Summary
이 원고 종양 전이의 동물 모델에서 폐에 종양 세포 축적을 계량 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
종양 전이 경 세 하는 분자 메커니즘을 조사, 다양 한 분석 실험 모델 동물로 마우스를 사용 하 여 제안 되었습니다. 여기, 종양 세포 넘쳐 흐름 또는 micrometastasis를 평가 하기 위해 간단한 분석 결과 보여 줍니다. 이 분석 결과에서 종양 세포 꼬리 정 맥을 통해 주입 했다 고 짧은 기간 후 폐 해 부 되었고 누적된 레이블이 지정 된 종양 세포를 소화. 이 분석 결과 혈관으로 기본 종양의 초기 단계를 건너뛰고 먼 기관 종양 전이 발생 하는 위치에 있는 이벤트의 연구를 촉진 한다. 제한 된 수의 전이 관찰 하는 혈관에 주입 하는 셀의 수를 최적화할 수 있습니다. 그것은 알려졌다 stromal 셀 먼 장기에 전이에 기여. 따라서,이 분석 결과 잠재적인 치료 약물 이나 종양 전이의 방지를 위한 장치를 탐구 하는 유용한 도구 일 수 있었다.
Introduction
종양 전이 암 관련 질병에 높은 사망률을 차지 한다. 분자 수준에서 조사 관점에서 전이 여러 단계로 분할 될 수 있다: 기본 종양 사이트, 기본 종양 성장 및 주변 조직, intravasation, 혈관을 통해 순환으로 침공에 종양 개시 먼 장기에 종양이 다시 성장을 넘쳐 흐름. 각 단계는 분자/신호1의 다른 세트를 포함 한다.
종양 세포는 또한로 알려져 미리 전이성 단계2,3,,45, 혈액에서 회람 시작 전에 먼 장기에 발생 하는 이벤트와 우려는 최신 연구 6. 우리의 마우스 모델 연구 밝혔다 미리 전이성 단계 폐에 지속적인 저수준 염증 반응을 만들어 폐 전이 촉진 한다. 미리 전이성 단계 themicrovasculature의 hyperpermeability, 파생 하는 골 수 세포 (BMDC)의 신규 모집 그리고 S100A8 및 SAA33,4 를 포함 하 여 cytokine/chemokine 같은 분자의 upregulation 특징 이다 . 그것은 그 lysyl 산화 효소 BMDCs7을 폐에서 세포 외 매트릭스 수정 보고 되었습니다. 또 다른 보고서는 미리 전이성 단계8에서 Angpt2, MMP3, 및 MMP10의 중요성을 밝혔다. 즉, 1 차 종양, 골 수, 및 원격 기관 간의 복잡 한 상호 작용 해야 이해 하 고 제대로 (예를 들어, 사용 하 여 이러한 상호 작용에 관련 된 단백질을 대상으로 마약) 변조 미래 전이9 방지 하기 위해 . 미리 전이성 단계 규제를 그것은 해야 먼저 시각화 되며 진단 또는 치료 개입에 대 한 평가. 여기, 우리는 폐 종양 세포 모집 분석 결과 폐에 미리 전이성 위상의 연구를 가능 하 게 보고 합니다.
