכתוצאה מכך זריקות שנכשלו. הנחת העכבר על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס) מסייע להתרחב את הווריד הזנב כך הזרקת הופכת קלה יותר.
Assay זו משתמשת תאים סרטניים מספר (1 x 104 - עונה 1 פרק 105) גדול, שזה הרבה יותר מורכב מזה שנמדדו בדם החולה. זריקה חד פעמית של מספר רב של התאים עשויים להביא של החיות מארח תגובות לא רצויות. קרינה פלואורסצנטית סטריאו מיקרוסקופ ספירה, תאים סרטניים בעומק הרקמה הם שקשה לאתר. בניתוח cytometry זרימה, מתעכלים לחלוטין הריאות כדי לספור את תאי הגידול בתוך הריאות. תהליך זה גורם לאובדן של מידע חיוני על גידול התא מיקום (בתוך או מחוץ כלי הדם). להפך, זיהוי תאים סרטניים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות מאפשר את הגידול הבחנה של תאים בכלי הדם מהאחרים10.
קרינה פלואורסצנטית סטריאו מיקרוסקופ היא שיטה מאוד פשוטה. באמצעות cytometry זרימה כדי לספור את תאי הגידול יש הטייה לעומת המיקרוסקופ סריקה. ניתן לסרוק קטעים הריאה כולה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה; עם זאת, וזמינותו ואז יהיה מפרך. סוגים אחרים של תאים סרטניים או תאי סטרומה עשוי להיות מעורב עם תאים סרטניים מוזרק. שיתוף הזרקה של תאי סרטן הקשורים משפר את האפשרות של גרורות. שיעור גרורות הגידול בכבדות תלוי בסוג התא גידול החיה בשימוש.
כפי שהוזכר לעיל, השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה היא הזריקה וריד הזנב. מספר מדויק של תאים צריך להיות מוזרק עם אין נזילה, אך קשה מבחינה טכנית. התבוננות בקפידה את הטיפול על ידי חוקרים מיומן עשוי להיות לעזר רב.
סדרה של מחקרים דגם העכבר דיווחו כי 20% של תאים סרטניים מוזרק עברה extravasation, 3% מהם נוצר micrometastases, רק 0.02% התפתחה גושים גרורתי מוחשי2. במקרה של הזרקת תא GFP-אינק (3 x 104 תאים), 150-300 GFP-אינק תאים אותרו על ידי ניתוח cytometry זרימה. באונה סימטרית מבודד 2 h לאחר ההזרקה. המספר הכולל של GFP-אינק בריאות ההשעה היא 600-1200, המציין כי 2-4% מכלל התאים מוזרק נותר בחיים. יחס זה מקטין3,11באופן תלוי-זמן. התאים האחרים מנועות במנגנוני בשל חוסר תמיכה פיזית או תזונה, או בשל אי-הכללה על ידי המערכת החיסונית. הנתונים האחרונים שלנו, 24 שעות לאחר ההזרקה של GFP-אינק (6 x 104 תאים), מספר ה-GFP-אינק בריאות נמצאו על 20. תוצאות אלו עשוי להיות מושפע המתח העכבר, גידול תאים וגורמים אחרים. למשל, דווח כי מספר תאים סרטניים בריאות היה מוגבה שלב גרורתי מראש12, או בגן ששינה עכברים13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אף אחד
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