마우스의 혈관에 직접 주입 하는 종양 세포는 배양된 세포 사이 차이가 있을 수 있지만 암 환자에서 종양 세포를 순환 하 고 순환 종양 세포에 비슷합니다. 순환 종양 세포 스스로 받 다 몇 가지 특성 변경을 기본 종양에서 순환 들어가면. 그럼에도 불구 하 고, 배양된 세포 형성할 수 있다 종양 immunodeficient 쥐에서 꼬리 정 맥에 주사 하는 경우. 또한, 마우스 모델 시스템에서 종양 세포를 분류 하는 형광 사용할 수 있습니다 본문에이 셀의 추적을 허용 하는. 순환 종양 세포의 행동은 암 환자10에 궁극적인 결과 결정할 때 중요 합니다. 혈액 종양 세포2의 생존에 대 한 좋은 곳이 아니다. 그들은 숙주 면역 체계에 의해 공격에서 탈출 필요 실제 지원의 부족 때문에 apoptosis를 방지 하기 위해 안티-apoptotic 신호를 해야 합니다. 종양 세포에서 전이성 종양 개시의 높은 능력을 가진 더 많은 종양 작은 혹을 생성합니다. 종양 세포가 특정 기관 차 있는 굴곡 운동, 보여주면 그 특정 장기에 전이 관찰 해야. 이 분석 결과에서 전이성 캐스케이드 (기본 종양의 성장 및 내 습)의 초기 단계는 포함 하 고 그래서 초점은 순환 종양 세포 및 stromal 세포 (내 피 세포, 상피 세포와 혈액 세포) 사이 상호 작용에. 기존의 종양 세포 주입 분석 실험에서 연구팀은 종양 혹 전이 검출 하는 확실 한 크기에 성장 될 때까지 기다려야 했습니다. 이 경우에 혈관에 종양 세포의 정확한 수는 측정할 수 없는. 또한,이 과정에는 종양 세포에 있는 다른 요소는 결과 영향을 미칠 지 수를 나타내는 종양 자라나 단계를 포함 됩니다.
계산 간단한 과정은 종양 세포에서 형광 stereomicroscope 표시. stereomicroscope 전체 폐 스캔 수 있도록 넓은 시야를 제공 합니다. Cytometry 즉시 조직에서 종양 세포의 정확한 수를 제공 하는 유용한 도구 이기도 합니다. Confocal 현미경 조직에 형광 셀 계산도 가능 하 고 전이성 종양 세포의 가장 정확한 사진을 표시 하지만 시간이 많이 걸리는 이며 선택된 영역을 계산 하는 경우에 치우치는 결과 줄 수 있습니다. 이 분석 결과의 궁극적인 목표는 종양 세포는 폐에 축적 하는 방법을 쉽게 관찰 하는. 보고 이전3,4, 미리 전이성 단계 기본 종양에서 염증 신호 때문에 폐가 하는 경우, 주입 된 종양 세포 폐 전이의 더 높은 기회를 암시 하는 따라서 폐에 축적 하는 경향이 있다. 다른 조건 (류 마티스 관절염, 천식, 등), 및 (안티-TNFα) 같은 항 염증 제 대리인 그들의 치료는 폐 전이 감소 수 있습니다. 따라서, 우리는이 분석 결과 폐 전이의 가능성을 평가 하는 강력한 도구입니다 결론.
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Protocol
마우스를 사용 하 여 수행 하는 모든 절차는 동물 연구 위원회의 도쿄 여자의과 대학에 의해 승인 되었다.
1. 루이스 폐 암 (LLC) 세포의 꼬리 정 맥 주사
- 습도 5%에서 10 %fcs 보충 DMEM LLC 셀 유지 37 ° c.에 CO2 배양 기 세포 형광 단백질 식 시스템 (예를 들어, GFP)를 포함 해야 합니다.
- 비 효소 세포 분리 시 약을 사용 하 여 문화 접시에서 셀을 제거 합니다. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
- 3 분 셀 5 mL의 PBS에 pipetting, 여 Resuspend 그리고 원심 관 (400 x g, 3 분) 15 mL 튜브, 400 x g에서 원심 분리기는 세포를 수집 합니다. 그런 다음에 상쾌한을 제거 합니다.
- 이 세척 단계를 한 번 더 반복 합니다.
- 두 번째 세척 후 셀 스 트레이너 (40 µ m 기 공 크기), 세포를 통과 하 고 1 x 106 셀/mL의 최종 셀 밀도 제공 하는 PBS에 resuspend.
- 꼬리 정 맥을 통해 각 C57BL/6 마우스 (8-10 주 오래 된 남성)에 세포 현 탁 액 (1 x 105 셀, 29 G 바늘)의 0.1 mL를 주사.
2. 폐와 형광 Stereomicroscope 아래 셀 계산의 격리
- CO2 흡입 하 여 쥐를 안락사.
- 가 위는 가슴의 복 부 표면에 피부를 제거 합니다. 그런 다음 갈비뼈와 흉 강 폭로 막 잘라. 날개 달린된 주입 25g 바늘 및 튜브와 우 심 실을 통해 PBS (100 cmH2O, 총 15 mL)를 플러시.
- 마음과 thymus를 잘라. 집게, 함께 기도 올려, 기관지 주위 결합 조직이 위 해 부. 폐 밖으로 dissect 하 고 PBS에 그들을 씻어.
- 각 엽을 분리 하 고 형광 stereomicroscope에서 그것을 관찰.
3. 폐 소화
- 콜라, dispase의 10 밀리 그램 및 혈 청 무료 DMEM의 10 ml에서 DNase의 10 µ g의 10 mg을 디졸브. 효소 소화 솔루션을 준비 하는 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링.
- 가 위 고립 된 꼬리 엽 주사위. 플런저에 의해 다음 10 mL 주사기에 폐 조각을 놓으십시오.
- 플런저에 다시 당겨 주사기로 소화 솔루션 (5 mL)을 발음. 폐는 솔루션에 싱크 될 때까지 플런저를 아래로 작동 합니다. 그런 다음 50 mL 튜브에 폐와 소화 버퍼를 놓습니다.
- 상호 통 (150 rpm)에 37 ° C에서 15 분 동안 튜브를 흔들어. 폐 너덜이 외피 동안에 될 수 있습니다.
- 폐 세포는 완전히 분산 될 때까지 아래로 플라스틱. 상호 통 (150 rpm)에 37 ° C에서 추가 30 분에 대 한 튜브를 흔들어.
- 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 폐 세포를 전달 합니다. 3 분에 대 한 400 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.
4. Cytometry 폐 세포의
- PBS-1 %BSA 준비 하는 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 PBS와 필터의 10 mL에 BSA의 100 밀리 그램을 디졸브.
- 제거 단계는 피 펫을 사용 하 여 3.6에서 얻은 샘플의 상쾌한 하 고 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 솔루션의 2 개 mL를 추가. 다음, 회전에 3 분에 대 한 400 x g 세포 감소는 상쾌한을 삭제 합니다.
- PBS-1 %BSA 5 mL에 셀 pipetting, 여 resuspend 그리고 원심 관 (400 x g, 3 분). 폐기는 상쾌한.
- 이 세척 단계를 한 번 더 반복 합니다.
- 1 ml PBS-1 %BSA 세포를 중단 하 고 새로운 40 µ m 셀 여과기를 통과.
- 교류 cytometer (를 사용 하 여 필터를 설치 FL1 GFP llc) 종양 세포를 가진 세포를 분석 합니다.
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Representative Results
폐 주사 (그림 1A) 후 많은 GFP LLC 셀 2 시간을 제공합니다. 그것은 또한 빨간 필터에 검출 형광 명소 셀 번호 개수에서 제외 되어야 주목 한다. LLC는 세포의 대부분 주사 (그림 1C) 후 폐 24 h에서에서 사라집니다.
폐에 GFP LLC의 번호를 확인 하는 돌출부의 흐름 cytometric 분석 (그림 2)에 대 한 사용할 수 있습니다.
그림 1 : GFP LLC의 탐지는 형광 스테레오 현미경 세포. (A) 폐는 격리 2 h (a: 필터 GFPLP, b: 필터 설정 외/CY3) 또는 24 시간 (c: 필터 GFPLP, d: 필터 설정 외/CY3) 3 x 104 GFP LLC 세포의 주입 후. (C), GFP LLC 셀은 노란색 화살표로 표시 됩니다. 파란색 화살표에 의해 표시 된 관광 명소 GFP LLC 셀 되지 않습니다. 눈금 막대 나타냅니다 750 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 폐 세포의 cytometry 분석 흐름. (A)와 (B); 꼬리 정 맥 주입에 사용 되는 GFP LLC 셀의 흐름 cytometric 분석. 죽은 세포를 제외 하려면 셀 서 스 펜 션 버퍼 propidium 요오드 화물 (1 µ g/mL)을 포함. (A) FSC 대 SSC 음모, 및 (C)의 영역에서 셀은 개발에서 (B) FL1 대 FL3 플롯을 표시 하는 것을 보여줍니다. (D) 영역의 셀 GFP LLC 셀 수 간주 됩니다. (E)와 (F); 점 작 꼬리 엽 세포의 꼬리 정 맥 주사 후 24 h를 격리합니다. GFP LLC 셀 영역 (D)에서 관찰 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
항 체, 약물, 높은 지방 다이어트 또는 종양 세포 주입 전에 종양 조절 중간 마우스의 전처리 가능 하다. 이 분석 결과 가장 어려운 단계가입니다 꼬리 정 맥 주입. 불완전 주입 결정적 데이터에서 발생합니다. C57BL/6에서 꼬리 정 맥은 실패 한 주사에 따른 식별, 특히 어렵습니다. 생리대 (37 ° C)에 쥐를 배치 도움이 되도록 주입 쉽게 꼬리 정 맥 팽창.
이 분석 결과 환자의 혈액에서 관찰 된 것 보다 훨씬 더 큰 큰 숫자 (1 x 104 -1 x 105) 종양 세포를 사용 합니다. 셀 등 다 수의 1 회 주사를 호스트 동물에서 원치 않는 응답에 대 한 가져올 수 있습니다. 형광 스테레오 현미경 검사 법, 종양 세포 깊은 안쪽에서 조직을 탐지 하기 어려운 있습니다. 교류 cytometry 분석, 폐는 폐에 있는 종양 세포를 완전히 소화 된다. 이 프로세스는 종양 세포 위치 (내부 또는 혈관 외부)에 대 한 귀중 한 정보를 발생합니다. 그와 반대로, 탐지는 confocal 형광 현미경 종양 세포의 다른 혈관에서 세포의 구별 종양 수10.
형광 스테레오 현미경 검사 법은 매우 간단한 방법입니다. Cytometry 종양 세포를 사용 하 여 현미경 검사에 비해 아무 편견이 있다. 공초점 형광 현미경; 전체 폐 섹션을 스캔 수 그러나, 분석 결과 다음 힘 드는 것입니다. 다른 종류의 종양 세포 또는 stromal 세포 주입 된 종양 세포와 혼합 수 있습니다. 암 관련 세포의 공동 주사 전이의 가능성을 향상 시킵니다. 종양 전이 속도 무 겁 게 종양 세포와 사용 하는 동물의 종류에 따라 달라 집니다.
위에서 설명 했 듯이,이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 꼬리 정 맥 주입입니다. 셀의 정확한 수 누설 없이 주입 하지만 기술적으로 어렵습니다. 신중 하 게 관찰 하는 숙련 된 연구원에 의해 처리에 큰 도움이 될 수 있습니다.
주입 된 종양 세포의 20% 받았다 넘쳐 흐름, micrometastases, 형성 하는 그들의 3%와 0.02%만 개발로 마우스 모델 연구의 시리즈를 보고 확실 한 전이성 혹2. GFP LLC 세포 주입 (3 x 104 의 세포), 경우 150-300 GFP LLC 셀 꼬리 엽 주입 후 2 h 절연에 교류 cytometry 분석에 의해 감지 되었다. 폐에 GFP LLC의 총 수는 600-1200, 주입 된 세포의 2-4% 살아 남아 나타내는 것으로 간주 됩니다. 시간에 따른 방식으로3,11이 비율 감소합니다. 다른 세포는 면역 체계에 의해 apoptosis 제외 또는 물리적 지원 또는 영양의 부족을 간주 됩니다. 우리의 최근의 데이터, GFP LLC (6 x 104 셀), 주사 후 24 시간에서에서 폐에 GFP LLC의 번호 20에 대 한 발견 되었습니다. 이러한 결과 마우스 스트레인, 종양 세포, 및 다른 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 알려졌다 폐에 종양 세포의 수 미리 전이성 단계12상승 했다 또는 유전자 수정 마우스13,14.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
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